La plupart des traitements anticancéreux, comme la chimiothérapie ou la radiothérapie, sont cytotoxiques et causent des dommages à l'ADN dans le but d’induire la mort des cellules tumorales. Cependant, l’efficacité d’activité de réparation de l'ADN des tumeurs entraine des résistances intrinsèques et acquises aux traitements. L'une des étapes précoces de la réparation de l’ADN est le recrutement de protéines au niveau du site de dommage. Ce recrutement est coordonné par une cascade de modifications et est contrôlé par des protéines senseurs telles que la protéine kinase ADN dépendante (DNA-PK) et / ou la poly (ADP- ribose) polymérase (PARP). Dans ce manuscrit, nous avons identifié et caractérisé le mécanisme d'action de petites molécules d'ADN (les siDNA), mimant des cassures double brin (appelé Dbait) ou simple brin (appelé Pbait), dans l’inhibition des voies de réparation des cassures simple brin (SSBR/BER). Nous démontrons que les molécules Dbait recrutent et activent à la fois PARP et DNA-PK, contrairement aux molécules Pbait qui ne recrutent que la PARP. L'étude comparative de ces deux molécules permet d'analyser les rôles respectifs des deux voies de signalisation: les deux molécules recrutent les protéines impliquées dans la voie de réparation des cassures simple brin (comme PARP, PCNA et XRCC1) et empêchent leurs recrutements aux niveaux des lésions chromosomiques. Les molécules Dbait inhibent par ailleurs le recrutement des protéines impliquées dans la voie de réparation des cassures double brin (NHEJ et HR). Pbait et Dbait désorganisent la réparation de l’ADN et sensibilisent les cellules tumorales aux traitements. L’inhibition de la réparation des cassures simple brin semble dépendre d’un piégeage des protéines directement sur les siDNA ou indirectement sur les polymères PAR. L’inhibition des voies de réparation des cassures double brin (DSB) semble par contre se faire de façon indirecte ; cette inhibition résulterait plutôt de la phosphorylation des protéines de réparation des DSB de part l’activation de DNA-PK. Les molécules Dbait et Pbait induisent un effet de létalité synthétique des cellules tumorales BRCA mutées. Cependant, la mutation BRCA semble être suffisante mais non nécessaire pour induire la sensibilité des cellules tumorales aux traitements Dbait. En effet, nous avons démontré que les molécules Dbait peuvent aussi sensibiliser les cellules ne présentant pas de mutation BRCA mais ayant toutefois une forte instabilité génétique. Nous avons trouvé une corrélation entre le niveau basal de protéines de réparation de l'ADN (ɣH2AX, PARP et PAR), le taux basal de cassures à l’ADN, la présence de micronoyaux (MN) et la sensibilité des cellules tumorales au traitement Dbait. Nous avons émis l’hypothèse que cette instabilité génétique, déterminé par la quantification de MN dans des biopsies tumorales, pourrait être un biomarqueur prédictif de l’effet du Dbait, non seulement dans les cancers du sein, mais aussi dans les glioblastomes, les mélanomes, les mélanomes uvéaux et les cancers du côlon. / Most conventional cancer treatments, such as chemotherapy or radiotherapy, are cytotoxic and cause DNA damages in the tumoral treated cells, which ultimately lead to their death. However, several intrinsic and acquired resistances of tumors to these treatments are due to the tumor efficient DNA repair activities. One of the major early steps of DNA repair is the recruitment of repair proteins at the damage site and this is coordinated by a cascade of modifications controlled by sensor proteins such as DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) and/or poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). In this manuscript, we identify and characterize the mechanism of action of short interfering DNA molecules (siDNA), mimicking double-strand breaks (called Dbait) or single-strand breaks (called Pbait) in Single Strand Break Repair pathway (SSBR/BER) inhibition. We demonstrate that Dbait bound and induced both PARP and DNA-PK activities, whereas Pbait acts only on PARP. The comparative study of the two molecules allows analysis of the respective roles of the two signaling pathways: both molecules recruit proteins involved in single-strand break repair (such as PARP, XRCC1 and PCNA) and prevent their recruitment at chromosomal damage. Dbait, but not Pbait, also inhibits recruitment of proteins involved in double-strand break (DSB) repair. By these ways, Pbait and Dbait disorganized DNA repair, thereby sensitizing cells to treatments. SSB repair inhibition depends upon a direct trapping of the main proteins on both molecules and an indirect trapping in PAR polymers. DSB repair inhibition may be indirect, resulting from the phosphorylation of DSB repair proteins by activated DNA-PK. The DNA repair inhibition by both molecules is confirmed by their synthetic lethality with BRCA mutations tumoral cell lines. However, BRCA mutation could be sufficient but not necessary to induce breast cancer cell lines and tumors sensitivity to Dbait treatment. In fact, we demonstrate that Dbait molecules could also have a stand-alone effect in BRCA wild type cells with a high genetic instability. We found a correlation between DNA repair proteins basal level (ɣH2AX, PARP and PAR), DNA break basal level, presence of micronucleus (MN) and tumoral cell lines sensitivity to Dbait treatment. We hypothesis that this genetic instability, determined by MN in tumor biopsies, could be a predictive biomarker of Dbait stand-alone effect, not only in breast cancer treatment, but also in glioblastoma, melanoma, uveal melanoma and colon cancer treatment.

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La défense pré-invasive ou stomatique est un mécanisme qui consiste en la fermeture des pores stomatiques présents sur les organes aériens des plantes lorsque celles-ci sont en contact avec certains agents pathogènes. Cette fermeture empêche ces derniers de pénétrer dans l’hôte et de le coloniser. Ce mécanisme s’active chez Arabidopsis inoculée par la bactérie Pseudomonas syringae pv tomato (Pst) DC3000. Des travaux préliminaires de notre groupe avaient montré que la carbonylation de protéines cibles par des espèces réactives électrophiles (EREs) représentait une étape cruciale de la signalisation cellulaire nécessaire à la mise en place de cette défense. Par des approches de marquage ciblé et de purifications couplées à des identifications par spectrométrie de masse en tandem (nanoLC-MS/MS), nous avons pu caractériser une sérine-thréonine protéine kinase qui joue un rôle déterminant dans ce mécanisme de défense. En effet, des plantes mutées sur le gène codant cette protéine ont perdu la capacité à induire la fermeture de leurs stomates et à déployer la défense stomatique vis-à-vis de la bactérie. De plus, l’introduction de la chimie click (cycloaddition alcyne-azide catalysée par le cuivre), dans nos approches de marquage, nous a permis d’identifier un ensemble de protéines très probablement carbonylées et susceptibles de jouer un rôle crucial dans ces évènements cellulaires qui contribuent à une part de l’immunité végétale. Enfin, les EREs étant capables d’induire la fermeture des stomates, nous avons cherché à savoir, dans le cadre de l’établissement d’une preuve de concept, si leur application sur des plantes permettrait la protection de ces dernières contre Pst. / Pre-invasive or stomatal defense is a mechanism which consists of closing the stomata present at surface of aerial organs of plants when they are in contact with certain pathogens. This closure prevents them from entering and colonizing the host. This mechanism is activated in Arabidopsis inoculated by the bacterium Pseudomonas syringae pv tomato (Pst) DC3000. Preliminary work by our group had shown that carbonylation of target proteins by reactive electrophile species (RES) was a crucial step of the cell signaling required to set up this defense. Through targeted tagging and purifications approaches coupled with tandem mass spectrometry identifications (nanoLC-MS/MS), we have been able to characterize a serine-threonine protein kinase that plays a crucial role in this defense mechanism. Indeed, plants mutated on the gene encoding this protein have lost their ability to trigger stomatal closure and to deploy the stomatal defense against the bacteria. In addition, the use of the click chemistry and notably, the copper-catalyzed alkyne-azide cycloaddition, in our tagging approaches has enabled us to identify a set of proteins that are most likely carbonylated and likely to play a significant role in these cell events that contribute to part of plant immunity. Finally, since RES are able to induce stomatal closure we sought to find out, in the context of establishing a proof-of-concept, whether their application to plants would enable them to be protected against the Pst.

Bacillus subtilis est la bactérie modèle des bactéries Gram-positif à bas pourcentage en GC et possède un intérêt marqué en biotechnologie. Par ailleurs, la phosphorylation des protéines est un mécanisme de régulation essentiel chez les bactéries qui reste encore largement à explorer. B. subtilis possède plusieurs ser/thr kinases potentielles (PrkA, YbdM, YabT et PrkC, qui a été déjà largement caractérisée), mais très peu de substrats de ces kinases ont été mis en évidence. Récemment, des études phosphoprotéomiques ont permis d’identifier de nombreux peptides phosphorylés sur des sérines ou des thréonines chez B. subtilis, incluant: a) deux régulateurs globaux de la phase de transition, DegS et AbrB et b) RecA, qui joue un rôle essentiel dans la réparation des cassures double-brin de l’ADN et la recombinaison. Des tests de phosphorylation in vitro nous ont permis d’identifier les ser/thr kinases capables de phosphoryler DegS, RecA et AbrB. La phosphorylation de DegS sur son résidu sérine 76 par la kinase YbdM influence, in vitro et in vivo, son activité kinase vis à vis de son substrat DegU. L’expression chez B. subtilis d’un allèle codant la protéine DegS-S76D (la sérine étant remplacée par un aspartate phosphomimétique) perturbe l’ensemble des processi cellulaires régulés par le système à deux composants DegS/DegU. Ces résultats suggèrent un lien entre la phosphorylation de DegS sur sa sérine 78 et le niveau de phosphorylation de son substrat DegU, cette modification post-traductionnelle représentant un degré supplémentaire de régulation pour ce système à deux composants. Au cours du démarrage de la sporulation, B. subtilis exprime une ser/thr kinase atypique, YabT, qui localise au septum et est activée grâce à la liaison de séquences ADN non spécifiques. YabT activée phosphoryle RecA sur sa sérine 2, ce qui induit la formation de foci RecA. Dans une souche exprimant une protéine RecA non phosphorylable (RecA-S2A) ou inactivée pour yabT, la formation de spores en présence de lésions de l’ADN est diminuée. Ces résultats suggèrent une homologie fonctionnelle au cours du développement entre la phosphorylation de RecA chez B. subtilis et la phosphorylation de son homologue eukaryote Rad51, qui permet leur recrutement sur des lésions de l’ADN. Nous proposons donc que la phosphorylation de RecA serve de signal pour promouvoir la formation de foci au cours de la sporulation. In vitro, le régulateur transcriptionnel AbrB est phosphorylé par les kinases YabT, YbdM et PrkC, L’utilisation de protéines mutées AbrB-S86A (non phosphorylable) et AbrB-S86D (forme phosphomimétique) nous a permis de montrer que la phosphorylation d’AbrB diminue son affinité pour l’ADN cible. L’expression chez B. subtilis des protéines AbrB-S86A et –S86D perturbe des phénomènes mis en place au cours de la phase stationnaire comme la production d’exoprotéases, la compétence et la sporulation via la dérégulation des gènes et opérons AbrB-dépendants correspondants. Nous proposons donc que la phosphorylation d’AbrB par les Hanks-kinases constitue un mécanisme de contrôle supplémentaire nécessaire à l’inactivation de ce régulateur transcriptionnel, qui peut être activateur ou répresseur, pendant la phase de transition. / Bacillus subtilis is the model organism for low GC Gram-positive bacteria and is of great biotechnological interest. Protein phosphorylation is an important regulatory mechanism in bacteria and it has not been extensively studied yet. Recent site-specific phosphoproteomic studies identified a large number of novel serine/threonine phosphorylation sites in B. subtilis, including a) two transition phase global gene regulators DegS and AbrB and b) RecA, that plays a major role in double-strand break repair and DNA recombination. .B. subtilis disposes of several putative Ser/Thr kinases like PrkA, YbdM, YabT and a characterizd kinase PrkC, but very few physiological substrates for these have been defined so far. In vitro phosphorylation assays were used to identify which of these kinases were able to phosphorylate DegS, RecA and AbrB. DegS phosphorylation on serine 76 by the kinase YbdM influenced its activity towards DegU both in vitro and in vivo, and expression of DegS S76D( on replacing serine to aspartate) in B. subtilis perturbed cellular processes regulated by the DegS/DegU two component system. This suggests a link between DegS phosphorylation at serine 76 and the level of DegU phosphorylation, establishing this post-translational modification as an additional trigger for this two-component system. At the onset of sporulation, B. subtilis expresses an unusual serine/threonine kinase YabT, which exhibits a septal localization and is activated by non-sequence-specific DNA binding. Activated YabT phosphorylates RecA at the residue serine 2, which in turn promotes the formation of RecA foci at the onset of spore development. On the other hand, non-phosphorylatable RecA or inactivated YabT lead to reduced spore formation in the presence of DNA lesions . This suggests a functional similarity between B. subtilis developmental stage dependent RecA phosphorylation and its eukaryal homologous Rad51 phosphorylation, which leads to its recruitment to the lesion sites. We therefore proposed that RecA phosphorylation serves as an additional signal mechanism that promotes focus formation during spore development. AbrB is phosphorylated by YabT, YbdM and PrkC in vitro and AbrB phosphorylation leads to reduced affinity for its target DNA and abolished binding cooperativity in vitro and in vivo. Expression of the phosphomimetic AbrB-S86D or of the non-phosphorylatable AbrB-S86A mutant protein in B. subtilis disturbed some stationary phase phenomena such as exoprotease production, competence and the onset of sporulation, probably by deregulation of AbrB-target genes and operons. We therefore, proposed that AbrB phosphorylation as an additional regulatory mechanism needed to switch off this ambiactive gene regulator during the transition phase.

La protéine kinase DYRK1A fait partie du groupe des CMGC kinases et est impliquée dans divers processus neurodégénératifs tels que la maladie d’Alzheimer.Dans ce cadre, une étude topologique a été menée autour d’un hit imidazo[1,2-B]pyridazine identifié par un criblage biologique. Ce composé a servi à concevoir des inhibiteurs ATP-Compétitifs de DYRK1A par l’utilisation de méthodes métallo-Catalysées (Pd, Cu) pour introduire divers fragments fonctionnalisés.Sur les soixante dérivés imidazo[1,2-X]azine synthétisés, sept composés ont montré une affinité nanomolaire pour DYRK1A (IC50 = 41-130 nM). En parallèle de ce travail de pharmacochimie, le développement de nouvelles méthodologies de synthèse a visé à la polysubstitution régiosélective du cycle pyridazine.En dernier lieu, nous avons donné les éléments et concepts permettant la construction de chimiothèques virtuelles dérivées de pyridazines et destinées à être criblées in silico. / DYRK1A protein kinase belongs to the CMGC group and is involved in neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease.In this context we examined an imidazo[1,2-B]pyridazine hit identified by biological screening, through detailed structure-Activity relationship studies. This compound was used to synthesize DYRK1A ATP-Competitive inhibitors by using metallo-Catalyzed methodologies (Pd, Cu) in order to introduce various functionalized moieties.Out of the 60 derivatives synthesized, 7 compounds showed nanomolar activities (IC50 = 41-130 nM).Beside this work of medicinal chemistry, new synthetic methodologies has been developed to regioselectively access polysubstituted pyridazine derivatives. Finally, we developed data and concepts to establish virtual pyridazine libraries for in silico screening.

La phosphorylation des protéines par les kinases est l’une plus importantes modification post-traductionnelle dans les processus cellulaires tels que la division, la différenciation, la prolifération et l’apoptose. Due à leur rôle clef, un dérèglement des protéines kinases peut entrainer de nombreuses pathologies proliférative telles que le cancer et non prolifératives telles que les maladies neurodégénératives. Le travail de thèse s’est construit autour de 2 séries d’inhibiteurs de protéine kinases comportant les noyaux imidazo[1,2-b]pyridazine et imidazo[4,5-b]pyridine. L’objectif est d’inhiber sélectivement les protéines kinases choisies, pour leurs implications dans les pathologies visées au laboratoire. Les imidazo[1,2-b]pyridazines ont été préparées pour identifier des inhibiteurs de CLK1 et DYRK1A, cibles potentielles dans la maladie d’Alzheimer. Parmi les imidazo[1,2-b]pyridazines synthétisées, plusieurs molécules se sont révélées particulièrement sélectives de DYRKs et CLKs, avec des IC50 < 100 nM. Une relation structure-activité basée sur la synthèse de 70 molécules, a permis de dégager des éléments structuraux de la sélectivité des molécules. L’évaluation des produits a également été portée sur les kinases de parasites. Il a ainsi été possible d’identifier quelques inhibiteurs actifs sur PfCLK1. La seconde partie de cette thèse avait pour objectif l’optimisation du protocole de synthèse imidazo[4,5-b]pyridines, analogue de la roscovitine. Des dérivés s’étaient révélés capables d’inhiber la formation de kystes, dans un modèle cellulaire de polykystose rénale. Une synthèse en sept étapes a conduit à plusieurs grammes d’imidazo[4,5-b]pyridine 3,5,7 trisubstitués, qui sont ainsi disponibles pour l’évaluation in vivo. / Phosphorylation by protein kinases is one of the most important post-translational modification in cellular processes such as division, differentiation, proliferation and apoptosis. Kinase deregulation is associated with numerous diseases such as cancer or neurodegenerative diseases. Imidazo[1,2-b]pyridazine and imidazo[4,5-b]pyridine were prepared to inhibit protein kinases involved in diseases targeted in the laboratory. The imidazo[1,2-b]pyridazines were synthesized to identify inhibitors of CLK1 and DYRK1A, potential targets in Alzheimer's disease. Among the imidazo[1,2-b]pyridazines synthesized, several molecules were found selective of DYRKs and CLKs, with IC50 < 100 nM. A structure-activity relationship based on the synthesis of 70 molecules, led to the identification of the structural bases of the selectivity. Products were also evaluated against parasite kinases. It was possible to identify some highly potent inhibitors on PfCLK1. The aim of second part of this thesis was to optimize the synthetic process to obtain imidazo[4,5-b]pyridines, which are close analogues of roscovitine. Derivatives had proved capable of inhibiting the formation of cysts in a cellular model of polycystic kidney disease. A seven-step synthesis has led to several grams of 3,5,7-trisubstituted imidazo[4,5-b]pyridine which is now available for evaluation in vivo.

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Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique complexe causée par des facteurs génétiques mais aussi environnementaux, tels la sédentarité et le surpoids. La dysfonction de la cellule β pancréatique est maintenant reconnue comme l’élément déterminant dans le développement du DT2. Notre laboratoire s’intéresse à la sécrétion d’insuline par la cellule β en réponse aux nutriments calorigéniques et aux mécanismes qui la contrôle. Alors que la connaissance des mécanismes responsables de l’induction de la sécrétion d’insuline en réponse aux glucose et acides gras est assez avancée, les procédés d’inhibition de la sécrétion dans des contextes normaux ou pathologiques sont moins bien compris. L’objectif de la présente thèse était d’identifier quelques-uns de ces mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique, et ce en situation normale ou pathologique en lien avec le DT2. La première hypothèse testée était que l’enzyme mitochondriale hydroxyacyl-CoA déshydrogénase spécifique pour les molécules à chaîne courte (short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, SCHAD) régule la sécrétion d’insuline induite par le glucose (SIIG) par la modulation des concentrations d’acides gras ou leur dérivés tels les acyl-CoA ou acyl-carnitine dans la cellule β. Pour ce faire, nous avons utilisé la technologie des ARN interférants (ARNi) afin de diminuer l’expression de SCHAD dans la lignée cellulaire β pancréatique INS832/13. Nous avons par la suite vérifié chez la souris DIO (diet-induced obesity) si une exposition prolongée à une diète riche en gras activerait certaines voies métaboliques et signalétiques assurant une régulation négative de la sécrétion d’insuline et contribuerait au développement du DT2. Pour ce faire, nous avons mesuré la SIIG, le métabolisme intracellulaire des lipides, la fonction mitochondriale et l’activation de certaines voies signalétiques dans les îlots de Langerhans isolés des souris normales (ND, normal diet) ou nourries à la dière riche en gras (DIO) Nos résultats suggèrent que l’enzyme SCHAD est importante dans l’atténuation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose et les acides aminés. En effet, l’oxydation des acides gras par la protéine SCHAD préviendrait l’accumulation d’acyl-CoA ou de leurs dérivés carnitine à chaîne courtes potentialisatrices de la sécrétion d’insuline. De plus, SCHAD régule le métabolisme du glutamate par l’inhibition allostérique de l’enzyme glutamate déshydrogénase (GDH), prévenant ainsi une hyperinsulinémie causée par une sur-activité de GDH. L’étude de la dysfonction de la cellule β dans le modèle de souris DIO a démontré qu’il existe une grande hétérogénéité dans l’obésité et l’hyperglycémie développées suite à la diète riche en gras. L’orginialité de notre étude réside dans la stratification des souris DIO en deux groupes : les faibles et forts répondants à la diète (low diet responders (LDR) et high diet responder (HDR)) sur la base de leur gain de poids corporel. Nous avons mis en lumières divers mécanismes liés au métabolisme des acides gras impliqués dans la diminution de la SIIG. Une diminution du flux à travers le cycle TG/FFA accompagnée d’une augmentation de l’oxydation des acides gras et d’une accumulation intracellulaire de cholestérol contribuent à la diminution de la SIIG chez les souris DIO-HDR. De plus, l’altération de la signalisation par les voies AMPK (AMP-activated protein kinase) et PKC epsilon (protéine kinase C epsilon) pourrait expliquer certaines de ces modifications du métabolisme des îlots DIO et causer le défaut de sécrétion d’insuline. En résumé, nous avons mis en lumière des mécanismes importants pour la régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique saine ou en situation pathologique. Ces mécanismes pourraient permettre d’une part de limiter l’amplitude ou la durée de la sécrétion d’insuline suite à un repas chez la cellule saine, et d’autre part de préserver la fonction de la cellule β en retardant l’épuisement de celle-ci en situation pathologique. Certaines de ces voies peuvent expliquer l’altération de la sécrétion d’insuline dans le cadre du DT2 lié à l’obésité. À la lumière de nos recherches, le développement de thérapies ayant pour cible les mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline pourrait être bénéfique pour le traitement de patients diabétiques. / Type 2 diabetes (T2D) is a complex metabolic disease caused by genetic as well as environmental factors, such as sedentarity and obesity. Pancreatic β cell dysfunction is now recognized as the key factor in T2D development. Our laboratory is studying the mechanisms of regulation of insulin secretion by the pancreatic β cell in response to nutrients. While the knowledge of the mechanisms responsible for initiation of insulin secretion in response to glucose and fatty acids is quite advanced, the inhibitory processes of insulin secretion in normal or pathological situations are still poorly understood. This doctoral thesis has focused on the identification of some of the mechanisms responsible for negative regulation of insulin secretion in pancreatic β cell. We have addressed this issue under normal situation or pathological conditions related to T2D. We first tested the hypothesis by which a mitochondrial enzyme, short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (SCHAD), negatively regulates glucose-induced insulin secretion (GIIS) by limiting the concentrations of some fatty acids and their derivatives such as acyl-CoA or acyl-carnitine molecules in the β cell. For this purpose, the downregulation of SCHAD by RNA interference (RNAi) was used in the pancreatic β cell line INS832/13. Then, we tested wether a prolonged administration of high-fat diet to mice (diet-induced obesity mouse model, DIO) would modulate intracellular metabolic and molecular pathways responsible for inhibition of insulin secretion. C57BL/6 mice were therefore fed a high-fat diet for 8 weeks followed by insulin secretion, intracellular lipid metabolism, mitochondrial function and intracellular signaling measurements on isolated pancreatic islets of Langerhans of those mice. Our results suggest that SCHAD negatively regulates GIIS and amino acid-induced insulin secretion. We propose that fatty acid oxidation by SCHAD would prevent the accumulation of short-chain acyl-CoAs or acyl-carnitines capable of potentiating insulin secretion. In addition, SCHAD regulates glutamate metabolism by the allosteric inhibition of glutamate dehydrogenase (GDH) preventing the hyperinsulinemia caused by excessive GDH activity. The study of β cell dysfunction in the DIO mouse model stratified LDR and HDR highlighted various fatty acid metabolism pathways involved in the reduction of GIIS. A decrease in the triglycerides/free fatty acid (TG/FFA) cycling associated with an increase in fatty acid oxidation and intracellular accumulation of cholesterol was shown to contribute to the decreased GIIS in DIO-HDR mice. Furthermore, alteration of AMP-activated kinase (AMPK) and protein kinase C epsilon (PKC epsilon) signaling pathways would be responsible for those alterations in metabolic pathways observed in DIO islets and cause decreased insulin secretion. In summary, we have shed light on important pathways negatively regulating insulin secretion in pancreatic β cell. These pathways could either limit the amplitude or duration of insulin secretion after a meal, or help to preserve β-cell function by delaying exhaustion. Some of those signaling pathways could explain the altered insulin secretion observed in T2D obese patients. In light of our research, the development of therapies targeting pathways that negatively regulate insulin secretion may be beneficial for treating diabetic patients.

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique complexe causée par des facteurs génétiques mais aussi environnementaux, tels la sédentarité et le surpoids. La dysfonction de la cellule β pancréatique est maintenant reconnue comme l’élément déterminant dans le développement du DT2. Notre laboratoire s’intéresse à la sécrétion d’insuline par la cellule β en réponse aux nutriments calorigéniques et aux mécanismes qui la contrôle. Alors que la connaissance des mécanismes responsables de l’induction de la sécrétion d’insuline en réponse aux glucose et acides gras est assez avancée, les procédés d’inhibition de la sécrétion dans des contextes normaux ou pathologiques sont moins bien compris. L’objectif de la présente thèse était d’identifier quelques-uns de ces mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique, et ce en situation normale ou pathologique en lien avec le DT2. La première hypothèse testée était que l’enzyme mitochondriale hydroxyacyl-CoA déshydrogénase spécifique pour les molécules à chaîne courte (short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, SCHAD) régule la sécrétion d’insuline induite par le glucose (SIIG) par la modulation des concentrations d’acides gras ou leur dérivés tels les acyl-CoA ou acyl-carnitine dans la cellule β. Pour ce faire, nous avons utilisé la technologie des ARN interférants (ARNi) afin de diminuer l’expression de SCHAD dans la lignée cellulaire β pancréatique INS832/13. Nous avons par la suite vérifié chez la souris DIO (diet-induced obesity) si une exposition prolongée à une diète riche en gras activerait certaines voies métaboliques et signalétiques assurant une régulation négative de la sécrétion d’insuline et contribuerait au développement du DT2. Pour ce faire, nous avons mesuré la SIIG, le métabolisme intracellulaire des lipides, la fonction mitochondriale et l’activation de certaines voies signalétiques dans les îlots de Langerhans isolés des souris normales (ND, normal diet) ou nourries à la dière riche en gras (DIO) Nos résultats suggèrent que l’enzyme SCHAD est importante dans l’atténuation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose et les acides aminés. En effet, l’oxydation des acides gras par la protéine SCHAD préviendrait l’accumulation d’acyl-CoA ou de leurs dérivés carnitine à chaîne courtes potentialisatrices de la sécrétion d’insuline. De plus, SCHAD régule le métabolisme du glutamate par l’inhibition allostérique de l’enzyme glutamate déshydrogénase (GDH), prévenant ainsi une hyperinsulinémie causée par une sur-activité de GDH. L’étude de la dysfonction de la cellule β dans le modèle de souris DIO a démontré qu’il existe une grande hétérogénéité dans l’obésité et l’hyperglycémie développées suite à la diète riche en gras. L’orginialité de notre étude réside dans la stratification des souris DIO en deux groupes : les faibles et forts répondants à la diète (low diet responders (LDR) et high diet responder (HDR)) sur la base de leur gain de poids corporel. Nous avons mis en lumières divers mécanismes liés au métabolisme des acides gras impliqués dans la diminution de la SIIG. Une diminution du flux à travers le cycle TG/FFA accompagnée d’une augmentation de l’oxydation des acides gras et d’une accumulation intracellulaire de cholestérol contribuent à la diminution de la SIIG chez les souris DIO-HDR. De plus, l’altération de la signalisation par les voies AMPK (AMP-activated protein kinase) et PKC epsilon (protéine kinase C epsilon) pourrait expliquer certaines de ces modifications du métabolisme des îlots DIO et causer le défaut de sécrétion d’insuline. En résumé, nous avons mis en lumière des mécanismes importants pour la régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique saine ou en situation pathologique. Ces mécanismes pourraient permettre d’une part de limiter l’amplitude ou la durée de la sécrétion d’insuline suite à un repas chez la cellule saine, et d’autre part de préserver la fonction de la cellule β en retardant l’épuisement de celle-ci en situation pathologique. Certaines de ces voies peuvent expliquer l’altération de la sécrétion d’insuline dans le cadre du DT2 lié à l’obésité. À la lumière de nos recherches, le développement de thérapies ayant pour cible les mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline pourrait être bénéfique pour le traitement de patients diabétiques. / Type 2 diabetes (T2D) is a complex metabolic disease caused by genetic as well as environmental factors, such as sedentarity and obesity. Pancreatic β cell dysfunction is now recognized as the key factor in T2D development. Our laboratory is studying the mechanisms of regulation of insulin secretion by the pancreatic β cell in response to nutrients. While the knowledge of the mechanisms responsible for initiation of insulin secretion in response to glucose and fatty acids is quite advanced, the inhibitory processes of insulin secretion in normal or pathological situations are still poorly understood. This doctoral thesis has focused on the identification of some of the mechanisms responsible for negative regulation of insulin secretion in pancreatic β cell. We have addressed this issue under normal situation or pathological conditions related to T2D. We first tested the hypothesis by which a mitochondrial enzyme, short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (SCHAD), negatively regulates glucose-induced insulin secretion (GIIS) by limiting the concentrations of some fatty acids and their derivatives such as acyl-CoA or acyl-carnitine molecules in the β cell. For this purpose, the downregulation of SCHAD by RNA interference (RNAi) was used in the pancreatic β cell line INS832/13. Then, we tested wether a prolonged administration of high-fat diet to mice (diet-induced obesity mouse model, DIO) would modulate intracellular metabolic and molecular pathways responsible for inhibition of insulin secretion. C57BL/6 mice were therefore fed a high-fat diet for 8 weeks followed by insulin secretion, intracellular lipid metabolism, mitochondrial function and intracellular signaling measurements on isolated pancreatic islets of Langerhans of those mice. Our results suggest that SCHAD negatively regulates GIIS and amino acid-induced insulin secretion. We propose that fatty acid oxidation by SCHAD would prevent the accumulation of short-chain acyl-CoAs or acyl-carnitines capable of potentiating insulin secretion. In addition, SCHAD regulates glutamate metabolism by the allosteric inhibition of glutamate dehydrogenase (GDH) preventing the hyperinsulinemia caused by excessive GDH activity. The study of β cell dysfunction in the DIO mouse model stratified LDR and HDR highlighted various fatty acid metabolism pathways involved in the reduction of GIIS. A decrease in the triglycerides/free fatty acid (TG/FFA) cycling associated with an increase in fatty acid oxidation and intracellular accumulation of cholesterol was shown to contribute to the decreased GIIS in DIO-HDR mice. Furthermore, alteration of AMP-activated kinase (AMPK) and protein kinase C epsilon (PKC epsilon) signaling pathways would be responsible for those alterations in metabolic pathways observed in DIO islets and cause decreased insulin secretion. In summary, we have shed light on important pathways negatively regulating insulin secretion in pancreatic β cell. These pathways could either limit the amplitude or duration of insulin secretion after a meal, or help to preserve β-cell function by delaying exhaustion. Some of those signaling pathways could explain the altered insulin secretion observed in T2D obese patients. In light of our research, the development of therapies targeting pathways that negatively regulate insulin secretion may be beneficial for treating diabetic patients.