BEZERRA, Camila Freitas. Propriedades toxicológicas e imunomoduladoras de proteínas laticíferas de Calotropis procera. 2017. 145 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Coordenação PGBioquímica (pg@bioquimica.ufc.br) on 2017-08-25T14:33:47Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_cfbezerra.pdf: 4291809 bytes, checksum: 5247178968ce0e96ccc0cdf45a51171b (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-09-25T20:15:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_cfbezerra.pdf: 4291809 bytes, checksum: 5247178968ce0e96ccc0cdf45a51171b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-25T20:15:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_cfbezerra.pdf: 4291809 bytes, checksum: 5247178968ce0e96ccc0cdf45a51171b (MD5) Previous issue date: 2017 / Calotropis procera (Ait.) R.Br is a lactiferous plant, recognized for its pharmacological properties. The latex soluble proteins (LP) of this plant present anti-inflammatory, antitumor, anti-arthritis, among others activities. Despite the studies carried out regarding the phytotherapic potential of LP, knowledge about its toxicological and immunomodulatory properties is still incipient. Preliminary study on the immunomodulatory potential of PL by subcutaneous and oral route showed that this fraction was able to induce immune response subcutaneously, with production of IgE and symptoms of anaphylaxis, but with almost no immune response orally. The objective of this study was to determine the toxicological and immunomodulatory potential of the latex of Calotropis procera. LP was processed and characterized for use in vivo assays. The toxicity tests were performed in oral and intraperitoneal Swiss mice, evaluating the behavioral, hematological, biochemical and histological profile. Immunomodulatory activity was determined by oral tolerance protocol in BALB / c mice, and the level of antibodies, cytokines, DTH and hematological and histological analyzes were quantified. Animals given up to 5000 mg/Kg orally exhibited almost no adverse effects on physiological, biochemical and hematological parameters, with LD 50 above 5000 mg/kg. Death (20%) was documented when LP (75 mg/Kg) was given in the peritoneum. Minor doses (35 and 15 mg / kg) were administered and deaths were not documented. Accordingly, PL was classified in category 3 with LD50 in the range of 50 to 300 mg / kg (OECD, No. 423). Suppression of the immune response through the oral tolerance process was confirmed by the lowering of IgE and IgG in the serum, IL-4 and IFN- in spleen homogenates and the absence of anaphylaxis signs. PL, orally, showed low toxicity and immunogenicity according to the toxicity and immunomodulation tests performed. By intraperitoneal route, however, it presented high toxicity mainly due to the proteolytic activity of the sample. Although oral tolerance has been achieved at the different doses studied, further studies should be performed to establish the safe use of PL. / Calotropis procera (Ait.) R.Br é uma planta laticífera, reconhecida por suas propriedades farmacológicas. As proteínas solúveis do látex (PL) desta planta apresentam atividades anti-inflamatórias, antitumoral entre outras. Apesar dos estudos realizados a respeito do potencial fitoterápico de PL, ainda são incipientes os conhecimentos sobre suas propriedades toxicológicas e imunomoduladoras. Estudo prévio a respeito do potencial imunomodulador de PL por via subcutânea e oral, mostrou que esta fração foi capaz de induzir resposta imune por via subcutânea, com produção de IgE e sinais de anafilaxia, entretanto quase sem resposta imune por via oral. O objetivo do trabalho foi determinar o potencial toxicológico e imunomodulador das proteínas do látex de Calotropis procera. PL foi processada e caracterizada para utilização de ensaios in vivo. Os ensaios de toxicidade foram realizados em camundongos Swiss, por via oral e intraperitoneal, avaliando o perfil comportamental, hematológico, bioquímico e histológico. A atividade imunomoduladora foi determinada através de protocolo de tolerância oral em camundongos BALB/c, sendo quantificado o nível de anticorpos, citocinas, DTH e realizado análises hematológicas e histológicas. Os animais que receberam doses de até 5000 mg/kg por via oral, não exibiram praticamente nenhum efeito adverso nos parâmetros fisiológicos, bioquímicos e hematológicos, apresentando uma DL50 acima de 5000 mg/kg. Entretanto, 20% de mortes foram registradas para a dose de 75 mg/kg por via intraperitoneal. Doses menores (35 e 15 mg/kg) foram administrada e mortes não foram registradas. Consequentemente, PL foi classificada na categoria 3, com DL50 na faixa de 50 a 300 mg/kg (OECD, N°423). Uma possível modulação supressora da resposta imune, através do processo de tolerância oral, foi observada com a redução da IgE e IgG no soro, IL-4 e IFN-γ em homogenato de baço e ausência de sinais de anafilaxia. PL, por via oral, apresentou baixa toxicidade e imunogenicidade de acordo com os ensaios de toxicidade e imunomodulação realizados. Por via intraperitoneal, entretanto, apresentou alta toxicidade devido, principalmente, a atividade proteolítica da amostra. Embora a tolerância oral tenha sido alcançada nas diferentes doses estudadas, mais estudos devem ser realizados para o estabelecimento do uso seguro de PL.

NASCIMENTO, Camila Tauane Monteiro do. Expressão heteróloga de uma osmotina laticífera e desenvolvimento de protocolos para extração da proteína recombinante a partir de corpos de inclusão. 2016. 93 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2016. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-19T15:11:48Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_ctmnascimento.pdf: 2987876 bytes, checksum: d61b36bc9503e63cca6a1c604887ad09 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:31:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_ctmnascimento.pdf: 2987876 bytes, checksum: d61b36bc9503e63cca6a1c604887ad09 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:31:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_ctmnascimento.pdf: 2987876 bytes, checksum: d61b36bc9503e63cca6a1c604887ad09 (MD5) Previous issue date: 2016 / In the previous step to this work, a protein identified as osmotin (CpOsm) was purified from Calotropis procera latex which showed strong antifungal activity. The protein was expressed in prokaryotic and eukaryotic systems, but a suitable protocol for purification has not been achieved. In the present work, from inclusion bodies (IB) obtained from Escherichia coli BL21 (DE3) proceeded to a survey by different solubilization protocols of proteins in an attempt to obtain the recombinant protein (rCpOsm) soluble, and then evaluates it as its activity and finally, exploring new methods for purification. The bacterial culture was induced at different conditions of temperature and time of induction. IB were subjected to chemical treatments with surfactants (CTAB; Cetrimide; ARG-12, a derivative surfactant Argenine) and a denaturing agent (guanidine hydrochloride); physical treatment by sonication and the enzymatic treatment with protease native C. procera latex. Electrophoresis assays suggested that two chemical surfactants were effective in solubilizing rCpOsm while not ARG-12. Although these cationic compounds solubilized rCpOsm more than other proteins of IB, while the sonication process samples produced with a greater variety of soluble proteins including rCpOsm. The enzymatic treatment showed that IB proteins are, in some range, digested while rCpOsm did not. All samples were evaluated for action on Colletotrichum gloeosporiodes after dialysis and lyophilization and showed inhibitory activity of spore germination and mycelial growth. However, it was shown that the activity could be related to the solubilising agents. Insoluble proteins obtained from E. coli containing the plasmid integrity, taken as a negative control showed no activity in these assays. The rCpOsm solubilized by CTAB was subjected to chromatography on Ni ++ column (Ni Sepharose 6 Fast Flow) pH 7.0; in hydrophobic media (FenilSepharose CL-4B) and ion exchange (Resource-S). None of the applied protocols resulted in the purification of rCpOsm and these data repeated what was observed previously for rCpOsm purified from Pichia pastoris. / Em etapa anterior a este trabalho, uma proteína identificada como osmotina (CpOsm) foi purificada do látex de Calotropis procera a qual apresentou forte atividade antifúngica. A proteína foi expressa em sistemas procarionte e eucarionte, mas um protocolo adequado para sua purificação não foi alcançado. No presente trabalho, partindo de corpos de inclusão (CI), obtidos de E. coli BL21(DE3) procedeu-se uma prospecção por diferentes protocolos de solubilização de suas proteínas, na tentativa de obter a proteína recombinante (rCpOsm) solúvel, para então avaliá-la quanto a sua atividade e por fim, prospectar novos métodos para sua purificação. A cultura bacteriana foi induzida em diferentes condições de temperatura e tempo de indução. Após 3 horas de indução a 37 °C, 180 rpm, os CI foram lisados e submetidos a tratamentos químicos com surfactantes (CTAB; Cetrimida; ARG-12: um surfactante derivado de argenina) e um agente desnaturante (Cloridrato de Guanidina); tratamento físico por sonicação (4 ciclos de 2,5 min. cada a 50% de potência) e tratamento enzimático com protease nativa do látex de C. procera. Ensaios de eletroforese sugeriram que os dois surfactantes químicos foram eficientes na solubilização de rCpOsm enquanto que ARG-12 não. Ainda, estes compostos catiônicos solubilizaram rCpOsm mais do que as demais proteínas dos CI, enquanto que o processo de sonicação produziu amostras com maior diversidade de proteínas solúveis, incluindo rCpOsm. O tratamento enzimático mostrou que proteínas de CI são, em algum alcance, digeridas enquanto que rCpOsm não. O efeito do tratamento dos CI com protease foi analisado por imagens de microscopia de força atômica e as diferenças de estrutura entre os CI tratados e não tratados documentados. Todas as amostras foram avaliadas quanto à ação sobre Colletotrichum gloeosporiodes após diálise e liofilização. Os produtos dos tratamentos com surfactantes apresentaram atividade antifúngica, demonstrando atividade inibitória de germinação de esporos e crescimento micelial. Entretanto, foi demonstrado que a atividade poderia estar relacionada aos agentes solubilizantes. Proteínas insolúveis obtidas de E. coli contendo o plasmídeo íntegro, tomadas como controle negativo, não apresentaram atividade nestes ensaios. A rCpOsm solubilizada com CTAB foi submetida a cromatografia em coluna de Ni++ (Ni Sepharose 6 Fast Flow) pH 7,0; em meio hidrofóbico (FenilSepharose CL-4B) e troca iônica (Resource-S). Nenhum dos protocolos aplicados resultou na purificação de rCpOsm e estes dados repetem o que foi observado previamente para a rCpOsm purificada a partir de Pichia pastoris.