Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-30Bitstream added on 2014-06-13T19:42:40Z : No. of bitstreams: 1 favaro_rg_dr_botib.pdf: 702142 bytes, checksum: 37419e284ee746774dfc59ce6ab27b1b (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Proteínas desacopladoras (UCPs; do inglês uncoupling proteins) são proteínas especializadas no transporte mitocondrial que desacoplam a respiração da síntese de ATP. UCPs geram um fluxo de prótons através da membrana mitocondrial interna, dependente de ácidos graxos e sensível a nucleotídeos purínicos (PN). No presente trabalho, foram realizados vários estudos empregando UCPs de plantas (pUCP). Inicialmente, foi empreendida a caracterização bioquímica de uma UCP de milho (Zea mays; ZmUCP), representativa de espécies monocotiledôneas. Essa proteína, quando expressa em Escherichia coli e reconstituída em lipossomos, foi capaz de induzir um fluxo de prótons dependente de ácido linoléico (LA) e sensível a ATP com valores de Km, Vmax e Ki similares àqueles observados para pUCPs de espécies dicotiledôneas. A ZmUCP foi utilizada para investigar a importância de um par de histidinas presente no segundo loop matricial da UCP1 de mamíferos e ausente nas pUCPs. A introdução do referido par de histidinas na ZmUCP (Lys155His e Ala157His) provocou um aumento na afinidade por LA enquanto que a sua atividade permaneceu inalterada. Em um estudo mais abrangente de estrutura-função, mutações pontuais nos resíduos Lys147, Arg155 e Tyr269, localizados nas chamadas assinaturas das UCPs, e Cys28 e His83, específicos para pUCPs, foram introduzidas na proteína AtUCP1 de Arabidopsis. Os efeitos de tais mutações nas propriedades bioquímicas da AtUCP1 foram examinados usando sistema de reconstituição em lipossomos. O resíduo Arg155 parece ser crucial para a afinidade da AtUCP1 por LA enquanto que His83 tem importante função na atividade de transporte. Os resíduos Cys28, Lys147, e também Tyr269, são importantes para a correta funcionalidade da AtUCP1, já que suas substituições... / Uncoupling proteins (UCPs) are specialized mitochondrial transporter proteins, which uncouple respiration from ATP synthesis. UCPs mediate a fatty acid (FA)-dependent, purine nucleotide (PN)-inhibitable proton flux across the inner membrane mitochondrial. In the present study, several assays on plant UCPs (pUCP) were performed. Firstly, we biochemically characterized an UCP from maize (Zea mays; ZmUCP), a representative uncoupling protein from monocot species. This protein was expressed in Escherichia coli and reconstituted in liposomes. ZmUCP was fully active and induced a linoleic acid-dependent proton flux that was sensitive to ATP. The obtained Km, Vmax and Ki values were similar to those observed for dicot pUCPs. ZmUCP was also used to investigate the importance of a histidine pair present in the second matrix loop of mammalian UCP1 and absent in pUCPs. ZmUCP with the introduced histidine pair (Lys155His and Ala157His) displayed increased LA-affinity while its activity remained unchanged. In a subsequent study using AtUCP1, point mutations were introduced in amino acid residues Lys147, Arg155 and Tyr269, located inside the so-called UCP-signatures, and Cys28 and His83, specific for pUCPs. The effects of amino acid replacements on AtUCP1 biochemical properties were examined using reconstituted liposomes. Residue Arg155 appears to be crucial for AtUCP1 affinity to LA whereas His83 plays an important role in transport activity. Residues Cys28, Lys147, and also Tyr269 are important for correct AtUCP1 function, as their substitutions affected either the AtUCP1 affinity to LA and its transport activity, or sensitivity to PN inhibitors. Furthermore, we analyzed the expression profiles of the six genes encoding pUCP in Arabidopsis thaliana (AtUCP1-6) in response to salt (NaCl) and osmotic (mannitol)... (Complete abstract click electronic access below)

A. fumigatus é um patógeno oportunista que causa infecções invasivas em hospedeiros imunocomprometidos. Estudos de respiração mitocondrial sugeriram a presença de componentes alternativos em sua cadeia respiratória envolvidos com processos de adaptação a ambientes adversos, como a proteína desacopladora (UCP). UCPs são proteínas mitocondriais cuja atividade dissipa o potencial de membrana gerado durante o transporte de elétrons. Um gene contendo características das três assinaturas moleculares das Proteínas Transferidoras de Energia foi clonado e sequenciado. O alinhamento das sequências genômica e de cDNA mostrou a presença de dois íntrons que, após o splicing, codifica uma proteína contendo 341 aminoácidos, com uma massa molecular de 37 kDa e um pI de 10,02. A fim de se avaliar as propriedades bioenergéticas da UCP-like, essa sequência foi clonada no vetor pYES2 e leveduras S. cerevisiae foram transformadas. Esferoplastos foram preparados e o potencial elétrico transmembrana mitocondrial foi estimado. Os resultados mostraram que o potencial de membrana de esferoplastos de leveduras expressando a proteína UCP-like foi ligeiramente menor e que o decréscimo momentâneo do potencial associado com a fosforilação do ADP foi mais lento quando comparado com o controle, indicando desacoplamento da respiração. Além disso, esse comportamento dos esferoplastos recombinantes foi similar ao controle quando GDP foi adicionado ao meio de reação, sugerindo uma inibição da proteína por esse composto. Para sua caracterização funcional em sistemas reconstituídos, a sequência foi clonada no vetor pET SUMO. A expressão foi realizada em E. coli e a proteína recombinante, purificada por cromatografia em resina de níquel, foi analisada por Western blot com anticorpos anti-(His)6-tag e anti-UCP2 e por espectrometria de massas. A formação dos lipossomos foi confirmada através de medidas de distribuição de partícula por espalhamento de luz dinâmico, as quais sugeriram a formação de vesículas estáveis. Em adição, foi investigada a participação da UCP-like na proteção do A. fumigatus contra danos oxidativos. O nível de mRNA foi determinado por PCR em tempo real na presença de paraquat e menadiona. Em A. fumigatus, a presença dessas drogas pró-oxidantes resultou em um aumento no nível de mRNA desse gene, sugerindo que essa proteína possa também fazer parte de um sistema de defesa antioxidante do fungo. / A. fumigatus is an opportunistic pathogen that causes invasive infections in immunocompromised hosts. Mitochondrial respiration studies suggested the presence of alternative components on its respiration chain, which are involved with the adaptation to hostile environments, such as the uncoupling protein (UCP). UCPs are mitochondrial proteins whose activity dissipates the membrane potential generated during electron transport. A gene containing features of three molecular signatures of Energy Carrier Protein was cloned and sequenced. The alignment between the cDNA and genomic DNA sequences revealed the existence of two introns which after splicing encodes a 341 amino acids protein with a molecular mass of 37 kDa and a pI of 10.02. In order to study bioenergetics properties of UCP-like, the cDNA sequence was cloned into pYES2 vector and transformed in S. cerevisiae. Spheroplasts were prepared and the mitochondrial electrical transmembrane potential was estimated. The results showed that, compared with control cells, mitochondrial electrical transmembrane potential of transformant spheroplasts was slightly smaller and the transient potential decrease associated with ADP phosphorylation was longer, indicating uncoupling of respiration. Moreover, this behavior of recombinant spheroplasts was similar to control cells when GDP was added to the reaction medium, suggesting the inhibition of uncoupling protein. For its functional characterization in reconstituted systems, the cDNA sequence was cloned into pET SUMO vector. The expression was carried out in E. coli and the recombinant protein, purified by chromatography on a nickel-chelating resin, was analyzed by Western blot using anti- (His)6-tag or UCP2 antibodies and by mass spectrometry. Liposome formation was confirmed by light scattering, suggesting the formation of stable vesicles. In addition, the participation of UCP-like in A. fumigatus protection against oxidative damage was investigated. mRNA level was determined by real time PCR in the presence of paraquat and menadione. In A. fumigatus, the presence of these pro-oxidants drugs resulted in increased mRNA level of this gene, suggesting that this protein might also be part of an antioxidant defense system of this fungus.

A. fumigatus é um patógeno oportunista que causa infecções invasivas em hospedeiros imunocomprometidos. Estudos de respiração mitocondrial sugeriram a presença de componentes alternativos em sua cadeia respiratória envolvidos com processos de adaptação a ambientes adversos, como a proteína desacopladora (UCP). UCPs são proteínas mitocondriais cuja atividade dissipa o potencial de membrana gerado durante o transporte de elétrons. Um gene contendo características das três assinaturas moleculares das Proteínas Transferidoras de Energia foi clonado e sequenciado. O alinhamento das sequências genômica e de cDNA mostrou a presença de dois íntrons que, após o splicing, codifica uma proteína contendo 341 aminoácidos, com uma massa molecular de 37 kDa e um pI de 10,02. A fim de se avaliar as propriedades bioenergéticas da UCP-like, essa sequência foi clonada no vetor pYES2 e leveduras S. cerevisiae foram transformadas. Esferoplastos foram preparados e o potencial elétrico transmembrana mitocondrial foi estimado. Os resultados mostraram que o potencial de membrana de esferoplastos de leveduras expressando a proteína UCP-like foi ligeiramente menor e que o decréscimo momentâneo do potencial associado com a fosforilação do ADP foi mais lento quando comparado com o controle, indicando desacoplamento da respiração. Além disso, esse comportamento dos esferoplastos recombinantes foi similar ao controle quando GDP foi adicionado ao meio de reação, sugerindo uma inibição da proteína por esse composto. Para sua caracterização funcional em sistemas reconstituídos, a sequência foi clonada no vetor pET SUMO. A expressão foi realizada em E. coli e a proteína recombinante, purificada por cromatografia em resina de níquel, foi analisada por Western blot com anticorpos anti-(His)6-tag e anti-UCP2 e por espectrometria de massas. A formação dos lipossomos foi confirmada através de medidas de distribuição de partícula por espalhamento de luz dinâmico, as quais sugeriram a formação de vesículas estáveis. Em adição, foi investigada a participação da UCP-like na proteção do A. fumigatus contra danos oxidativos. O nível de mRNA foi determinado por PCR em tempo real na presença de paraquat e menadiona. Em A. fumigatus, a presença dessas drogas pró-oxidantes resultou em um aumento no nível de mRNA desse gene, sugerindo que essa proteína possa também fazer parte de um sistema de defesa antioxidante do fungo. / A. fumigatus is an opportunistic pathogen that causes invasive infections in immunocompromised hosts. Mitochondrial respiration studies suggested the presence of alternative components on its respiration chain, which are involved with the adaptation to hostile environments, such as the uncoupling protein (UCP). UCPs are mitochondrial proteins whose activity dissipates the membrane potential generated during electron transport. A gene containing features of three molecular signatures of Energy Carrier Protein was cloned and sequenced. The alignment between the cDNA and genomic DNA sequences revealed the existence of two introns which after splicing encodes a 341 amino acids protein with a molecular mass of 37 kDa and a pI of 10.02. In order to study bioenergetics properties of UCP-like, the cDNA sequence was cloned into pYES2 vector and transformed in S. cerevisiae. Spheroplasts were prepared and the mitochondrial electrical transmembrane potential was estimated. The results showed that, compared with control cells, mitochondrial electrical transmembrane potential of transformant spheroplasts was slightly smaller and the transient potential decrease associated with ADP phosphorylation was longer, indicating uncoupling of respiration. Moreover, this behavior of recombinant spheroplasts was similar to control cells when GDP was added to the reaction medium, suggesting the inhibition of uncoupling protein. For its functional characterization in reconstituted systems, the cDNA sequence was cloned into pET SUMO vector. The expression was carried out in E. coli and the recombinant protein, purified by chromatography on a nickel-chelating resin, was analyzed by Western blot using anti- (His)6-tag or UCP2 antibodies and by mass spectrometry. Liposome formation was confirmed by light scattering, suggesting the formation of stable vesicles. In addition, the participation of UCP-like in A. fumigatus protection against oxidative damage was investigated. mRNA level was determined by real time PCR in the presence of paraquat and menadione. In A. fumigatus, the presence of these pro-oxidants drugs resulted in increased mRNA level of this gene, suggesting that this protein might also be part of an antioxidant defense system of this fungus.

En la acuicultura intensiva existe una práctica creciente encaminada a maximizar tanto el crecimiento como la productividad de los peces mediante altas densidades de producción, dietas altamente energéticas y elevados regímenes de alimentación. Sin embargo, debido al interés en aumentar los mecanismos de control y mejora del bienestar animal, es necesario encontrar nuevos marcadores que evalúen la actividad piscícola. En este sentido, el uso de marcadores mitocondriales de estrés oxidativo y lipotoxicidad constituyen una herramienta indispensable para evaluar los riesgos sobre el bienestar de los peces. Es importante reseñar que cada uno de estos marcadores ofrece una información complementaria e integradora de especial interés cuando se considera una determinada especie, tejido y factor de estrés. Uno de esos mecanismos es la chaperona mitocondrial de la familia de las proteínas de choque térmico 70 (proteína regulada por la glucosa 75, GRP75/mortalina), que protege a los componentes mitocondriales de las especies reactivas de oxígeno (ROS). Un segundo mecanismo es el llevado a cabo por las proteínas desacopladoras (UCP), una familia de transportadores mitocondriales que desacoplan la fosforilación oxidativa mediante la descarga neta del gradiente de protones y la disminución de la producción de ROS en un ambiente rico en ácidos grasos. La caracterización molecular de la GRP75/mortalina y las UCPs en dorada (Sparus aurata) reveló un alto grado de conservación de los rasgos estructurales y parentesco evolutivo de estas familias de proteínas. En el caso de la GRP75/mortalina, esto permitió el uso de anticuerpos heterólogos para el análisis de expresión a nivel de proteína. Sin embargo, para la UCP1 y UCP3 fue necesario la evaluación de la actividad mediante medidas de respiración mitocondrial y la producción de anticuerpos específicos. / Bermejo Nogales, A. (2012). MARCADORES MITOCONDRIALES DE ESTRÉS OXIDATIVO Y LIPOTOXICIDAD EN DORADA (Sparus aurata) [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/15189