Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseASCF.pdf: 1203685 bytes, checksum: 09eb7536fd867598d8ede5a251ba023e (MD5) Previous issue date: 2004-11-26 / Universidade Federal de Minas Gerais / Plants seem to have developed, over a long period of time, defence mechanisms against fungi and insects. One of them is the use of protease inhibitor proteins. Cystatins are proteins that inhibit specifically cysteine proteases. They occur naturally in several vegetable species and it is believed that they work in the defence mechanism from plants against some pathogens. The Canecystatin gene which codifies a protein containing 106 amino acids residues, was identified in sugarcane and bears significant similarity with oryzacystatin, a cystatin from rice. The recombinant protein was expressed in E.coli in the soluble form, which promoted its direct purification by affinity chromatography in nickel column. The purified protein was analysed by Circular Dichroism (CD) and displayed estimated secundary structure similar to oryzacystatin I. Besides that, the protein was submitted to crystallization assay, and it was possible to form protein crystal, which will enable future studies by X-Ray Crystallography. Canecystatin, was used successfully in growth inhibition tests against the filamentous fungus Trichoderma reesei. The protein minimum inhibitory dose were about 50 µg/ml. The recombinant canecystatin was also able to inhibit plant pathogenic fungi including Colletotrichum sp P25, Colletotrichum sp P28, Colletotrichum sp P10, Fusarium moniliforme and Aspergillus niger. The most efficient inhibition was obtained against Colletotrichum sp P10 (32.25µg/ml). In order to obtain cystatin with improved activity direct evolution tests were carried out. A shuffling library was constructed using two diferent cystatins, i.e Canecystatin and Oryzacystatin I. One clone formed by this proteins was selected. This clone was expressed, purified and subjected to activity tests, and the results shown that the activity of mutant protein increased, in particular regarding its inhibit activity of Cathepsin B. Our findings open perspectives of using this protein as a natural fungicide and of developing more resistant varieties of sugarcane . / As plantas parecem ter desenvolvido ao longo da evolução mecanismos naturais de defesa contra fungos e insetos. Entre eles está o uso de inibidores de protease. Cistatinas são proteínas que inibem especificamente cisteíno proteases. Elas ocorrem naturalmente em várias espécies de vegetais e acredita-se que elas estejam envolvidas com mecanismos de defesa da planta contra o ataque de patógenos. O gene da Canacistatina que codifica uma proteína contendo106 resíduos de aminoácidos, foi identificado em cana-de-açúcar e possui significante similaridade de sequência com a Orizacistatina I, uma cistatina de arroz. A proteína recombinante foi expressa em E.coli na forma solúvel, o que possibilitou sua purificação direta por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. A proteína purificada foi analisada por Dicroísmo Circular que apresentou uma estrutura secundária estimada similar a proteína Orizacistatina I. Além disso, a proteína foi submetida a ensaios de cristalização e foi possível a formação de cristais protéicos, os quais serão utilizados para futuros estudos de cristalografia de Raio-X. A canacistatina foi utilizada com sucesso em testes de inibição de crescimento do fungo Trichoderma reesei. A dose mínima inibitória foi em torno de 50 µg/ml. A canacistatina recombinante também foi capaz de inibir o crescimento de fungos patogênicos incluindo Colletotrichum sp P25, Colletotrichum sp P28, Colletotrichum sp P10, Fusarium moniliforme e Aspergillus niger. A inibição mais eficiente foi obtida contra Colletotrichum sp P10 (32.25µg/ml). Para obtenção de uma cistatina com atividade melhorada, ensaios de evolução direta foram realizados. Uma biblioteca de shuffling foi construída utilizando duas cistatinas diferentes, a Canacistatina e a Orizacistatina I. Um clone formado por estas duas proteínas foi selecionado. Este clone foi expresso, purificado e submetido a testes de atividade e os resultados demostraram que a atividade do mutante aumentou e este inibe a atividade da catepsina B. Nossos resultados abrem perspectivas para o uso desta proteína como um fingicida natural e para o desenvolvimento de variedades mais resistentes de cana-de-açúcar.