Les protéines ERMs (Ezrine, radixine et moésine) jouent un rôle central in cellulo, dans de nombreux processus cellulaires tels que les infections, la migration et la division cellulaire. Parmi celles-ci, la moésine est plus particulièrement impliquée dans la formation de la synapse immunologique, l’infection virale et bactérienne, et les métastases cancéreuses. D’un point de vue structural, les ERM peuvent être en conformation inactive (replies sur elles-mêmes) ou actives (ouvertes), ce qui permet leur interaction a la fois avec les constituants du cytosquelette (actine et tubuline) via leur domaine C-terminal et la membrane plasmique via leur domaine FERM. La liaison a la membrane plasmique se fait principalement et spécifiquement via un lipide de la famille des phosphoinositides, le phosphatidyl 4,5 bisphosphate (PIP2). De plus, les protéines peuvent être phosphorylées, ce qui contribue à leur ouverture structurale. Cependant, le rôle de la phosphorylation sur les interactions ERM/membrane et ERM/cytosquelette, bien que beaucoup étudié in cellulo, est peu compris au niveau moléculaire.Le but de cette thèse est précisément d’étudier, au niveau moléculaire et à l’aide de systèmes biomimétiques, les interactions entre des protéines recombinantes et des membranes biomimétiques contenant du PIP2. Pour cela, nous avons mis au point des membranes lipidiques sous forme de vésicules unilamellaires (petites ou larges) et de bicouches lipidiques supportées, qui permettent de caractériser les interactions entre protéines et membranes par des techniques biophysiques complémentaires, notamment la cosédimentation quantitative, la microscopie et spectroscopie de fluorescence, et la microbalance à cristal de quartz. Dans une première partie, nous avons étudié le rôle de la double phosphorylation de la moésine (réalisée par mutation sur site spécifique) sur les interactions moésine/membrane biomimétique, en comparaison de la protéine sauvage, les protéines recombinantes et les mutants ayant été produites et purifiées au laboratoire.Nos résultats mettent en évidence une interaction spécifique et coopérative pour le double mutant phosphomimétique alors que cette interaction est simple dans le cas de la protéine sauvage. Dans une seconde partie, nous avons employé les bicouches lipidiques supportées contenant le PIP2 pour étudier les mécanismes molécules d’adsorption de la protéine virale Gag et de ses mutants. Les méthodologies développées dans ce travail de thèse ouvrent des perspectives en biophysique moléculaires car elles sont facilement transposables à l’étude d’autres protéines sur des membranes lipidiques modèles contenant des phosphoinositides.Mots clés: Ezrine-Radixine-Moésine, phosphoinositides, PIP2, interactions protéine-lipide, membrane lipidique biomimétique, protéine virale Gag, cytosquelette. / ERM (ezrin, radixin, moesin) proteins play a central role in cellulo in a large number of physiological and pathological processes, including cell infection, migration and cell division. Among the ERMs, moesin is particularly involved in the formation of the immunological synapse, viral and bacterial infection, and cancer metastasis. From a structural point of view, ERMs can be in inactive (closed) conformation or active (open), which enable them to interact on one side with the cytoskeleton (actin and tubulin) via their C-terminal domain and on the other side with the plasma membrane via their FERM domain. Binding to the plasma membrane is mediated via a specific lipid of the phosphoinositide family, the phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate (PIP2). In addition, ERM can be phosphorylated, which contribute to their structural opening. To date, the role of the phosphorylation in ERM/membrane and ERM/cytoskeleton interactions, although widely studied in cellulo, remains poorly understood at the molecular level.The aim of this PhD thesis is precisely to study, at the molecular level and using biomimetic systems, interactions between recombinant proteins and biomimetic membranes containing PIP2. To this end, we have engineered lipid membranes in the form of large and small unilamellar vesicles and supported lipid bilayers. These biomimetic membranes are used to characterize interactions between proteins and membranes by complementary biophysical techniques, notably quantitative cosedimentation, fluorescence microscopy and spectroscopy, and quartz crystal microbalance with dissipation monitoring. In a first part, we studied the role of double phosphorylation on moesin, achieved via a site-specific mutation on threonine residues, on moesin/biomimetic membrane interactions, in comparison to the wild type protein. The recombinant proteins and mutants were produced in our laboratory.Our results show that there is a specific and cooperative interaction for the double phosphomimetic mutant while interactions is 1:1 in the case of the wild type protein. In a second part, we used supported lipid bilayers containing PIP2 to study the molecular adsorption mechanism of the viral protein Gag and of its mutants. The methodologies that were developed in this work open perspectives in molecular biophysics since they are easily adaptable to other proteins on model lipid membranes containing phosphoinositidesKeywords: Ezrin-Radixin-Moesin, phosphoinositides, PIP2, protein/lipid interactions, biomimetic lipid membrane, Gag viral protein, cytoskeleton.

Les oreillons sont une maladie très contagieuse causée par le virus ourlien. La méthode préventive (le vaccin) contre ce virus a été déjà mise au point. Par contre, les épidémies récentes restent incontrôlables. Il est donc très important de comprendre le mécanisme moléculaire de son cycle de vie afin d’élaborer le traitement effectif et spécifique. Ce virus appartient à la famille des Paramyxoviridae. Son génome, l’ARN non segmenté monocaténaire de polarité négative, est protégé par la nucléoprotéine (N) en formant des structures filamenteuses nucléocapsides. N joue un rôle essentiel dans la synthèse du génome viral. En effet, cette protéine avec la polymérase et son cofacteur phosphoprotéine (P) constitue la machinerie de transcription-réplication du virus. La N et la P sont composées des régions pliées et dépliées. Malgré que la morphologie du virus ourlien est conservée parmi les autres membres de la famille, il existe quelques différences. Il a été démontré que la P est un oligomère antiparallel avec les deux extrémités d’un côté qui interagissent avec la partie structurale de N (Ncore). Tandis que la fonction de la région désordonnée (Ntail) est compliquée à identifier pour le moment. En comparant avec les autres paramyxovirus connus, Ntail n’interagit pas avec le domaine C-terminal de la P. Le rôle des régions déstructurées de P n’a pas été défini. Dans ce projet, nous dévoilons les mécanismes des interactions entre diverses régions de N et P et nous expliquons comment les domaines intrinsèquement désordonnés de N et P sont impliqués dans la régulation de la machine complexe de réplication virale. Nous avons utilisé la résonance magnétique nucléaire qui est la méthode la plus puissante afin de déterminer la structure, la dynamique et les partenaires d’interaction dont la fonction des protéines dépliées virales. / Mumps is a highly contagious disease caused by the mumps virus. The prevention treatment (vaccine) against it is already in the routine use. However, recent outbreaks still remain uncontrollable. Therefore, it is important to understand the molecular mechanism of the mumps virus life cycle. This virus belongs to the family of Paramyxoviridae. Its genome, negative strand non-segmented RNA is protected by the nucleoprotein (N) by forming filamentous structures called nucleocapsids. N plays an important role in viral genome synthesis. Together with the polymerase and its cofactor phosphoprotein (P) they constitute the transcription-replication machinery. Both N and P contain folded and unfolded regions. Despite mumps virus common morphology with other paramyxovirus, there are some differences. It has been proposed that P is an antiparallel oligomer with two extremities on the one side being in interaction with the structural part of N (Ncore). The function of the disordered domain (Ntail) remains unclear, as it does not seem to bind to the C-terminal part of P, as is the case for other paramyxoviruses. The role of the disordered domains of P is also not known. In this project we revealed mechanisms of interaction between different regions of N and P and we explain how disordered regions of N and P are implicated in the regulation of the complex machinery of viral replication. We used the nuclear magnetic resonance which is the most powerful method to determine structure, dynamics and potential interaction partners, and therefore, function of disordered viral proteins.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est l’agent étiologique du SIDA, un rétrovirus complexe encodant les protéines accessoires : Nef, Vif, Vpr et Vpu. La fonction principale de ces protéines est de moduler l’environnement cellulaire afin de promouvoir la réplication virale. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur la protéine virale Vpr, une protéine bien connue pour son activité d’arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M dans les cellules en division et pour l’avantage réplicatif qu’elle confère au virus durant l’infection de cellules myéloïdes. Les évènements sous-jacents à ces deux activités restent pour l’heure mal compris. Le but des travaux regroupés dans cet ouvrage est d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires pouvant éventuellement expliquer les activités de Vpr précédemment décrites. Pour ce faire, nous avons utilisé une approche d’identification des partenaires de proximité par biotinylation, appelée BioID. L’avantage du BioID est de permettre un marquage in cellulo des protéines à proximité de la protéine d’intérêt. La mise en place et la caractérisation de cette approche font l’objet de la première section de cette thèse. En utilisant cette approche, nous avons défini un réseau de 352 partenaires cellulaires de la protéine Vpr. Parmi ces partenaires de Vpr, plusieurs sont organisés sous forme de complexes ou réseaux protéiques incluant notamment le complexe promoteur de l’anaphase/cyclosome (APC/C) et les centrosomes. Étant donné que le complexe APC/C est l’un des principaux régulateurs du cycle cellulaire, nous avons décidé d’analyser sa relation avec Vpr. Nous avons découvert que Vpr formait un complexe non seulement avec APC1, une sous-unité essentielle du complexe APC/C, mais aussi avec les coactivateurs (CDH1 et CDC20) de ce complexe. Nous avons par la suite démontré que Vpr induisait la dégradation d’APC1 et que celle-ci pouvait être prévenue par une double-mutation N28S-G41N de Vpr. Cette dégradation d’APC1 ne semblerait pas être reliée aux activités précédemment décrites de Vpr. Ces travaux font l’objet de la seconde section de cette thèse. Enfin, dans une troisième section, des travaux effectués en collaboration et analysant la relation entre les centrosomes et Vpr sont présentés. Cette thèse identifie 200 nouveaux partenaires de Vpr, ouvrant la porte à l’exploration de nouvelles cibles et activités de Vpr. Elle décrit également une nouvelle cible de Vpr : le complexe APC/C. Globalement nos résultats contribuent à une meilleure compréhension de la façon dont le VIH-1 manipule l’environnement cellulaire de l’hôte à travers la protéine virale Vpr. / Human immunodeficiency virus (HIV-1) is the AIDS causal agent. This complex retrovirus encodes several accessory proteins; namely Nef, Vif, Vpr and Vpu; whose functions are to manipulate the cellular host environment in order to favor HIV-1 viral replication. This thesis focused on Vpr whose main activities are to induce a cell cycle arrest in the G2/M phase in dividing cells and to provide a replicative advantage to HIV-1 during infection of myeloid cells such as macrophages. The cellular mechanisms underlying these two activities are up to now misunderstood. The main goal of the work presented in this thesis is to identify new cellular factors that could potentially explain the previously described Vpr activities. To do so, we used the proximity labelling approach called BioID. The main strength of BioID is to tag in cellulo partners of the protein of interest. The development as well as optimization of the BioID approach is presented in the thesis first section. Using BioID, we defined a network containing 352 cellular partners in close proximity with the viral protein Vpr. Amongst these cellular partners, several were organized into protein complexes or networks such as the anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C) or the centrosome. Given that APC/C is a cell cycle master-regulator, we analyzed the interplay governing Vpr and APC/C interactions. We first demonstrated that Vpr could form a complex containing the scaffolding subunit APC1. APC/C coactivators, namely CDH1 and CDC20, could also be found in association with Vpr. We next showed that Vpr was inducing APC1 degradation and that Vpr residues N28 and G41 were essential to this activity. Surprisingly, the APC1-Vpr interplay does not relate to previously described Vpr activities. This work is presented in the second section of this thesis. Lastly, in the third section, a work done in collaboration analyzed the interplay between Vpr and the centrosomes. In this thesis we identified 200 new potential partners of Vpr, opening the doors to discover novel Vpr targets and activities. This thesis also defined APC/C as new Vpr target. Taken together our results allow a better understanding on how HIV-1 modulates the cellular environment by using the viral accessory protein Vpr.