Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Em etapa anterior a este trabalho, uma proteÃna purificada a partir do lÃtex da planta Calotropis procera foi purificada e sua caracterizaÃÃo bioquÃmica revelou ser esta uma proteÃna similar a osmotinas e que a mesma, denominada de CpOsm, exibia forte atividade contra fungos fitopatogÃnicos. Neste trabalho foram investigados sistemas de expressÃo heterÃlogos, procarionte e eucarionte, com o objetivo de estabelecer sistemas de expressÃo que pudessem produzir CpOsm recombinante e avaliar se sua expressÃo produzia a proteÃna ativa, com aÃÃo antifÃngica. A partir do sequenciamento do cDNA da CpOsm e ensaios de cristalizaÃÃo desenvolvidos com a proteÃna purificada do lÃtex foi possÃvel estudar suas caracterÃsticas moleculares. Para a expressÃo em E. coli foi utilizado o vetor pET303CT-His e P. pastoris o vetor pPICZαA. A proteÃna recombinante (rCpOsm) expressa no sistema procarionte nÃo foi secretada para o meio externo, acumulando-se no espaÃo intracelular, formando corpos de inclusÃo, nos quais a proteÃna estava insolÃvel. Embora a insolubilidade represente um passo limitante, este sistema de expressÃo pode ser muito interessante para a produÃÃo quantitativa de rCpOsm para outros fins como produÃÃo de anticorpos ou estudos de folding/refolding proteico, considerado suas caracterÃsticas moleculares peculiares, observadas nos estudos cristalogrÃficos, tais como o conjunto de pontes dissulfeto intracadeia. rCpOsm foi tambÃm expressa em cÃlulas de P. pastoris, entretanto o sistema de expressÃo deverÃ, necessariamente, sofrer melhorias para maximizar o rendimento. rCpOsm de P. pastoris foi inicialmente detectada por sequenciamento de novo por espectrometria de massas a partir da digestÃo trÃptica. A identificaÃÃo de peptÃdeos internos confirmou sua presenÃa no meio extracelular. A limitaÃÃo deu-se pela baixa taxa de expressÃo, o que, por conseguinte, nÃo permitiu uma caracterizaÃÃo mais ampla da rCpOsm deste sistema. rCpOsm expressa em P. postoris estava em sua forma ativa. Em uma anÃlise comparativa, rCpOsm e CpOsm, de modo e intensidade similares, foram capazes de alterar drasticamente a morfologia de esporos de F. solani e reduzir seu volume, comparados a esporos nÃo tratados, revelado atravÃs de microscopia de forÃa atÃmica. CpOsm foi cristalizada pelo mÃtodo de gota pendente e os cristais obtidos difrataram a uma resoluÃÃo de 1,61 à com caracterÃsticas morfolÃgicas do espaÃo cristalogrÃfico P6122. Os dados coletados sugerem que a proteÃna mantÃm uma estrutura em monÃmero, correspondendo a sequÃncia de aminoÃcidos do cDNA, com 203 resÃduos. A estrutura pode ser vista como trÃs regiÃes distintas, presentes em outras osmotinas jà descritas, formando um domÃnio central onde hà um conjunto de folhas beta, sendo este o mais longo, e dois outros menores, formados de estrutura predominantemente desordenadas com pequenos segmentos em alfa-hÃlice (domÃnio II) e longas alÃas (domÃnio III). Oito pontes dissulfeto estabilizam a estrutura e envolvem todos os resÃduos de cisteÃna da estrutura primÃria. NÃo hà evidencias cristalogrÃficas para formaÃÃo de oligÃmeros. Este estudo conclui que a expressÃo heterÃloga em sistema eucarionte produz rCpOsm ativa e isto representa uma etapa a mais cumprida para a sua possÃvel expressÃo em plantas com o objetivo de proteÃÃo contra fitopatÃgenos. / In a previous step to this work, a latex protein belonging to Calotropis procera was described. The protein, named CpOsm, exhibited biochemical characteristics closely related to pathogenesis related proteins joined into PR-5 group. The new protein with osmotin characteristics displayed activity against phytopatogenic fungi. Here, attempts to obtain a suitable heterologous system to express functional recombinant CpOsm were performed in Prokaryote and Eukaryote expression systems. Further, cDNA sequencing and crystallographic assays were performed using CpOsm and the molecular and structural properties of the functional protein. The vector pET303CT-His and PICZαA were used to express CpOsm in E. coli and P. pastoris, respectively. The ecombinant protein (rCpOsm) produced in the Prokaryote system was retained into E. oli cells and deposited as inclusion bodies. rCpOsm was insoluble. Although insoluble roteins into inclusion bodies represent an adverse phase for obtaining the active CpOsm, this system of expression can be interesting to other goals as quantitative roduction of rCpOsm for producing antibodies or to study protein folding/refolding, ince CpOsm possesses peculiar structural characteristics such as occurrence of an xtended network or intra chain disulfide bonds stabilizing the overall structure. rCpOsm as also successfully expressed in P. pastoris. However, this protocol must to undergo improvement in order to maximize yield. rCpOsm was initially detected in the P. pastoris expression system by MS/MS de novo sequencing after tryptic digestion. Identification of internal peptides present in the extracellular media confirmed the production and excretion of rCpOsm in P. pastoris cells. The very low yield of recombinant protein avoided enough amount of purified rCpOsm to perform a broad characterization. On a comparative basis, native CpOsm, purified of the latex, and rCpOsm, purified from P. pastoris cultures, at similar mode and intensity were capable of drastically alter the morphological architecture of spores of F.solani and reduced their olume as compared to non-treated spores, as revealed by atomic force microscopy measurements. CpOsm was crystallized by the pendant drop method and the crystals grown diffracted at 1.61 Ã. They fit on the P6122 space. The data collecting, supported by the cDNA deduced amino acid sequence suggested that CpOsm occurs as an monomeric structure composed of a unique chain of 203 amino acid residues and no evidences for quaternary association was seen. The overall structure can separated in three structural domains, which have been reported in other osmotins. The central region preserves the set of beta-sheets and is the largest. The others exhibit short segments on alpha-helix interconnected by randomized sequences (domain II). In domain III predominates randomized sequences and long loops. Eight disulfide bonds stabilize the structure and involve all cysteine residues of the primary sequence. The heterologous expression of CpOsm on Eukaryote system produces rCpOsm active and this support the hypothesis that rCpOsm is a suitable candidate for heterologous expression in plants in order to obtain improved crops against selected phytopatogens.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / As lectinas constituem ferramentas biotecnolÃgicas de fundamental importÃncia em estudos histoquÃmicos e citoquÃmicos para a detecÃÃo de glicoconjugados nos tecidos. Entre estas aplicaÃÃes, destacam-se a identificaÃÃo de receptores de membrana e a detecÃÃo de estruturas caracterÃsticas de neoplasias. A Frutalina, uma lectina -D-galactose-ligante encontrada em sementes de Artocarpus incisa, jà foi utilizada na detecÃÃo histoquÃmica de lesÃes malignas de mama e tireÃide. No presente trabalho foi realizada a clonagem e expressÃo do gene da frutalina em cÃlulas de Escherichia coli Origami (DE3) e foi determinada a estrutura tridimensional dessa proteÃna atravÃs da modelagem por homologia. A clonagem do gene da frutalina foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes em diferentes estÃgios de maturaÃÃo dos frutos de A. incisa. Foram obtidos 12 clones, dos quais 5 foram seqÃenciados. A lectina recombinante foi expressa como cadeia Ãnica, formada pela cadeia beta com 20 resÃduos, ligada a um peptÃdeo de ligaÃÃo com quatro resÃduos, e a cadeia alfa com 133 resÃduos. A expressÃo da lectina foi indicada pelo aparecimento de uma banda protÃica com massa molecular aparente de 19,2 kDa, superior a da lectina nativa (15 kDa), apÃs a induÃÃo com IPTG 1mM. A lectina recombinante foi mantida exclusivamente em corpos de inclusÃo e foi reconhecida imunologicamente por anticorpos policlonais anti-Frutalina. Os modelos gerados para os clones obtidos indicam que as mutaÃÃes ocorridas nÃo alteram os sÃtios de ligaÃÃo a carboidratos das molÃculas. As mutaÃÃes nos clones obtidos sugerem a ocorrÃncia de isoformas dessa proteÃna. / The lectins constitute biotechnological tools of fundamental importance in hystochemical and cytochemical studies for the detection of tissue glycoconjugates. Among their applications are the identification of membrane receptors and the detection of neoplastic characteristic structures. Frutalin, an -D-galactose-binding lectin from Artocarpus incise seeds, has already been used in the hystochemical detection of thyreoid and breast neoplasia. In this work was made a study of the cloning and expression of the frutalin gene in Escherichia coli Origami (DE3) cells and was determined the three-dimensional structure of this protein through homology modeling. The frutalin gene cloning was accomplished from the product on RT-PCR with seeds in distinct stages of development of the Artocarpus incisa fruits. Twelve clones were obtained, from which five were sequenced. The frutalin gene was expressed in E. coli using the pET15b expression vector. A recombinant lectin (rFrutalin) was expressed by growing the bacteria in the presence of isopropyl -D-thiogalactopyranoside 1mM. All the recombinant lectin was found in an insoluble aggregated form as inclusion bodies. The recombinant lectin had a higher molecular mass (19,2 kDa) than the native lectin (15 kDa) as estimated by SDS-PAGE and Western blot analyses, showing that the recombinant single chain Frutalin is not processed in E. coli cells. The models generated for the clones obtained indicate that the mutations do not change the molecules active sites. Mutations in the clones obtained suggest the occurrence of isoforms of this protein.