Ce mémoire porte sur l'étude des structures et des interactions membranaires de peptides amyloïdes dérivés de la transthyrétine (TTR10-20), de la protéine de prion (PrP110-136) et de l'amyloïde-β (Aβl-42). Grâce aux spectroscopies IR-TF et RMN, complémentées par des techniques de microscopic nous avons étudié la structure et les interactions entre TTR10-20 et PrP110-136 et des membranes modèles zwitterioniques (DMPC) et anioniques (DMPG). Finalement, les spectroscopies UV-Vis et de fluorescence ont permis d'étudier la cinétique d'agrégation d'Aβi-42. Les résultats démontrent que TTR10-20 a tendance à former des agrégats non-fibrillaires qui affectent davantage la dynamique des têtes polaires de DMPC. D'un autre côté, PrP110-136 forme une hélice transmembranaire avec DMPC, mais cette hélice semble préférer interagir avec les têtes polaires des vésicules de DMPG. Dans la dernière étude, nous avons déterminé qu'Aβl-42 commence à former des structures fibrillaires après une phase latente de 500 à 600 minutes.

Les protéines Hsp70 appartiennent à une famille de chaperons moléculaires très conservés qui jouent un rôle essentiel dans le contrôle qualité des protéines et qui protègent les cellules contre diverses agressions de l'environnement. Pour fonctionner comme un chaperon moléculaire, les protéines Hsp70 agissent de concert avec plusieurs co-chaperons et co-facteurs nécessaires au fonctionnement de son cycle ATPasique. Nos travaux montrent que les bactéries du genre Mycobacterium codent pour une nouvelle famille de protéines atypiques apparentées à Hsp70 dont l'architecture s'articule autour d'un domaine ATPase putatif à l'extrémité N-terminale, similaire au domaine de la superfamille Hsp70-actine, d’un segment transmembranaire (TMD) putatif et d'une longue région riche en proline/thréonine (P/T) en sa partie C-terminale. Le but de ce travail de thèse était d’étudier la fonction et la localisation cellulaire des protéines de type Hsp70 chez les mycobactéries. Nous avons d’abord constaté que la protéine Hsp70-Like de M. smegmatis (Msmg_Hsp70-Like) se localisait en foci distincts à la membrane des cellules et que son expression induisait un phénotype d’agrégation cellulaire. Afin d’éclaircir le rôle des domaines putatifs TMD et P/T, nous avons construit un ensemble de mutants dans lesquels ces éléments structurels ont été supprimés. Nous avons constaté que le domaine TMD putatif était important pour la localisation de Hsp70-Like, pour la formation des foci à la membrane et pour le phénotype d'agrégation des cellules. En revanche, le domaine riche en P/T n’a aucun effet sur ces phénotypes. In vitro, le domaine ATPase putatif de Msmg_Hsp70-Like a été purifié et des essais de cristallisation sont en cours. Des expériences supplémentaires restent cependant nécessaires pour évaluer la fonction de cette nouvelle famille de protéines. / Hsp70 belongs to a highly conserved family of molecular chaperone proteins that unambiguously plays essential roles in protein quality control, protecting cells against various environmental insults. To function as a bona fide molecular chaperone, Hsp70 acts in concert with several co-chaperones and nucleotide exchange factors to complete its ATP-dependent chaperone cycle. Our work shows that bacteria from the genus Mycobacterium encode new atypical Hsp70-Like proteins that share a common architecture: a putative ATPase domain at the N-terminus similar to members of the Hsp70-actin superfamily, a single putative transmembrane domain (TMD) in the middle of the protein and a long proline/threonine (P/T) - rich region at the C-terminal. The aim of this thesis work was to shed light on the function and the cellular localization of Hsp70-like proteins in mycobacteria. We first found that Msmg Hsp70-Like protein localizes to discrete foci within cells and that its expression induces a cell aggregation phenotype. To shed light on the role of the putative TMD and P/T- rich domains in Hsp70-Like, we engineered a set of mutants in which these structural elements were deleted. We found that the central putative TMD was important for the cell envelop localization of Hsp70-Like, for the formation of foci and for cell aggregation. In contrast, the P/T-rich had no effect on these phenomena. In vitro the putative ATPase domain of Msmg Hsp70-Like was purified and crystallization trials were performed. Further research is needed to assess the function of this novel family of proteins.

L'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique est une protéine membranaire dont plusieurs conformations ont été résolues par cristallographie des rayons X. Ces structures ont été précieuses pour l'interprétation de nos études fonctionnelles sur le rôle du domaine A et de la boucle L6-7 de l'ATPase. Mais nous avons montré que les conditions de cristallisation aboutissent parfois à des structures paradoxales : la présence de concentrations importantes de Ca2+ pendant la cristallisation en présence d'AMPPCP conduit l'ATPase à adopter une conformation probablement différente de sa structure moyenne en solution; de même, dans les conformations de l'ATPase proches de l'état phosphorylé «E2P», les inhibiteurs généralement utilisés pour stabiliser l'ATPase bloquent de façon artéfactuelle l'ouverture des sites Ca2+ vers la lumière du réticulum. Nous avons tenté de comprendre les avantages et inconvénients de divers polymères amphiphiles conçus pour stabiliser en solution les protéines membranaires.

Le projet de thèse se focalise sur la synthèse de biomolécules et se subdivise en deux parties. La première partie concerne la conception et la synthèse de dérivés de produits naturels d'intérêt thérapeutique nommés aurones en vue de mettre au point de nouvelles molécules à activité antivirale. Récemment, les aurones ont été identifiées comme étant des inhibiteurs de l'ARN-polymérase ARN-dépendante (NS5B) du virus de l'hépatite C (VHC). Cette enzyme, présente chez le virus mais absente chez l'homme, joue un rôle central dans la réplication virale. Suite à ces résultats antérieurs, les efforts ont été poursuivis et, dans le cadre de cette thèse, nous avons entrepris,d'une part, la synthèse d'analogues originaux dont le cycle B des aurones a été remplacé par des hétérocycles et, d'autre part, la synthèse depseudodimères d'aurones dans le but d'affiner les exigences structurales pour améliorer l'effet inhibiteur.L'activité a été évaluée selon des tests enzymatiques et cellulaires et a permis d'identifier quelques candidats doués d'une bonne activité inhibitrice et d'une faible toxicité. La deuxième partie du projet de thèse, sans lien avec la première partie,concerne des aspects plus fondamentaux et porte sur la synthèse de nouveaux surfactants agissant comme agents stabilisants lors des procédures d'extraction et de cristallisation des protéines membranaires. Les surfactants sont des composants clés dans le domaine de la biologie structurale et de la biochimie des protéines membranaire. Ils sont nécessaires pour maintenir les protéines membranaires dans leur état fonctionnel après extraction. La grande majorité des protéines membranaires est riche en résidus basiques à l'interface. Sur la base de cette caractéristique, une nouvelle famille de surfactants est développée et testée sur des protéines membranaires appartenant aux pompes d'efflux ABC multi-résistantes. / The PhD project focuses on biomolecules and is divided into two parts. The first part concerns the design and synthesis of natural product derivatives with therapeutic interest in order to develop new molecules with antiviral activity. Recently, aurones were identified as new inhibitors of hepatitis C virus (HCV) NS5B polymerase. Following these results, efforts were continuedand we undertook, on the one hand,the synthesis of original analogues in which the aurone B-ring was replaced by a heterocyclic rings and, on the other hand, the synthesis of aurone pseudodimers in order to refine the structural requirements to improve the inhibitory effect. The potent NS5B inhibitory activity combined with their low toxicity make aurones attractive drug candidates against HCV infection. The second part of the PhD thesis is unrelated to the first part and concerns more fundamental aspects. It focused on the synthesis of new surfactants acting as stabilizing agents during extraction of membrane proteins (PM). Surfactants are required for maintaining PM in their functional state after extraction from membrane lipid matrix. The vast majority of PM shares a net enrichment in basic residues at the interface between membrane and cytoplasm, a property known as the positive inside rule. Based on this feature, a new family of surfactants is developed and tested on membrane proteins belonging to the multidrug ABC efflux pumps family.

On peut imaginer dans un futur proche que des micro-robots implantés pourront suppléer la défaillance de certaines fonctions essentielles. C’est déjà le cas avec les stimulateurs cardiaques dont les piles au lithium sont bien adaptées à leur fonctionnement pendant des années de vie du patient. Cependant, pour des systèmes plus gourmands en énergie, il convient d’améliorer la longévité et la puissance volumique de ces piles. La stratégie que nous avons choisie est basée sur une approche biomimétique et deux voies ont été suivies pour créer une biopile bioinspirée : les biopiles enzymatiques génèrent un courant électrique à partir de l’oxydation de molécules organiques et la réduction d’oxygène en eau. Les biopiles à base de membranes biomimétiques génèrent un potentiel électrique à partir du transfert d’ions au travers une membrane biomimétique.Les biopiles enzymatiques, qui utilisent par exemple le glucose et l’oxygène, sont théoriquement capables de fonctionner indéfiniment car ces substrats sont toujours présents dans l’organisme. Cependant, la biocompatibilité et la performance à long terme de ces biopiles restent des verrous pour leur mise en œuvre chez l’homme. Cette thèse décrit la conception et l’implantation de nouvelles biopiles enzymatiques chez différents modèles animaux. Leur implantation constitue un véritable défi technologique et nous amenons des solutions guidées par la physiologie en abordant les problèmes de biocompatibilité mais aussi de techniques de mesure électrique.Nous sommes maintenant capables d’implanter ces biopiles chez de gros animaux en analysant en temps réel les performances de la biopile implantée.Cette thèse développe également le concept de biopile à base de membranes biomimétiques. Il s’agit d’une biopile mettant en œuvre des protéines de transport (par exemple des canaux ioniques) insérées dans des membranes biomimétiques. Nous avons démontré la faisabilité de la transformation d’un gradient de NaCl en gradient de protons. Nous avons aussi réussi à générer une différence de potentiel de 20 millivolts avec une membrane plane de 38 mm². Cette membrane biomimétique, contenant l’échangeur sodium/proton NhaA, est stable pendant plus de 15 jours. / We believe that in the near future micro-robots or artificial implanted organs can replace failing essential organs. Lithium batteries of cardiac pacemakers are well adapted to operate for years into sick patients. However, for next generation energy intensive implanted devices, longevity and volumic power of these batteries have to be improved.We chose two biomimetic approaches to create bioinspired biofuel cells: the enzymatic biofuel cells generate electrical current from the oxidation and the reduction of organic or inorganic compounds. The biomimetic biofuel cell generate an electrical potential from ion transfer across a biomimetic membrane.The enzymatic biofuel.cells, utilizing glucose and oxygen, are theorically able to work almost indefinitely as their substrates are always present in the body fluids. However, the biocompatibility and the long-term performance of these biofuel cells for a human implantation remain a real bottleneck. This thesis describes the design and the implantation of of new enzymatic biofuel cells in different animal models. The implantation of such devices is challenging and we brought creative solutions with a physiological point of view by addressing biocompatibility problems and electrical measurement techniques. We are now capable to implant these biofuel cells in big animals by analyzing the performances of the biofuel cell in real time.This thesis initiates the biomimetic biofuel cell concept. It consists in membrane transport protein (i.e ion channels) incorporated in a biomimetic membrane. The building of a biomimetic device demonstrates the transformation of a NaCl gradient into a proton gradient. We also generate a 20 mV voltage with a 38 mm² flat membrane. This biomimetic membrane containing the NhaA sodium/ proton exchanger is stable for more than two weeks.

Le projet de thèse se focalise sur la synthèse de biomolécules et se subdivise en deux parties. La première partie concerne la conception et la synthèse de dérivés de produits naturels d'intérêt thérapeutique nommés aurones en vue de mettre au point de nouvelles molécules à activité antivirale. Récemment, les aurones ont été identifiées comme étant des inhibiteurs de l'ARN-polymérase ARN-dépendante (NS5B) du virus de l'hépatite C (VHC). Cette enzyme, présente chez le virus mais absente chez l'homme, joue un rôle central dans la réplication virale. Suite à ces résultats antérieurs, les efforts ont été poursuivis et, dans le cadre de cette thèse, nous avons entrepris,d'une part, la synthèse d'analogues originaux dont le cycle B des aurones a été remplacé par des hétérocycles et, d'autre part, la synthèse depseudodimères d'aurones dans le but d'affiner les exigences structurales pour améliorer l'effet inhibiteur.L'activité a été évaluée selon des tests enzymatiques et cellulaires et a permis d'identifier quelques candidats doués d'une bonne activité inhibitrice et d'une faible toxicité. La deuxième partie du projet de thèse, sans lien avec la première partie,concerne des aspects plus fondamentaux et porte sur la synthèse de nouveaux surfactants agissant comme agents stabilisants lors des procédures d'extraction et de cristallisation des protéines membranaires. Les surfactants sont des composants clés dans le domaine de la biologie structurale et de la biochimie des protéines membranaire. Ils sont nécessaires pour maintenir les protéines membranaires dans leur état fonctionnel après extraction. La grande majorité des protéines membranaires est riche en résidus basiques à l'interface. Sur la base de cette caractéristique, une nouvelle famille de surfactants est développée et testée sur des protéines membranaires appartenant aux pompes d'efflux ABC multi-résistantes. / The PhD project focuses on biomolecules and is divided into two parts. The first part concerns the design and synthesis of natural product derivatives with therapeutic interest in order to develop new molecules with antiviral activity. Recently, aurones were identified as new inhibitors of hepatitis C virus (HCV) NS5B polymerase. Following these results, efforts were continuedand we undertook, on the one hand,the synthesis of original analogues in which the aurone B-ring was replaced by a heterocyclic rings and, on the other hand, the synthesis of aurone pseudodimers in order to refine the structural requirements to improve the inhibitory effect. The potent NS5B inhibitory activity combined with their low toxicity make aurones attractive drug candidates against HCV infection. The second part of the PhD thesis is unrelated to the first part and concerns more fundamental aspects. It focused on the synthesis of new surfactants acting as stabilizing agents during extraction of membrane proteins (PM). Surfactants are required for maintaining PM in their functional state after extraction from membrane lipid matrix. The vast majority of PM shares a net enrichment in basic residues at the interface between membrane and cytoplasm, a property known as the positive inside rule. Based on this feature, a new family of surfactants is developed and tested on membrane proteins belonging to the multidrug ABC efflux pumps family.

Les protéines membranaires (PMs) sont les composants fonctionnels principaux des membranes biologiques. Les processus cellulaires fondamentaux sont régulés à l’aide des PMs. Malgré leur importance et leur intérêt scientifique et pharmaceutique, les structures des PMs ne représentent qu’une partie mineure des structures 3D répertoriées. Les PMs humaines sont des cibles particulièrement intéressantes mais parmi plus de 7000 PMs humaines, seules 30 structures ont été élucidées.Les raisons principales qui rendent les PMs très difficiles à étudier sont leur faible abondance et leur nature hydrophobe. En effet, le niveau d’expression des PMs dans leur environnement naturel est habituellement faible et la surexpression hétérologue aboutit souvent à une protéine inactive.Les connexines font partie de la famille des PMs intégrales de vertébrés. Elles sont largement exprimées dans tout le corps et sont impliquées dans les processus essentiels à un fonctionnement physiologique normal. En s’oligomérisant elles établissent des canaux intercellulaires qui forment des jonctions lacunaires. La communication des jonctions lacunaires joue un rôle essentiel dans la fonction des tissus et le développement des organes. Ainsi, les mutations génétiques des connexines provoquent des désordres héréditaires. Les connaissances actuelles portent principalement sur la physiologie des connexines et la perméabilité des pores. Difficiles à produire pure, homogène et en quantité suffisante pour la cristallisation, l’unique structure de résolution atomique de jonction lacunaire est un polymère de la connexine 26. La connexine 43 (Cx43), protéine de jonction lacunaire la mieux étudiée, est exprimée dans tout le corps humain. Les études structurales de microscopie électronique ont montré que le domaine cytoplasmique C-terminal de Cx43 (Cx43CT) est flexible et diminue la qualité de diffraction des cristaux 2D. La troncation de la majorité de Cx43CT améliore la résolution des segments transmembranaires de Cx43. Tronqué au niveau du résidu 263, le mutant Cx43-263T est néanmoins capable de former des cristaux 2D et de s’assembler en jonctions lacunaires. L’œuvre présenté est consacré à l’étude de Cx43, Cx43-263T et Cx43CT.L’optimisation des codons du gène de la connexine et la minimisation de la stabilité de la structure secondaire d’ARNm ont considérablement augmenté l’expression de Cx43 et Cx43-263T. De nouvelles procédures de purification de Cx43-263T et Cx43 ont été élaborées. La protéine purifiée a été reconstituée en polymère amphiphile amphipol A8-35 et caractérisée par des approches de SEC, DLS et SAXS. Des techniques indépendantes ont montré l’auto-assemblage de Cx43-263T fonctionnelle en hexamères.Cx43 homogène a été surexprimée dans E. coli, purifiée et caractérisée par SEC, DLS, DSC et SAXS. L’oligomérisation a été mesurée en fonction de la concentration.Cx43-263T et Cx43 fusionnées à la protéine Mistic ont été surexprimées dans E. coli. La séparation de Mistic de la connexin a été testée avec différentes protéases, jonctions, conditions de clivage et soit in vivo soit in vitro. Toutes les constructions ainsi générées ont démontré une haute résistance aux protéolyses spécifiques. Mistic (membrane integrating sequence for translation of integral membrane protein constructs) est une séquence de protéine de B. subtilis, qui permet l'adressage des PMs intégrales dans la membrane. Mistic a été surexprimée chez E. coli et la protéine homogène a été purifiée avec divers détergents. Alors que la structure tertiaire de Mistic, solubilisée avec de l'oxyde de lauryldimethylamine, est déjà déterminée, la structure native de Mistic dans un milieu lipidique, qui permettrait de comprendre sa fonction, n’est pas encore disponible. Dans le travail présenté ici, Mistic a été reconstituée dans des lipides différents et utilisée pour des essais initiaux de cristallisation in meso. Mistic a de plus été utilisée pour la production d’anticorps anti-Mistic. / Membrane proteins (MPs) are major functional components of biological membranes. Keycellular processes are regulated with the help of MPs. Despite high importance and greatscientific and pharmaceutical interest, structures of MPs represent only a tiny fraction of all3D structures in Protein Data Bank. Human MPs are particularly challenging targets. Out ofmore than 7000 human MPs, structures of only about 30 were elucidated.The main reasons which make MPs so difficult to study are their low natural abundance andhydrophobic nature. Expression level of MPs in their natural sources is usually rather low.Heterologous overexpression often leads to inactive protein.Connexins comprise a family of vertebrate integral MPs that are widely expressed throughoutbody and involved in a wide variety of processes essential for normal physiological function.They are able to oligomerize and form intercellular channels which compose gap junctions.Gap junctional communication plays crucial role in normal tissue function and organdevelopment. Connexin gene mutations cause a number of inherited disorders.By now a wealth of knowledge is available about physiology of connexins and their channelpore permeability. However, atomic resolution structure of gap junction channel formed byonly one connexin family member (connexin 26) was determined. This is mostly explained bydifficulty to produce sufficient for crystallization amount of pure and homogenous protein.Connexin 43 (Cx43) is the best-studied gap junction protein, and it is widely expressedthroughout the human body. Initial structural studies by electron microscopy have shown thatflexible C-terminal cytoplasmic domain of Cx43 (Cx43CT) worsens diffraction quality of 2Dcrystals. Removal of most of the Cx43CT improved resolution of transmembrane segments ofCx43. Truncated at residue 263 mutant of Cx43 (Cx43-263T) still was able to form2D crystals and assembled into gap junctions. Thus, the present work is dedicated to the studyof three forms of Cx43, namely Cx43-263T, Cx43CT, and full-length Cx43.Performed in our work connexin gene optimization for E.coli codon bias and minimization ofstability of mRNA secondary structure significantly enhanced expression of Cx43 and Cx43-263T. Procedures for Cx43-263T and Cx43 purification were developed. The purified proteinwas reconstituted into amphipathic polymer amphipol A8-35 and characterized by SEC, DLS,and SAXS. Applied independent techniques showed self-assembling of purified Cx43-263Tinto hexamers demonstrating its functionality.Cx43CT was overexpressed in E.coli and purified to homogeneity. The protein wascharacterized by SEC, DLS, TSA, and SAXS. The concentration-dependent oligomerizationwas established.In the beginning of our project Cx43-263T and Cx43 were overexpressed in E. coli usingMistic fusion protein. A number of constructs providing various linkers and proteaserecognition sites were generated. To remove Mistic from the produced proteins in vivo and invitro cleavage were tested. All generated constructs demonstrated high resistance to specificproteolysis in wide range of conditions.Mistic (membrane integrating sequence for translation of integral membrane proteinconstructs) from B. subtilis was overexpressed in E.coli and purified to homogeneity usingdifferent detergents. While the tertiary structure of solubilized in lauryldimethylamine oxideMistic was determined earlier, the native structure of Mistic in lipid environment elucidatingits function is not available yet. In the present work Mistic was reconstituted into differentlipids and used for initial in meso crystallization trials. Additionally, Mistic was used forproduction of anti-Mistic antibodies.

Chaque cellule vivante sur notre Terre est entourée d'une membrane lipidique. Les protéines résidant dans la membrane exécutent multitude de fonctions essentielles pour la survivance de la cellule. Parmi eux sont le transport actif et passif dans et hors de la cellule, la signalisation et la catalyse des réactions.Une des plus grandes familles de protéines membranaires sont rhodopsins microbiennes, qui utilisent l'énergie de la lumière pour leur fonction. Les membres de cette famille comptent parmi eux les pompes de protons, cations et anions, entraînée par l'illumination, les canaux ioniques activés par l'illumination et, finalement, photorécepteurs. Bien que les aspects fondamentaux de leur fonctionnement ont été connus depuis un certain temps, il ya une abondance de questions sans réponse. Dans cette thèse, plusieurs structures de rhodopsines microbiennes (y compris la première structure de protéorhodopsine et la première structure de la pompe à sodium) sont présentés et analysés. Les structures ouvrent la voie pour comprendre les similitudes et les différences entre les différents rhodopsines microbiennes et pour exploiter cette connaissance pour créer de meilleurs instruments à base de rhodopsines microbiennes pour des applications biologiques, par exemple, dans le domaine de optogenetics.Alors que la première partie de ce travail porte sur les nouvelles structures de rhodopsines microbiennes, la deuxième partie présente l'approche de simulation pour comprendre la signalisation en fonction des rhodopsines sensorielles dans phototaxie. Les domaines HAMP des protéines transductrices des signals des rhodopsines sensorielles sont étudiés au moyen de la dynamique moléculaire, et il est démontré que les simulations peuvent être utilisés pour la construction et la validation des structures atomiques des domaines de signalisation, ainsi que pour la compréhension des changements conformationnels associée à signalisation, initié par les transformations des rhodopsine sensorielles.La troisième et la dernière partie décrit le travail sur la protéine IPCT-DIPPS de Archaeoglobus fulgidus, une enzyme catalysant deux étapes consécutives de di-inositol-phosphate biosynthèse. La structure résolue peut servir de modèle pour comprendre le mécanisme catalytique de transférases CDP-alcool, une grande famille de protéines comptant des milliers de membres, parmi lesquels sont cinq protéines humaines, qui catalysent les étapes majeures de la biosynthèse des lipides. La structure a également été utilisé pour prédire les sites de liaison des ligands sur le site actif de l'enzyme et pour proposer le mécanisme d'action catalytique.Pour résumer, cette thèse présente les études structurales de diverses protéines membranaires par la cristallographie aux rayons X et la modélisation qui font progresser notre compréhension des aspects fondamentaux et pratiques de fonctionnement des protéines membranaires. / Every living cell on Earth is surrounded by a lipid membrane. Proteins residing in the membrane perform a variety of functions crucial for the cell's survival. Among them are active and passive transport in and out of the cell, signaling and reaction catalysis.One of the largest membrane protein families are microbial rhodopsins, which utilize light energy for their function. Members of this family count among them light-driven proton, cation and anion pumps, light-gated ion channels and photoreceptors. While the basic aspects of their functioning have been known for some time, there is a plenty of unanswered questions. In this dissertation, several structures of microbial rhodopsins (among them the first proteorhodopsin structure and the first light-driven sodium pump structure) are presented and analyzed. The structures open the way for understanding the similarities and differences between the various microbial rhodopsins and for exploiting this understanding to create better microbial rhodopsin-based instruments for biological applications, for example, in the field of optogenetics.While the first part of this work deals with the novel structures of microbial rhodopsins, the second part presents the simulation approach for understanding the sensory rhodopsin-based signaling in phototaxis. The HAMP domains of the sensory rhodopsin transducer protein are studied by means of molecular dynamics, and it is demonstrated that the simulations may be used for building and validating the atomic structures of signaling domains, as well as for understanding the signaling-associated conformational changes, initiated by light-driven sensory rhodopsin transformations.The third and the last part describes the work on the Archaeoglobus fulgidus IPCT-DIPPS proteins, an enzyme catalyzing two consecutive steps of di-inositol-phosphate biosynthesis. The determined structure may serve as a model for understanding the catalytic mechanism of CDP-alcohol transferases, a large family of proteins counting thousands of members, among which are five human proteins that catalyze the major steps of lipid biosynthesis. The structure was also used to predict the binding sites of the ligands at the enzyme active site and to propose the mechanism of catalytic action.To sum up, this dissertation presents the structural studies of various membrane proteins by means of X-ray crystallography and modeling that advance our understanding of fundamental and practical aspects of membrane protein functioning.

Une nouvelle méthode pour la cristallisation des protéines membranaires (MP) de bicouches amphiphiles interconnectés (IAB) a été récemment mise au point. Dans cette approche protéines cristallisées directement des membranes et il est supposé que la cristallisation est conduite principalement par les propriétés de la mésophase lipidique dans son ensemble, mais pas par des caractéristiques individuelles des détergents. Le détergent joue un rôle de modulateur de ces propriétés. L'application de ce procédé de cristallisation de la vaste gamme des protéines membranaires est très prometteuse car il facilite considérablement la cristallisation. Cependant, il faut effectuer un certain nombre d'expériences pour chaque nouvelle protéine membranaire afin de déterminer les paramètres optimaux de la mésophase lipidique pour la protéine. Pour ce faire avec des quantités limitées de protéines membranaires, en particulier des protéines humaines, qui sont généralement très difficiles à produire en quantité suffisante, l'application des systèmes robotisés de cristallisation à haut débit pour la nano volume cristallisation pourrait être la seule solution. L'objectif principal de ce travail est le transfert de l'approche actuelle pour la cristallisation des protéines membranaires de l'IAB sur les volumes nano. Pour ce faire une grande variété d'expériences cristallisations a été effectuée pour différentes protéines membranaires. Les faits, qui influent des résultats de cristallisation, ainsi que des informations structurelles obtenues ont été analysées avec soin. Il a été démontré que les gros cristaux de protéines membranaires différents adaptés pour cristallographie aux rayons X peuvent être reproductible obtenu par nano volume cristallisation. Le premier chapitre «Introduction» comprend une description générale des protéines membranaires, des approches différentes pour la cristallisation des protéines membranaires, leurs avantages et leurs limites. La vue d'ensemble des protéines membranaires, qui sont étudiés dans ce travail, les informations disponibles et les problèmes non résolus sont présentés. Le deuxième chapitre présente les matériaux et les méthodes utilisées dans l'étude. Le troisième chapitre «Résultats et discussions» est décrit les résultats obtenus et leur interprétation. Pour commencer, la nano volume cristallisation de l'IAB de la bactériorhodopsine et la comparaison avec l'approche présent de cristallisation est présenté. Nano volume cristallisations en présence d'amphiphiles fluorés et les poloxamères ont été effectuées pour la première fois et décrit en détails. L'application de l'approche du nano volume cristallisation du complexe de la rhodopsine sensorielle II de Natronomonas pharaonis avec son transducteur apparenté et les protéines du complexe avec une mutation importante dans le transducteur, ce qui élimine l'action des protéines, est présenté. Résultats de nano volume cristallisation pour un autre complexe de deux protéines membranaires - triple mutant de la bactériorhodopsine, qui fonctionne comme un transducteur de signal, avec transducteur de Natronomonas pharaonis sont décrits. Halorhopsin de Natronomonas pharaonis a également été cristallisé par la nouvelle approche et de cristallisation résultats sont présentés. La première structure de protéine membranaire - enzyme cytidine-5'-triphosphate: inositol-1-phosphate cytidylyltransférase / di-myo-inositol-1 ,3-phosphate-1-phosphate synthéase de hyperthermophiles Archaeoglobus fulgidus a été résolu en utilisant des cristaux obtenus par nano volume cristallisation. Détails de la structure, l'importance et le mécanisme proposé de l'action enzymatique sont discutées. Les conclusions finales ainsi que les perspectives de la méthodique développées sont donnés dans le dernier chapitre de la thèse. / A new method for crystallization of membrane proteins (MPs) from interconnected amphiphilic bilayers (IAB) was recently developed. In this approach proteins crystallized directly from the membranes and it is postulated that crystallization is driving mostly by the properties of the lipidic mesophase as a whole but not by individual features of the detergents. The detergent plays a role of the modulator of these properties. Application of this crystallization method to the wide range of MPs is very promising since it dramatically facilitates crystallization. However, one needs to perform a number of screening experiments for each new MP to determine the optimal parameters of the lipidic mesophase for certain protein. To do so with limited amounts of MPs, especially human proteins, which are usually very difficult to produce in sufficient amount, the application of the high throughput robotic systems for nano volume crystallization could be the only solution. The major goal of this work is the transfer of the present approach for large scale crystallization of MPs from IAB to the nano volumes. To do so a large variety of crystallizations experiments were carried out for different MPs. The facts, which influence the crystallization results, as well as structural information obtained were carefully analyzed. It was demonstrated that large crystals of different MPs suitable for X-ray crystallography can be reproducibly obtained using this nano volume crystallization method. The first chapter “Introduction” includes a general description of MPs, different approaches for crystallization of MPs, their advantages and limitations. The overview of membrane proteins, which are studied in this work, the information available and unsolved problems are presented. The second chapter presents the materials and methods used in the study. The third chapter “Results and Discussions” describes the results obtained and their interpretation. To begin with, nano volume crystallization from IAB of bacteriorhodopsin and the comparison with large scale crystallization approach is presented. Detailed nano volume crystallizations in the presence of fluorinated surfactants and poloxamers were performed for the first time and described in details. The application of nano volume approach for the crystallization of the complex of sensory rhodopsin II from Natronomonas pharaonis with its cognate transducer and the proteins complex with important mutation in the transducer, which eliminates the action of the proteins, is presented. Nano volume crystallization results for another complex of two MPs – triple mutant of BR, which operates like a signal transductor, together with transducer from Natronomonas pharaonis are described. A light-driven chloride pump halorhopsin from Natronomonas pharaonis was also crystallized by new approach and crystallization results are presented. The structure of new MP – bifunctional enzyme cytidine-5′-triphosphate:inositol-1-phosphate cytidylyltransferase/ di-myo-inositol-1,3-phosphate-1-phosphate synthase from hyperthermophiles Archaeoglobus fulgidus was solved using the crystals obtained by nano volume crystallization from IAB. Structure details, significance and proposed mechanism of the enzymatic action are discussed. The final conclusions as well as the perspectives of the developed methods are given in the last chapter of the thesis.

La synthèse de l'adénosine triphosphate (ATP) est un événement clé dans la bioénergétique cellulaire. ATP synthesis est possible quand un gradient de potentiel électrochimique de protons est présent sur les membranes des cellules ou des organelles. Ce gradient est produit par les réactions d'oxydoréduction ou les réactions photochimiques qui sont contrôlées par l'enzyme. Bactériorhodopsine (bR) est la protéine la plus simple et la plus étudiée qui convertit l'énergie lumineuse en potentiel électrochimique. bR est un protéine transmembranaire de Halobacterium salinarum. bR absorbe des photons de lumière et transmet un proton à partir du cytoplasme vers l'espace extracellulaire. Grâce à sa disponibilité en relativement grandes quantités, la procédure de purification facile et stable, bR reste un des protéines membranaire les plus étudiés au cours des 40 dernières années.Pour comprendre le mécanisme moléculaire de la bR fonctionnement il faut connaître les changements structurels, provoqués par l'absorption de photon, qui accompagnent le cycle de travail des protéines et poussent à transporter le proton. Cela implique l'obtention des structures cristallographiques de bR état fonctionnel avec une résolution atomique. Selon cette approche, il est important d'avoir les cristaux protéiques très ordonnés et les méthodes de fixage des molécules de protéines dans les états intermédiaires. Les méthodes de fixage dans des conditions cryogéniques ont été développées précédemment. Les cristaux de la qualité désirée peuvent être obtenus par la cristallisation in meso où lipide mésophase bicontinue est utilisé pour la cristallisation des protéines membranaires.Le mécanisme de la cristallisation in meso est actuellement étudié pauvrement. Cette situation limite grandement son application potentielle pour des protéines membranaires. Malgré ses limites l’approche in meso a récemment permis d'obtenir les structures de base ainsi que les structures intermédiaires des états de bR. Cependant, différents groupes de scientifiques ont publié de différents structures cristallographiques des mêmes états intermédiaires. Les mécanismes de protons transport proposés par des auteurs différents sont contradictoires. Les raisons de l'absence de consensus dans les structures intermédiaires restent floues. Les raisons possibles discutées dans la littérature sont: la qualité insuffisante de la diffraction des cristaux protéiques, twinning merohedral et détérioration des cristaux par l'irradiation de rayonnement X, ainsi que la génération de nouvelles protéines états provoqués par rayons X.L'objectif de l'étude était de trier les raisons de contradictions dans le domaine de l'analyse cristallographique de bR états fonctionnels et de trouver des moyens de surmonter les problèmes connexes. Ceci implique plusieurs sous-objectifs distincts: l'étude de twinning merohedral de bR cristaux; étude des changements dans la structure bR induit par les 'irradiation de rayonnement X; étude des changements structurels dans bR par les petites doses de radiations. Un autre objectif de ce travail était d'étudier un rôle de molécules de la matrice de in meso cristallisation dans la stabilisation des cristaux de protéines membranaires. / The synthesis of adenosine triphosphate (ATP) is a key event in the cell bioenergetics. ATP synthesis is only possible when a proton electrochemical potential gradient is present on the membranes of cell or organelle. This gradient is produced by enzyme-controlled redox or photochemical reactions. Bacteriorhodopsin (bR) is the simplest and most studied protein that converts light energy into electrochemical potential. Being transmembrane protein of Halobacterium salinarum it absorbs light photon and transfers a proton from the cytoplasmic to the extracellular space. Due to its availability of relatively large quantities, easy purification procedure and protein stability bR remains one of the most extensively studied membrane proteins during the past 40 years.Current state of investigated problems. To understand the molecular mechanism of bR functioning is necessary to know the structural changes caused by light absorption which accompany the protein working cycle and lead to the directional transport of the proton. It implies obtaining of X-ray structures of bR functional states with atomic resolution. Following this approach it is important to have highly ordered three-dimensional protein crystals on the one hand and effective methods of trapping protein molecules in intermediate states on the other one. Trapping procedures for bR intermediate states under cryogenic conditions have been developed previously. Crystals of the desired quality can be obtained by in meso crystallization where lipid bicontinuous mesophase is used for the crystallization of membrane proteins. The mechanism of in meso crystallization is currently poorly investigated. This situation greatly limits its potential applicability for membrane proteins. Despite its limitations in meso approach have recently made possible to obtain the ground and some intermediate states structures of bR. However, different scientific groups have published different X-ray models of the same bR intermediate states. The proposed by different authors mechanisms of proton transport are contradictory. The reasons for the lack of the consensus in intermediate structures remain unclear. The possible reasons for this contradiction which have been discussed in literature are: insufficient quality of diffraction data, merohedral twinning and radiation damage of protein crystals, as well as the generation of new protein states caused by X-ray illumination.The aim of the study was to sort out the reasons for contradictions in the field of X-ray crystallographic analysis of bR functional states and to find ways to overcome related problems. This implies several separate subgoals: study of merohedral twinning of bR crystals; study of X-ray-radiation-induced changes in bR structure; study of low-dose radiation-induced structural changes in bR structure. An additional goal of the work was to study a role of molecules of the in meso crystallization matrix in the stabilization of membrane protein crystals.