Au moment de l'éjaculation, les spermatozoïdes sont exposés à des protéines sécrétées par le testicule, l'épididyme, les vésicules séminales et les glandes sexuelles accessoires. Tous ces tissus contribuent, de par leurs sécrétions, à la formation du plasma séminal. Malgré le fait que 70% des protéines totales qui constituent le plasma séminal proviennent de la famille des «heparin-binding proteins», nous avons mesuré de l'activité 3'-5'AMPc-PDE grâce à des essais enzymatiques. Après avoir déterminé les conditions optimales de l'essai (2uL de plasma séminal frais), nous avons mesuré une activité enzymatique de 11.35±0.85 fMol d'AMPc hydrolizé/minutes/u.g de protéines (n=18). De plus, nous avons réalisé la même expérience sur des aliquots du plasma séminal préalablement analysé et conservé à -80°C, après l'avoir décongelé une fois. Les données suggèrent que l'activité enzymatique totale n'est pas altérée dans ces conditions (10.05±3.96 fMol/min/ug protéines (n^lO). Aussi, en déterminant l'activité 3'-5' AMPc-PDE sensible à différents inhibiteurs nous avons constaté que l'activité totale est inhibée de 70% lorsque l'échantillon est en présence d'IBMX (7.16±0.87 fMol/min/ug de protéines), de 20% lorsqu'en présence de Cilostamide (1.68±0.27 fMol/min/ug de protéines) et de 50% lorsqu'en présence de Papaverine (4.8±0.53 fMol/min/ug de protéines). Ceci nous a permis de dresser le profil des PDE contribuant à l'activité totale dans le plasma séminal bovin. Grâce à une technique de chromatographie échangeuse d'ions, nous avons purifié la protéine responsable de l'activité 3'-5' AMPc-PDE prépondérante (PDE 10) dans le plasma séminal bovin. Afin de vérifier sa présence dans les fractions recueillies d'intérêt, nous avons réalisé des analyses d'immunobuvardages en utilisant un anti-PDE10 monoclonal. Les deux bandes immunoréactives détectées ont un poids moléculaire d'approximativement 75kDa et 65kDa. Finalement, nous avons extrait l'ARN des tissus suivants : testicule, tête et queue de l'épididyme et vésicules séminaux afin de vérifier si le transcrit de PDE 10 se retrouvaient dans ceux-ci. Nous avons détecté une bande à la hauteur attendue (502 paire de bases) pour tous les tissus et l'homologie des produits PCR avec la séquence prédite de Bos taurus (XM582454, pubmed) est de plus de 90%.

La fertilité mâle se définit comme étant la capacité de l'individu à produire des spermatozoïdes fonctionnels et à les livrer au tractus génital femelle. Les variations de fertilité interindividuelles sont tributaires de la proportion de spermatozoïdes fonctionnels d'un éjaculat. La fonctionnalité des spermatozoïdes étant modulée par leur composition biochimique, nous avons émis l'hypothèse que les spermatozoïdes issus d'individus fertiles présentaient un contenu protéique différent des spermatozoïdes issus d'individus sous-fertiles. Utilisant le modèle bovin, nous avons comparé la fraction «Triton soluble» du protéome de spermatozoïdes cryopréservés issus de taureaux de haute et de basse fertilité. Huit protéines montrant une différence entre les deux groupes de fertilité ont été identifiées par spectrométrie de masse. Parmi celles-ci, BSP1 et ELS PBP 1 étaient davantage présentes chez les spermatozoïdes issus de taureaux de basse fertilité. En centrifugeant de la semence cryopréservée sur un gradient discontinu de percoll, il est possible de séparer la population de spermatozoïdes motiles de la population de spermatozoïdes immotiles. BSP1 et ELS PBP 1 étaient toutes deux retrouvées en plus grande quantité dans la population de spermatozoïdes immotiles, laquelle est principalement composée de spermatozoïdes morts au cours du processus de cryopréservation. L'association de BSP1 et d'ELSPBPl avec la viabilité des spermatozoïdes a alors été investiguée. BSP1 est la protéine majeure du plasma séminal bovin et est acquise par le spermatozoïde lors de l'éjaculation. Dans la semence fraîchement éjaculée, la population de spermatozoïdes vivants était composée de deux sous-populations distinctes, distinguées par la présence ou l'absence de BSP1 sur la région acrosomale. Dans la semence cryopréservée, tous les spermatozoïdes présentant BSP1 sur la région acrosomale étaient morts. L'affinité de BSP1 pour la phosphatidylcholine et sa propension à modifier le contenu lipidique des membranes pourraient expliquer le lien de BSP1 avec la sensibilité des spermatozoïdes à la cryopréservation. ELS PBP 1 est acquise par le spermatozoïde au cours du transit épididymaire. Nos résultats ont montré qu'ELSPBPl était une sécrétion apocrine de l'épithélium épididymaire transférée spécifiquement aux spermatozoïdes morts. Le zinc s'est montré un cofacteur important de ce mécanisme de transfert. Ces résultats suggèrent qu'un mécanisme de contrôle de la qualité des spermatozoïdes est présent dans l'épididyme. tributaires de la proportion de spermatozoïdes fonctionnels d'un éjaculat. La fonctionnalité des spermatozoïdes étant modulée par leur composition biochimique, nous avons émis l'hypothèse que les spermatozoïdes issus d'individus fertiles présentaient un contenu protéique différent des spermatozoïdes issus d'individus sous-fertiles. Utilisant le modèle bovin, nous avons comparé la fraction «Triton soluble» du protéome de spermatozoïdes cryopréservés issus de taureaux de haute et de basse fertilité. Huit protéines montrant une différence entre les deux groupes de fertilité ont été identifiées par spectrométrie de masse. Parmi celles-ci, BSP1 et ELS PBP 1 étaient davantage présentes chez les spermatozoïdes issus de taureaux de basse fertilité. En centrifugeant de la semence cryopréservée sur un gradient discontinu de percoll, il est possible de séparer la population de spermatozoïdes motiles de la population de spermatozoïdes immotiles. BSP1 et ELS PBP 1 étaient toutes deux retrouvées en plus grande quantité dans la population de spermatozoïdes immotiles, laquelle est principalement composée de spermatozoïdes morts au cours du processus de cryopréservation. L'association de BSP1 et d'ELSPBPl avec la viabilité des spermatozoïdes a alors été investiguée. BSP1 est la protéine majeure du plasma séminal bovin et est acquise par le spermatozoïde lors de l'éjaculation. Dans la semence fraîchement éjaculée, la population de spermatozoïdes vivants était composée de deux sous-populations distinctes, distinguées par la présence ou l'absence de BSP1 sur la région acrosomale. Dans la semence cryopréservée, tous les spermatozoïdes présentant BSP1 sur la région acrosomale étaient morts. L'affinité de BSP1 pour la phosphatidylcholine et sa propension à modifier le contenu lipidique des membranes pourraient expliquer le lien de BSP1 avec la sensibilité des spermatozoïdes à la cryopréservation. ELS PBP 1 est acquise par le spermatozoïde au cours du transit épididymaire. Nos résultats ont montré qu'ELSPBPl était une sécrétion apocrine de l'épithélium épididymaire transférée spécifiquement aux spermatozoïdes morts. Le zinc s'est montré un cofacteur important de ce mécanisme de transfert. Ces résultats suggèrent qu'un mécanisme de contrôle de la qualité des spermatozoïdes est présent dans l'épididyme.

Suite à l’éjaculation, les spermatozoïdes ne sont pas aptes à féconder un ovocyte. Ces derniers doivent subir une maturation dans le tractus génital femelle afin d’acquérir le pouvoir fécondant soit la capacitation. Bien qu’elle fût découverte depuis plus de soixante ans, les modifications protéiques de la surface de la membrane des spermatozoïdes ne sont toujours pas complètement élucidées. Particulièrement chez le cheval et le porc, l’étude des protéines de surface des spermatozoïdes lors de la capacitation aurait un impact direct sur l’amélioration des techniques de reproduction avancées. La présente étude a pour premier objectif d’abord d’établir les meilleures conditions afin de promouvoir et caractériser la capacitation des spermatozoïdes équins et porcins en condition in vitro. Le deuxième objectif est d’optimiser un protocole d’isolement de protéines de surface des spermatozoïdes en utilisant la biotinylation. La démarche est de rendre ce processus complètement imperméable afin d’étudier seulement les protéines de surface. / After ejaculation spermatozoa must undergo a maturation to be able to fertilize an oocyte. The collective events that lead to this capability are named capacitation. Although capacitation was first discovered more than sixty years ago, the events and regulation of this maturation are still not fully understood. Also, the equine and porcine species has several reproductive issues believed to be caused by defects in sperm capacitation. Thus, the study of stallion sperm surface protein modification during capacitation could help to ameliorate advanced reproductive technologies in the horse and the pig. The aim of the first study was to establish the best in vitro conditions to promote horse sperm capacitation and to characterize the sperm using different tests. Our second objective was to optimize a surface biotinylation protocol to prevent biotin labeling of internal sperm proteins in order to study the surface membrane protein changes during capacitation.