Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T12:27:25Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Mestrado Final.pdf Rosimery.pdf: 719273 bytes, checksum: b4f8824614b283e70abb1c89cc2001f2 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T12:27:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação Mestrado Final.pdf Rosimery.pdf: 719273 bytes, checksum: b4f8824614b283e70abb1c89cc2001f2 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CNPq / Hemoderivados são medicamentos produzidos pelo fracionamento industrial do plasma humano. O principal método para purificação de proteínas plasmáticas humanas é baseado no método de precipitação com etanol desenvolvido por Cohn-Oncley. O uso de metodologias simples, de baixo custo e eficientes constitui um avanço tecnológico para obtenção desses hemoderivados. O objetivo deste trabalho foi imobilizar heparina comercial em Sephadex G-25 revestido com polianilina e posteriormente utilizar o derivado imobilizado como matriz de afinidade para purificação de proteínas do plasma humano. Para síntese do derivado imobilizado, Sephadex G-25 foi revestido com polianilina e tratado com glutaraldeído, em seguida, incubado com solução de heparina ativada com 1-etil-3-(dimetilaminopropil) carbodiimida e N-hidroxisuccinimida. A fim de determinar a influencia de variáveis na imobilização de heparina em Sephadex-polianilina, foi realizado planejamento experimental fatorial fracionário (24-1) no qual se avaliou quatro variáveis independentes: concentração e tempo de reação do glutaraldeído e concentração e tempo de reação da heparina. Nas condições otimizadas desses níveis, a heparina imobilizada em Sephadex-polianilina foi utilizada para purificação de proteínas do plasma humano. As variáveis concentração de glutaraldeído e concentração de heparina foram estatisticamente significativas na imobilização de heparina ao Sephadex-PANI e foi obtido melhor rendimento de heparina imobilizada (6,88 μg mg-1 suporte, equivalente a 45,9% da heparina ofertada) nas condições 1% (v v-1) de glutaraldeído, 1,5 h de reação com glutaraldeído, 1,5 mg mL-1 de concentração de heparina e 2 h de reação com heparina. Nessas condições obteve-se uma quantidade de proteínas plasmáticas de 25,02 – 27,06 μg mL-1, nos eluatos de NaCl 0,5 a 2,0 mol L-1. A presença de proteínas foi confirmada através da técnica eletroforética em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). O compósito sephadex-polianilina-heparina foi eficiente para purificação de proteínas do plasma, podendo ser usado como teste a antitrombina.

Atualmente a cucurbitacina E é considerada uma candidata a fármaco em razão de sua atividade anticâncer, reconhecimento de seus alvos moleculares e sinergismo com outros fármacos utilizados no tratamento do câncer. Porém, ainda não é possível seu uso na clínica devido a importantes lacunas na literatura relativas a ensaios de farmacocinética pré-clínicos e clínicos. A cucurbitacina E é hidrolisada a cucurbitacina I em plasma e em microssomas de fígado humano. O presente estudo visa avaliar a farmacocinética populacional e ligação as proteínas plasmáticas da cucurbitacina E e seu metabólito cucurbitacina I em plasma de ratos. O método de análise sequencial da cucurbitacina E e cucurbitacina I em plasma de ratos foi desenvolvido utilizando LCMS/ MS. Alíquotas de 50 ?L de plasma foram desproteinizadas com acetonitrila e os resíduos reconstituídos com acetonitrila:água (1:1, v/v) e adicionados do padrão interno clobazam. Os extratos foram injetados na coluna RP-18 com fase móvel constituída por mistura de acetonitrila:água:metanol (32:35:33, v/v/v). O método é preciso e exato com linearidade no intervalo de 1-100 ng de cucurbitacina E/mL de plasma e de 0,4-200 ng de cucurbitacina I/mL de plasma. O método foi aplicado na avaliação da farmacocinética da cucurbitacina E administrada a ratos machos Wistar em dose única oral (gavagem) e intravenosa de 1mg/kg dissolvida em DMSO e tampão fosfato salino pH 7,4 (5:95, v/v). As amostras seriadas de sangue foram coletadas até 24 h após a administração oral ou intravenosa. As concentrações plasmáticas de cucurbitacina E foram quantificadas até 16 h somente após a administração intravenosa, enquanto as concentrações plasmáticas de cucurbitacina I permaneceram abaixo dos valores de LIQ seguindo a administração oral ou intravenosa. O modelo de farmacocinética populacional foi desenvolvido para a cucurbitacina E administrada por via intravenosa com o auxílio do programa NONMEM com adequada qualidade de ajuste e desempenho preditivo. O perfil farmacocinético da cucurbitacina E administrada por via intravenosa foi descrito por modelo bicompartimental com distribuição e eliminação de primeira ordem com os seguintes parâmetros farmacocinéticos: tempo de liberação (D) de 0,45 h, volume de distribuição (Vd) de 27,22 L, clearance (Cl) de 4,13 L/h e meiavida de eliminação (t1/2) de 4,57 h. As interações da cucurbitacina E e cucurbitacina I com as albuminas séricas humana (HSA) e de rato (RSA) foram investigadas utilizando biossensor óptico baseado em ressonância de plasma de superfície (SPR) e espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Os dados de ligação das cucurbitacinas a albuminas foram obtidos por experimentos de competição de CD com biliverdina. Os dados de SPR revelaram um evento de ligação inédito entre a cucurbitacina I e a HSA e as afinidades de ligação da cucurbitacina E e cucurbitacina I são maiores para a RSA do que para a HSA. A cucurbitacina E e a cucurbitacina I podem ser classificadas como substâncias de alta afinidade de ligação com a HSA e com a RSA. A análise de CD mostrou que a cucurbitacina E e a cucurbitacina I modificam a ligação da biliverdina as albuminas através de modulação alostérica oposta (positiva para HSA, negativa para RSA), confirmando a necessidade de cuidados na extrapolação de dados farmacocinéticos pré-clínicos para clínicos. / Cucurbitacin E is currently considered a drug candidate due to its anticancer activity, recognition of its molecular targets, and synergism with other drugs used for cancer treatment. However, the use of cucurbitacin E in clinical practice is not possible because of important research gaps regarding its preclinical and clinical pharmacokinetic characteristics. Cucurbitacin E is hydrolyzed to cucurbitacin I in plasma and in human liver microsomes. The aim of this study was to evaluate the population pharmacokinetics and plasma protein binding of cucurbitacin E and of its metabolite cucurbitacin I in rats. The method for the sequential analysis of cucurbitacins E and I in rat plasma was developed using LC-MS/MS. Plasma aliquots of 50 ?L were deproteinized with acetonitrile, the residues were reconstituted in acetonitrile:water (1:1, v/v), and clobazam was added as internal standard. The extracts were injected into an RP-18 column using a mobile phase consisting of a mixture of acetonitrile:water:methanol (32:35:33, v/v/v). The method was precise and accurate, showing linearities at a range of 1-100 ng cucurbitacin E/mL plasma and of 0.4-200 ng cucurbitacin I/mL plasma. The method was applied to the pharmacokinetic evaluation of cucurbitacin E administered to male Wistar rats at a single oral (gavage) or intravenous dose of 1 mg/kg dissolved in DMSO and phosphate-buffered saline, pH 7.4 (5:95, v/v). Serial blood samples were collected up to 24 h after oral or intravenous administration. The plasma concentrations of cucurbitacin E were quantified up to 16 h only after intravenous administration, while the plasma concentrations of cucurbitacin I remained below the limit of quantification after oral or intravenous administration. The population pharmacokinetic model was developed for administered intravenously cucurbitacin E using the NONMEM program, with adequate goodness of fit and predictive performance. The pharmacokinetic profile of intravenously administered cucurbitacin E was described by a two-compartment model with first-order distribution and elimination. The following pharmacokinetic parameters were obtained: release time (D) of 0.45 h, volume of distribution (Vd) of 27.22 L, clearance (Cl) of 4.13 L/h, and elimination half-life (t1/2) of 4.57 h. The interactions of cucurbitacin E and I with human (HSA) and rat (RSA) serum albumins were investigated using an optical biosensor by surface plasmon resonance (SPR) and circular dichroism (CD) spectroscopy. The binding data of the cucurbitacins to albumins were obtained by CD competition experiments with biliverdin. The SPR data revealed an undescribed binding event between cucurbitacin I and HSA and the binding affinities of cucurbitacin E and cucurbitacin I were higher for RSA than for HSA. Cucurbitacin E and cucurbitacin I can be classified as substances with high binding affinity for HSA and RSA. CD analysis showed that cucurbitacin E and cucurbitacin I modify the binding of biliverdin to albumins through opposite allosteric modulation (positive for HSA, negative for RSA), confirming that care should be taken when extrapolating the pharmacokinetic data between species.

Atualmente a cucurbitacina E é considerada uma candidata a fármaco em razão de sua atividade anticâncer, reconhecimento de seus alvos moleculares e sinergismo com outros fármacos utilizados no tratamento do câncer. Porém, ainda não é possível seu uso na clínica devido a importantes lacunas na literatura relativas a ensaios de farmacocinética pré-clínicos e clínicos. A cucurbitacina E é hidrolisada a cucurbitacina I em plasma e em microssomas de fígado humano. O presente estudo visa avaliar a farmacocinética populacional e ligação as proteínas plasmáticas da cucurbitacina E e seu metabólito cucurbitacina I em plasma de ratos. O método de análise sequencial da cucurbitacina E e cucurbitacina I em plasma de ratos foi desenvolvido utilizando LCMS/ MS. Alíquotas de 50 ?L de plasma foram desproteinizadas com acetonitrila e os resíduos reconstituídos com acetonitrila:água (1:1, v/v) e adicionados do padrão interno clobazam. Os extratos foram injetados na coluna RP-18 com fase móvel constituída por mistura de acetonitrila:água:metanol (32:35:33, v/v/v). O método é preciso e exato com linearidade no intervalo de 1-100 ng de cucurbitacina E/mL de plasma e de 0,4-200 ng de cucurbitacina I/mL de plasma. O método foi aplicado na avaliação da farmacocinética da cucurbitacina E administrada a ratos machos Wistar em dose única oral (gavagem) e intravenosa de 1mg/kg dissolvida em DMSO e tampão fosfato salino pH 7,4 (5:95, v/v). As amostras seriadas de sangue foram coletadas até 24 h após a administração oral ou intravenosa. As concentrações plasmáticas de cucurbitacina E foram quantificadas até 16 h somente após a administração intravenosa, enquanto as concentrações plasmáticas de cucurbitacina I permaneceram abaixo dos valores de LIQ seguindo a administração oral ou intravenosa. O modelo de farmacocinética populacional foi desenvolvido para a cucurbitacina E administrada por via intravenosa com o auxílio do programa NONMEM com adequada qualidade de ajuste e desempenho preditivo. O perfil farmacocinético da cucurbitacina E administrada por via intravenosa foi descrito por modelo bicompartimental com distribuição e eliminação de primeira ordem com os seguintes parâmetros farmacocinéticos: tempo de liberação (D) de 0,45 h, volume de distribuição (Vd) de 27,22 L, clearance (Cl) de 4,13 L/h e meiavida de eliminação (t1/2) de 4,57 h. As interações da cucurbitacina E e cucurbitacina I com as albuminas séricas humana (HSA) e de rato (RSA) foram investigadas utilizando biossensor óptico baseado em ressonância de plasma de superfície (SPR) e espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Os dados de ligação das cucurbitacinas a albuminas foram obtidos por experimentos de competição de CD com biliverdina. Os dados de SPR revelaram um evento de ligação inédito entre a cucurbitacina I e a HSA e as afinidades de ligação da cucurbitacina E e cucurbitacina I são maiores para a RSA do que para a HSA. A cucurbitacina E e a cucurbitacina I podem ser classificadas como substâncias de alta afinidade de ligação com a HSA e com a RSA. A análise de CD mostrou que a cucurbitacina E e a cucurbitacina I modificam a ligação da biliverdina as albuminas através de modulação alostérica oposta (positiva para HSA, negativa para RSA), confirmando a necessidade de cuidados na extrapolação de dados farmacocinéticos pré-clínicos para clínicos. / Cucurbitacin E is currently considered a drug candidate due to its anticancer activity, recognition of its molecular targets, and synergism with other drugs used for cancer treatment. However, the use of cucurbitacin E in clinical practice is not possible because of important research gaps regarding its preclinical and clinical pharmacokinetic characteristics. Cucurbitacin E is hydrolyzed to cucurbitacin I in plasma and in human liver microsomes. The aim of this study was to evaluate the population pharmacokinetics and plasma protein binding of cucurbitacin E and of its metabolite cucurbitacin I in rats. The method for the sequential analysis of cucurbitacins E and I in rat plasma was developed using LC-MS/MS. Plasma aliquots of 50 ?L were deproteinized with acetonitrile, the residues were reconstituted in acetonitrile:water (1:1, v/v), and clobazam was added as internal standard. The extracts were injected into an RP-18 column using a mobile phase consisting of a mixture of acetonitrile:water:methanol (32:35:33, v/v/v). The method was precise and accurate, showing linearities at a range of 1-100 ng cucurbitacin E/mL plasma and of 0.4-200 ng cucurbitacin I/mL plasma. The method was applied to the pharmacokinetic evaluation of cucurbitacin E administered to male Wistar rats at a single oral (gavage) or intravenous dose of 1 mg/kg dissolved in DMSO and phosphate-buffered saline, pH 7.4 (5:95, v/v). Serial blood samples were collected up to 24 h after oral or intravenous administration. The plasma concentrations of cucurbitacin E were quantified up to 16 h only after intravenous administration, while the plasma concentrations of cucurbitacin I remained below the limit of quantification after oral or intravenous administration. The population pharmacokinetic model was developed for administered intravenously cucurbitacin E using the NONMEM program, with adequate goodness of fit and predictive performance. The pharmacokinetic profile of intravenously administered cucurbitacin E was described by a two-compartment model with first-order distribution and elimination. The following pharmacokinetic parameters were obtained: release time (D) of 0.45 h, volume of distribution (Vd) of 27.22 L, clearance (Cl) of 4.13 L/h, and elimination half-life (t1/2) of 4.57 h. The interactions of cucurbitacin E and I with human (HSA) and rat (RSA) serum albumins were investigated using an optical biosensor by surface plasmon resonance (SPR) and circular dichroism (CD) spectroscopy. The binding data of the cucurbitacins to albumins were obtained by CD competition experiments with biliverdin. The SPR data revealed an undescribed binding event between cucurbitacin I and HSA and the binding affinities of cucurbitacin E and cucurbitacin I were higher for RSA than for HSA. Cucurbitacin E and cucurbitacin I can be classified as substances with high binding affinity for HSA and RSA. CD analysis showed that cucurbitacin E and cucurbitacin I modify the binding of biliverdin to albumins through opposite allosteric modulation (positive for HSA, negative for RSA), confirming that care should be taken when extrapolating the pharmacokinetic data between species.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2017-05-05T16:57:11Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_Aryse_Martins.pdf: 857909 bytes, checksum: 6af8a55ce9256458f340496528f323af (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-05-05T17:12:02Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_Aryse_Martins.pdf: 857909 bytes, checksum: 6af8a55ce9256458f340496528f323af (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-05T17:12:02Z (GMT). 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O estudo do tipo caso-controle retrospectivo foi realizado com pinguins em reabilitação no Centro de Recuperação de Animais Marinhos, (CRAM-FURG) em Rio Grande, Rio Grande do Sul, Brasil, os quais foram classificados em dois grupos, sendo o grupo caso composto por pinguins com aspergilose, confirmada post mortem a partir de achados necroscópicos associados ao cultivo microbiológico e a histopatologia, e o grupo controle composto por pinguins sadios, que foram liberados. Para a determinação das curvas, foram coletados dados de nove amostras sequenciais, realizadas em média a cada sete dias, durante um período máximo de 81 dias, sendo estes submetidos a análise de variância (ANOVA) com teste post-hoc de Bonferroni. Ao todo, 140 animais foram estudados (50% casos e 50% controles). Pinguins com aspergilose diferiram significativamente do grupo controle em todos os parâmetros analisados. O peso médio, na primeira coleta foi de 2.747g no grupo caso e 2.875g no grupo controle. Os animais com aspergilose apresentaram média de peso menor que animais liberados ao longo de toda a reabilitação. O ganho de peso dos animais com aspergilose ocorreu somente nas três primeiras coletas, com estabilização ou perda de peso nas coletas posteriores, até seu desfecho. Em relação ao hematócrito (Ht) o valor médio na primeira coleta, foi de 38% e 44% nos grupos caso e controle, respectivamente. No grupo de pinguins com aspergilose foi detectado um declínio progressivo na curva dos valores de Ht ao longo do período de reabilitação, os quais permaneceram abaixo do limite inferior de referência para a espécie (42% ± 4%) desde a terceira coleta até seu desfecho, enquanto o grupo controle apresentou valores dentro da referência para a espécie em todas as coletas. A primeira coleta de dados de PPT demonstrou um valor médio similar, de 6,4g/dL e 6g/dL, entre os grupos caso e controle, respectivamente. No entanto, na análise da curva, o grupo com aspergilose apresentou aumento progressivo desses valores durante toda a reabilitação, alcançando um valor médio de 10,3g/dL na nona coleta, diferentemente do grupo controle, que permaneceu estável a partir da sexta coleta, com valores entre 7,9 e 8g/dL. Neste trabalho podemos observar que estes parâmetros, além de serem critérios para liberação de pinguins também podem ser utilizados como indicadores de animais potencialmente infectados, uma vez que o resultado das curvas geradas a partir das análises mostraram diferenças pontuais no grupo de pinguins com aspergilose quando comparado com animais sadios. O estabelecimento desse perfil pode servir como parâmetro para início de terapia preemptiva para aspergilose ou de investigação diagnóstica mais específica. / Basic blood parameters and body weight are routinely used to monitor the general condition of Magellanic penguins in rehabilitation, including being considered criteria for release in accordance with established protocols. However, studies showing the variation of these parameters during the development of aspergillosis in these animals is not known. Thus, this study aimed to determine the curve of weight, hematocrit (Ht) and total plasma proteins (PPT) in penguins with aspergillosis. The study of retrospective case-control was carried out with penguins during rehabilitation at Centro de Recuperação de Animais Marinhos (CRAM-FURG) in Rio Grande, Rio Grande do Sul, Brazil, which were classified into two groups: the case group composed by penguins with aspergillosis, confirmed post mortem from necroscopic findings associated with microbiological culture and histopathology, and the control group consisted by healthy penguins, which were released. For the determination of the curves, data were collected from nine sequential samples, performed on average every seven days for a maximum period of 81 days, which underwent to analysis of variance (ANOVA) with post-hoc Bonferroni. A total of 140 animals were studied (cases 50% and 50% control). Penguins with aspergillosis were significantly different from the control group in all analyzed parameters. The average weight in the first collection was 2.747g in the case group, and 2.875g in the control group. Animals with aspergillosis showed a lower mean weight than animals released throughout the rehabilitation. The weight gain of the animals with aspergillosis occurred only in the first three collections, with stabilization or weight loss in later collections until the last collection. Regarding the hematocrit (Ht) the average value in the first collection, was 38% and 44% in the case and control groups, respectively. In the group of penguins with aspergillosis a progressive decline was detected in the curve of Ht values throughout the rehabilitation period, which remained below of the lower reference limit for the specie (42% ± 4%) from the third until the last collection, while the control group had values within the reference for the specie in all samples. The first collection of PPT data showed a similar average value of 6.4g/dL and 6g/dL, between case and control groups, respectively. However, the analysis of the curve of the group with aspergillosis showed progressive increase of these values throughout the rehabilitation, reaching an average of 10,3g / dL in the ninth collection, unlike the control group, which remained stable since the sixth collection, values between 7.9 and 8 g / dL. In this work we can see that these parameters besides being penguins criteria for release can also be used as indicators of potentially infected animals, as a result of the curves generated from the analysis showed significant differences in penguins group with aspergillosis when compared with healthy animals. The establishment of this profile can be used as parameters for early preemptive therapy for aspergillosis or more specific diagnosis.