Peu de données sont connues à savoir comment des protéines méiotiques régulent la recombinaison homologue de façon biochimique. Lors d'études effectuées chez l'humain, il a été démontré que hRad51 se comporte sensiblement comme le fait son homologue bactérien, RecA. Malgré que hDmc1 possède une séquence d'acides aminés possédant 52% d'identité à celle de hRad51, ses caractéristiques et ses capacités sont différentes. Afin d'étudier si cette disparité est conservée chez l'organisme Schizosaccharomyces pombe nous avons purifié et étudié biochimiquement la protéine Dmc1 de cet organisme. Nous montrons que spDmc1 lie préférentiellement l'ADN simple brin et protubérant à l'ADN double brin, une propriété similaire à son homologue bactérien RecA. SpDmc1 purifiée est capable de catalyser des réactions d'échange de brins, telles que rencontrées durant la recombinaison homologue. Contrairement à la protéine humaine, spDmc1 a la capacité de lier l'ADN et d'y former un filament hélicoïdal, la signature des recombinases classiques.

La kinase Aurora A est une protéine essentielle au cycle cellulaire et plus particulièrement lors de la mitose. En effet, Aurora A est nécessaire dès l’entrée en mitose et régule sa progression. Elle joue un rôle dans la maturation et la séparation des centrosomes. Elle participe à l’assemblage du fuseau mitotique et du fuseau central pour le rassemblement et l’orientation des chromosomes. Enfin elle est nécessaire à la réussite de la cytodiérèse. Elle est également nécessaire à l’égale répartition des mitochondries dans les cellules filles et joue un rôle dans l’épissage alternatif des ARNm de facteurs apoptotiques. Au delà de ses fonctions mitotiques, plusieurs études récentes indiquent qu’Aurora A présente des fonctions supplémentaires dans les cellules en interphase. Elle est notamment essentielle au désassemblage du cil primaire et joue un rôle dans la dynamique des microtubules et la migration cellulaire. Enfin, une dérégulation de son expression, de sa stabilité et/ou de son activité perturbe le déroulement du cycle cellulaire ce qui conduit à la transformation des cellules et favorise l’apparition de cancers. Ses fonctions normales ainsi que ses fonctions lors de la carcinogenèse sont conduites à travers les nombreux partenaires protéiques qui entrent en interaction avec elle. Ils modulent son activité, sa localisation et sa stabilité. En retour Aurora A phosphoryle un bon nombre d’entre eux régulant ainsi leur activité, localisation et stabilité. Cependant, l’analyse des interactions déjà connues d’Aurora A ne permet pas d’expliquer tous les phénotypes observés lors de sa dérégulation. Afin de mieux comprendre les fonctions d’Aurora A, les mécanismes qui la régulent et mettre en évidence ses multiples rôles au sein de la cellule, j’ai construit puis analysé un interactome d’Aurora A généré à partir d’une méthode de purification d’affinité couplée à la spectrométrie de masse en tandem. J’ai identifié 477 partenaires potentiels dont 180 présentant une forte probabilité d’être des partenaires directs de la kinase. L’analyse bioinformatique approfondie de cet interactome a permis de révéler les partenaires associés à des mécanismes liés à la mitochondrie et l’épissage des ARN messagers mettant en évidence une implication potentielle d’Aurora A dans ces mécanismes. Pour valider cet interactome, j’ai choisi d’étudier plus précisément deux partenaires identifiés dans cette étude : les protéines WDR62 et CEP97. J’ai montré que ces deux partenaires co-localisent avec Aurora A et sont phosphorylés par la kinase. WDR62 est impliquée dans la microcéphalie et est dérégulée dans certains cancers. J’ai montré qu’Aurora A phosphoryle WDR62 en mitose et que cette phosphorylation est nécessaire à sa localisation aux centrosomes. CEP97 est une protéine du cil primaire encore peu caractérisée et des anomalies du cil primaire sont associées aux ciliopathies. Or l’activité d’Aurora A est nécessaire au désassemblage du cil primaire. J’ai montré qu’Aurora A phosphoryle in vitro CEP97 et que l’inhibition de l’activité d’Aurora A dans les cellules perturbe la localisation de CEP97 au niveau des cils et des centrosomes. Ainsi, ce travail de thèse a permis de mettre en évidence un nombre important de nouveaux partenaires d’Aurora A associés à de nouvelles fonctions. L’étude de ces nouvelles fonctions liées aux mitochondries et à l’épissage des ARN, constitue deux nouveaux projets actuellement menés par des collaborateurs au sein de notre institut. / The serine-threonine kinase Aurora A is an essential mitotic cell cycle protein. Aurora A is necessary for mitotic entry and for the maturation and separation of centrosomes. It participates in mitotic spindle assembly and chromosome biorientation, and it is essential for the completion of cytokinesis. Furthermore, Aurora A activity is necessary for the equal distribution of mitochondria to daughter cells and, through its role in the alternative splicing of mRNA of apoptotic factors, it provides a link between cell cycle control and apoptosis. Beyond its mitotic functions, several recent studies suggest that Aurora A is also important during interphase. Notably, it influences microtubule dynamics, promotes cell migration and polarity control and is essential for primary cilia disassembly. Reflecting the fact that Aurora A is found to be up-regulated in many cancers, deregulation of Aurora A activity can result in an aberrant cell cycle, ultimately leading to malignant transformation of cells. The crucial regulation of Aurora A’s numerous functions is achieved through its interaction with several protein partners, which modulate its activity, localisation and stability. Aurora A in turn phosporylates a number of them, thus regulating their activity, localisation and stability. However, the known interactions of Aurora A cannot explain all the phenotypes that have been described of its deregulation. To better understand the functions of Aurora A, the regulation mechanisms governing it, and to expose its multiple roles in the cell, I have built and analysed an Aurora A interactome using tandem affinity purification coupled with mass spectrometry. This resulted in the identification of 477 potential interacting partners, of which, 180 were determined to have a high probability of interacting directly with the kinase. In-depth bioinformatic analysis of this interactome has revealed the associated partners to be related to mitochondria and mRNA splicing, highlighting the potential involvement of Aurora A in these mechanisms. To validate the interactome, two of the proteins identified in this study, WDR62 and CEP97, were examined in detail. Here I show that these two proteins colocalise with Aurora A, and are phosphorylated by the kinase. WDR62 is implicated in microcephaly and is deregulated in certain cancers. I have shown that Aurora A phosphorylates WDR62 during mitosis, and that this phosphorylation is necessary for its localisation to the centrosomes. CEP97 is a poorly charactarised protein of the primary cilium, abnormalities of which are associated with ciliopathies. I have shown that Aurora A phosphorylates CEP97 in vitro, and that the inhibition of Aurora A activity in vivo perturbs the localisation of CEP97 to cilia and centrosomes. This study has identified a number of new Aurora A-interacting proteins, implicating the kinase with novel functions. These functions, related to mitochondria and mRNA splicing have opened up a new area for further investigation.

La susceptibilité d'un individu à développer un cancer du sein est le résultat d'une interaction complexe de facteurs reliés au style de vie, à l'histoire reproductive et aux déterminants génétiques propres à chaque individu. Jusqu'à présent, un nombre limité de gènes ont été impliqués dans une telle susceptibilité. Il est présentement estimé que des mutations et variations de l'ensemble des gènes de susceptibilité connus (par exemple BRCA1, BRCA2, TP53, STK11, PTEN, ATM, PALB2, CHEK2, BR1P1 et les alleles de faible penetrance identifiés récemment) ne seraient responsables que d'un maximum de 30% des cas de cancers clairement familiaux. Dans cette thèse, la contribution de certains gènes a été investiguée dans une cohorte de femmes provenant de la population canadienne française et présentant des évidences claires de l'implication forte de facteurs génétiques de susceptibilité non reliés à BRCA1 ou BRCA2. Notre étude concerne les gènes candidats ZBRK1 (Zinc finger and BRCA1-interacting protein with KRAB domain 1), GADD45A (Growth arrest and DNA-damage-inducible alpha) et NBS1 (Nijmegen breakage syndrome 1). Notre analyse de ZNF350/ZBRK1 a permis de mettre en évidence trois haplotypes modulant de façon significative le risque de cancer du sein dans notre population. Parmi ceux-ci, deux pourraient être associés à un effet protecteur (p=0.01135 et p=0.00268) alors qu'un autre haplotype est lié à une augmentation du risque (p=0.00143). Dans le cas de GADD45A, nous avons identifié un haplotype commun démontrant une fréquence plus élevée dans le groupe contrôle, bien que cette association soit faible. En ce qui concerne NBN, le variant du promoteur c.-242-l lOdelAGTA est significativement surreprésenté dans notre groupe de femmes atteintes. Des essais de type gène luciférase rapporteur n'ont pas démontré de variation d'expression dans la lignée cellulaire de cancer du sein MCF-7, mais ont indiqué une réduction de l'expression dans les lignées cellulaires HEK293 et LNCaP. Ces résultats indiquent qu'il est possible que des variations de ces gènes, bien que n'étant pas très fréquentes, soient impliquées dans la susceptibilité au cancer du sein dans notre population et des études plus approfondies sur de grandes cohortes seront nécessaires afin de confirmer ou infirmer nos résultats.

Les protéines kinases de type NIMA (NIMA related kinases - Neks) forment une famille relativement bien conservée chez les eucaryotes. Plusieurs d’entre elles, comme la protéine kinase NIMA d’Aspergillus nidulans et la protein Nek2 de mammifères ont fait l’objet d’études suffisamment approfondies pour les impliquer dans la régulation du cycle cellulaire. L’objectif du présent travail était de caractériser la famille des Neks chez les plantes, et plus particulièrement de déterminer le rôle de PNek1, une Nek de peuplier. J’ai identifié neuf PtNeks chez Populus trichocarpa, sept AtNeks chez Arabidopsis thaliana et six OsNeks chez Oryza sativa. L’analyse phylogénétique et leur distribution chromosomique suggèrent une descendance unique chez les plantes, probablement à partir de Nek1. L’analyse du profil d’expression transcriptionnelle indique que la régulation de l’expression des Neks est liée aux patrons de développement basipétal de la feuille et vasculaire de la plante. Plus particulièrement, l’analyse de l’expression du gène PNek1 révèle une concordance exacte avec les sites de production de l’auxine, du développement basipétal de la feuille et de l’initiation du système vasculaire. PNek1 n’est toutefois pas induite par la signalisation de l’auxine. La surexpression de PNek1 chez Arabidopsis induit des anomalies importantes au niveau de l’inflorescence, empêchant même la fertilisation de la fleur. Au plan cellulaire, PNek1 est localisé dans le nucléole et s’accumule lors de la phase G2 précédant la mitose. L’accumulation de PNek1 est aussi induite lors d’un stress génotoxique au point de contrôle en G1/S. Des résultats récents de double hybride indiquent que PNek1 pourrait être impliquée dans la maturation de l’ARNm puisqu’elle interagit avec DBR1, une protéine directement impliquée dans l’épissage. Le présent travail offre une perspective inédite de la littérature des Neks comme régulateurs du cycle cellulaire. Le contexte biologique particulier du peuplier m’a aussi conduit à associer les Neks au développement d’organes complexes. Cette approche et ces observations représentent donc en soit une contribution originale, se distinguant des nombreuses études antérieures faites chez les mammifères, où seule leur relation au cycle cellulaire a été étudiée. / The NIMA-related kinases family (Neks) is well conserved among eukaryotes. Several studies, especially on Aspergillus nidulans NIMA and mammalian Nek2, have tagged them as cell cycle regulators. The objective pursued in this work was to characterise the plant Nek family and, more specifically, to identify a possible role for PNek1, a Nek from poplar tree. Here, I describe nine PtNeks in Populus trichocarpa, seven AtNeks in Arabidopsis thaliana and six OsNeks in Oryza sativa. Phylogenetic analysis in addition to their chromosomal distribution suggest a unique origin for all plant Neks. Exhaustive transcript expression analysis indicates that plant Neks regulation is related to the basipetal and vascular plant development patterns. Moreover, PNek1 promoter expression analysis reveals a striking similarity with sites of auxin production, basipetal leaf development and vascular initiation. However, PNek1 is not induced by auxin signalling. PNek1 overexpression in Arabidopsis induces severe inflorescence anomalies, which can lead to flower sterility. At the cell level, PNek1 is localised in the nucleoli and accumulates during the G2 phase before the onset for mitosis. PNek1 transcript accumulation could also be induced by a genotoxic stress at the G1/S checkpoint. Yeast two-hybrid experiments indicate that PNek1 could be involved in mRNA maturation since it interacts with DBR1, a protein directly involved in RNA splicing. This work offers a unique perspective to the actual Neks literature as cell cycle regulators. The particular biological context of poplar trees also brought me to associate Neks with complex organ development. This approach and these observations represent an original contribution, distinguishing itself from the numerous mammalians studies which only looked at their relation to the cell cycle regulation.

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