A família PUF é um conjunto de proteínas que se ligam a mRNA regulando sua estabilidade e tradução em processos chave do desenvolvimento. Entre as 25 proteínas de Arabidopsis contendo as repetições PUF, três delas, APUM-I, APUM-2 e APUM-3, apresentam ~90% de identidade e colocalizam temporal e espacialmente nos meristemas apical e axilares de caule, zona de elongação da raiz e no periciclo durante a formação de calos e de raízes laterais, além de estames e polens. Ensaios de RT-PCR mostraram que a relação de expressão entre eles é a mesma em todos os órgãos analisados. Além disso, plantas nocautes apum-1- e apum-2- não apresentam fenótipo alterado, sugerindo redundância funcional. Plantas com a expressão dessas proteínas afetadas por RNA antisense apresentaram folhas cloróticas e reduzidas, raízes mais curtas e menos ramificadas e baixa fertilidade, fenótipo semelhante ao de plantas que superexpressam KRP-2, um inibidor de CDK. O transcrito KRP-2 apresenta um elemento de ligação AraPum no 3\'-UTR sugerindo ser um possível alvo para APUM. Em adição, plantas antisense têm aumento de transcritos KRP-2 em relação a selvagens. Assim, foi proposto que essas proteínas agem coordenando a formação de folhas e raízes pela influência na tradução de KRP-2. A função ancestral das proteínas PUF de manter o ciclo celular em detrimento da diferenciação, parece ser conservada em plantas. / The PUF family is a group of conserved proteins that bind to rnRNAs regulating its stability and translation in key developrnental processes. Among the twenty five Arabidopsis proteins with PUF repeats, we found that three highly similar members, APUM-I, APUM-2 and APUM-3 (~90% identity) and co-localize spatially and temporally in the shoot apical and axillaries meristems, root elongation zone and pericycle during callus and lateral root formation, as well as stamens and pollens. RTPCR assays showed that these proteins have similar expression profiles in ali organs analyzed. Moreover, plant apum-1 and apum-2 knockouts have no detectably altered phenotype, suggesting a functional redundancy between them. Plants in which APUM-I, APUM-2 and APUM-3 expression were reduced through antisense RNA, showed chlorotic and reduced leaves, shorter and less ramificated roots and low fertility. This phenotype is similar to that of plants over-expressing the KRP-2 gene, a CDK inhibitor. An AraPum binding element at 3\'-UTR of the KRP-2 transcript suggests that it may be a possible target for APUM. In addition, in comparison to wild-type plants, antisense plants have increased KRP-2 transcripts levels. We proposed that APUM proteins act by coordinating leaf and root formation by way of influencing KRP-2 transiation. The ancestral function of PUF proteins in the maintenance of the cell cycle, to detriment of differentiation, seems to be conserved in plants.

A família PUF é um conjunto de proteínas que se ligam a mRNA regulando sua estabilidade e tradução em processos chave do desenvolvimento. Entre as 25 proteínas de Arabidopsis contendo as repetições PUF, três delas, APUM-I, APUM-2 e APUM-3, apresentam ~90% de identidade e colocalizam temporal e espacialmente nos meristemas apical e axilares de caule, zona de elongação da raiz e no periciclo durante a formação de calos e de raízes laterais, além de estames e polens. Ensaios de RT-PCR mostraram que a relação de expressão entre eles é a mesma em todos os órgãos analisados. Além disso, plantas nocautes apum-1- e apum-2- não apresentam fenótipo alterado, sugerindo redundância funcional. Plantas com a expressão dessas proteínas afetadas por RNA antisense apresentaram folhas cloróticas e reduzidas, raízes mais curtas e menos ramificadas e baixa fertilidade, fenótipo semelhante ao de plantas que superexpressam KRP-2, um inibidor de CDK. O transcrito KRP-2 apresenta um elemento de ligação AraPum no 3\'-UTR sugerindo ser um possível alvo para APUM. Em adição, plantas antisense têm aumento de transcritos KRP-2 em relação a selvagens. Assim, foi proposto que essas proteínas agem coordenando a formação de folhas e raízes pela influência na tradução de KRP-2. A função ancestral das proteínas PUF de manter o ciclo celular em detrimento da diferenciação, parece ser conservada em plantas. / The PUF family is a group of conserved proteins that bind to rnRNAs regulating its stability and translation in key developrnental processes. Among the twenty five Arabidopsis proteins with PUF repeats, we found that three highly similar members, APUM-I, APUM-2 and APUM-3 (~90% identity) and co-localize spatially and temporally in the shoot apical and axillaries meristems, root elongation zone and pericycle during callus and lateral root formation, as well as stamens and pollens. RTPCR assays showed that these proteins have similar expression profiles in ali organs analyzed. Moreover, plant apum-1 and apum-2 knockouts have no detectably altered phenotype, suggesting a functional redundancy between them. Plants in which APUM-I, APUM-2 and APUM-3 expression were reduced through antisense RNA, showed chlorotic and reduced leaves, shorter and less ramificated roots and low fertility. This phenotype is similar to that of plants over-expressing the KRP-2 gene, a CDK inhibitor. An AraPum binding element at 3\'-UTR of the KRP-2 transcript suggests that it may be a possible target for APUM. In addition, in comparison to wild-type plants, antisense plants have increased KRP-2 transcripts levels. We proposed that APUM proteins act by coordinating leaf and root formation by way of influencing KRP-2 transiation. The ancestral function of PUF proteins in the maintenance of the cell cycle, to detriment of differentiation, seems to be conserved in plants.

Proteínas PUF regulam a estabilidade e a tradução através da ligação a seqüências específicas nas regiões 3\' não traduzidas (3\' UTR) dos mensageiros. A ligação é mediada por um domínio de ligação conservado constituído por 8 repetições de aproximadamente 36 aminoácidos cada. Experimentos realizados no sistema triplo-híbrido de levedura mostraram que os homólogos PUF de Arabidopsis APUM-1, APUM-2 e APUM-3 são capazes de ligar especificamente à seqüência chamada de Elemento de Resposta a NANOS (NRE) reconhecida pelo homólogo PUF de Drosophila. A utilização de bibliotecas de expressão de RNA em ensaios no sistema triplo-híbrido permitiu a identificação de seqüências de ligação consenso para as três proteínas APUM. Análises computacionais identificaram elementos de ligação a APUM em regiões 3\' UTR de importantes transcritos relacionados ao controle do meristema do caule e à manutenção das células totipotentes. Nós mostramos que os homólogos APUM-l, APUM-2 e APUM-3 reconhecem elementos de ligação a APUM nas regiões 3\' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-2. Ensaios de RT-PCR e Western blot semiquantitativos mostraram que a quantidade dos transcritos WUSHEL e CLAVATA-1 é alterada em plantas antisenso induzíveis para APUM-l, APUM-2 e APUM-3. A relevância biológica dessas interações foi observada através de ensaios de coimunoprecipitação, confirmando, portanto, o primeiro caso de regulação traducional descrito para os mensageiros WUSCHEL e CLAVATA-1. Análises computacionais adicionais para a identificação de outros homólogos PUF em Arabidopsis encontraram vinte e cinco proteínas possuindo repetições PUF. Entre elas, os homólogos APUM-4, APUM-S e APUM-6 apresentam alta similaridade com as proteínas APUM-l, APUM-2 e APUM-3, sendo capazes de ligar especificamente à seqüência NRE e aos elementos de ligação a APUM presentes nas regiões 3\' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-ts resultados indicam que vários homólogos PUF podem agir como reguladores traducionais em Arabidopsis através de um mecanismo molecular conservado entre as espécies, podendo abrir uma nova área de investigação da regulação de mRNA em plantas. / PUF proteins regulate stability and translation through sequence-specific binding to 3\' untranslated regions (UTR) oftarget mRNA transcripts. Binding is mediated by a conserved PUF domain which contains 8 repeats of approximately 36 amino acids each. Through three-hybrid assays, we have found that APUM-1, APUM-2 and APUM-3 Arabidopsis PUF homologs can bind specifically to the NANOS Response Element sequence (NRE) recognized by Drosophila PUF homologo Using Arabidopsis RNA libraries in three-hybrid screenings, we were able to identify APUM binding consensus sequences. A computational analysis allowed us to identify the APUM binding element within the 3\' UTR in many Arabidopsis transcripts, even in important mRNAs related to shoot and stem cell maintenance. We show that APUM-1, APUM-2 and APUM-3 are able to bind specifically to APUM binding elements in the 3\' UTR of WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE and FASCIATA-2 transcripts. RT-PCR and Western blot semiquantitatives assays showed altered WUSHEL and CLAVATA-1 amounts in APUM-1, APUM-2 and APUM-3 antisense plants. The biologic relevance of these interactions was observed with co-immunoprecipitation assay, which confirmed the first example of translational regulation to WUSCHEL and CLA VATA-1 transcripts. Computational analysis to identify others PUF homologs in Arabidopsis found twenty five proteins presenting PUF repeats. Among them, we found that APUM-4, APUM-S and APUM-6 homologs are very similar to APUM-1, APUM2 and APUM-3 and also are able to bind specifically to the NRE sequence and to APUM binding elements in the 3\' UTR of WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE and FASCIATA-2 transcripts. Our results indicate that the APUM proteins may act as regulators in Arabidopsis through an evolutionarily conserved mechanism, which may open up a new approach to investigate mRNA regulation in plants.

Proteínas PUF regulam a estabilidade e a tradução através da ligação a seqüências específicas nas regiões 3\' não traduzidas (3\' UTR) dos mensageiros. A ligação é mediada por um domínio de ligação conservado constituído por 8 repetições de aproximadamente 36 aminoácidos cada. Experimentos realizados no sistema triplo-híbrido de levedura mostraram que os homólogos PUF de Arabidopsis APUM-1, APUM-2 e APUM-3 são capazes de ligar especificamente à seqüência chamada de Elemento de Resposta a NANOS (NRE) reconhecida pelo homólogo PUF de Drosophila. A utilização de bibliotecas de expressão de RNA em ensaios no sistema triplo-híbrido permitiu a identificação de seqüências de ligação consenso para as três proteínas APUM. Análises computacionais identificaram elementos de ligação a APUM em regiões 3\' UTR de importantes transcritos relacionados ao controle do meristema do caule e à manutenção das células totipotentes. Nós mostramos que os homólogos APUM-l, APUM-2 e APUM-3 reconhecem elementos de ligação a APUM nas regiões 3\' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-2. Ensaios de RT-PCR e Western blot semiquantitativos mostraram que a quantidade dos transcritos WUSHEL e CLAVATA-1 é alterada em plantas antisenso induzíveis para APUM-l, APUM-2 e APUM-3. A relevância biológica dessas interações foi observada através de ensaios de coimunoprecipitação, confirmando, portanto, o primeiro caso de regulação traducional descrito para os mensageiros WUSCHEL e CLAVATA-1. Análises computacionais adicionais para a identificação de outros homólogos PUF em Arabidopsis encontraram vinte e cinco proteínas possuindo repetições PUF. Entre elas, os homólogos APUM-4, APUM-S e APUM-6 apresentam alta similaridade com as proteínas APUM-l, APUM-2 e APUM-3, sendo capazes de ligar especificamente à seqüência NRE e aos elementos de ligação a APUM presentes nas regiões 3\' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-ts resultados indicam que vários homólogos PUF podem agir como reguladores traducionais em Arabidopsis através de um mecanismo molecular conservado entre as espécies, podendo abrir uma nova área de investigação da regulação de mRNA em plantas. / PUF proteins regulate stability and translation through sequence-specific binding to 3\' untranslated regions (UTR) oftarget mRNA transcripts. Binding is mediated by a conserved PUF domain which contains 8 repeats of approximately 36 amino acids each. Through three-hybrid assays, we have found that APUM-1, APUM-2 and APUM-3 Arabidopsis PUF homologs can bind specifically to the NANOS Response Element sequence (NRE) recognized by Drosophila PUF homologo Using Arabidopsis RNA libraries in three-hybrid screenings, we were able to identify APUM binding consensus sequences. A computational analysis allowed us to identify the APUM binding element within the 3\' UTR in many Arabidopsis transcripts, even in important mRNAs related to shoot and stem cell maintenance. We show that APUM-1, APUM-2 and APUM-3 are able to bind specifically to APUM binding elements in the 3\' UTR of WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE and FASCIATA-2 transcripts. RT-PCR and Western blot semiquantitatives assays showed altered WUSHEL and CLAVATA-1 amounts in APUM-1, APUM-2 and APUM-3 antisense plants. The biologic relevance of these interactions was observed with co-immunoprecipitation assay, which confirmed the first example of translational regulation to WUSCHEL and CLA VATA-1 transcripts. Computational analysis to identify others PUF homologs in Arabidopsis found twenty five proteins presenting PUF repeats. Among them, we found that APUM-4, APUM-S and APUM-6 homologs are very similar to APUM-1, APUM2 and APUM-3 and also are able to bind specifically to the NRE sequence and to APUM binding elements in the 3\' UTR of WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE and FASCIATA-2 transcripts. Our results indicate that the APUM proteins may act as regulators in Arabidopsis through an evolutionarily conserved mechanism, which may open up a new approach to investigate mRNA regulation in plants.