Barley (Hordeum vulgare L.) is the fourth largest produced cereal worldwide. About two thirds of barley production is used to animal feed. When used to feed monogastric animals, the main shortcoming of barley grains is the deficiency of essential amino acids, especially lysine, threonine and methionine. The unbalanced amino acid composition is due to the main storage protein, the hordeins, which account for about 50% of total grain protein content. The nitrogen fertilization promotes C-hordein expression and accumulation, the hordein subgroup with the lowest content of essential amino acids, and the highest content of non-essential amino acids. Due to the importance of grain protein content and composition in the end use grain quality the key objective of the present study was to obtain a detailed insight into synthesis and accumulation of barley grain proteins and their relation to improved nutritional quality. An integrated proteomic and transcriptomic analysis have been undertaken in a set of transgenic antisense barley lines with the grain protein profile altered in comparison to the non-transgenic line cv. Golden Promise. The results were presented in three manuscripts in the thesis (chapters 2, 3 and 4). The first manuscript (chapter 2) reported a new grain protein extraction method combined with multi-method protein evaluation, including biochemical quantification, amino acid composition, sodium dodecyl-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) couple with mass spectrometry (MS) identification and a gel free shotgun MS identification and relative quantification. The results showed the changeability of proteins between protein groups and the importance of choosing an adequate proteomic-based method for protein identification according to the complexity of protein mixtures. In the second manuscript (chapter 3) a differential protein profile of non-transgenic barley cv. Golden Promise and the transgenic antisense C-hordein barley lines was achieved by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) for salt soluble proteins and the differentially expressed proteins were identified by MS. The key results showed that the suppression of C-hordeins, the poor nutritional hordein subgroup, does not exclusively affects hordein synthesis and accumulation, and that the more balanced amino acid composition of these lines may be a consequence of distinct protein sources among different transgenic events, though a stable lysine-rich proteins upregulation occurs in all lines. In the third manuscript (chapter 4) the effects of nitrogen fertilization on hordein family at transcriptional and proteome level were assessed. The main results showed differential responses to N nutrition between non-transgenic and transgenic lines. In relation to C-hordein, specific C-hordein downregulation effect and in particular different responses to N were verified among subgroups of C-hordein multigene family in the transgenic line at transcriptional and proteomic level. In summary, the multi-method strategy used in the present work was successfully applied to obtain comprehensive information about barley grain proteins synthesis and accumulation and explain, at least in part, their relation to improved nutritional quality. These results can be useful in barley breeding programs aiming selective alterations of specific alleles/homologues to change amino acid composition by changing the relative proportions of the grain proteins in order to improve the barley grains nutritional quality. / A cevada (Hordeum vulgare L.) é o quarto cereal mais produzido no mundo. Cerca de dois terços desta produção é utilizada na alimentação animal. A principal desvantagem dos grãos de cevada na alimentação de animais monogástricos é a deficiência de aminoácidos essenciais, principalmente lisina, treonina e metionina. Esta composição desfavorável ocorre devido à principal proteína de reserva dos grãos, as hordeínas, que representam cerca de 50% do teor total de proteína no grão. O nitrogênio promove a expressão e o acúmulo de C-hordeínas, o subgrupo com o menor teor de aminoácidos essenciais e o maior teor de aminoácidos não essenciais. Devido à importância do teor e composição de proteínas nos grãos na determinação de sua qualidade no uso final, o principal objetivo do presente trabalho foi obter uma visão detalhada sobre a síntese e acúmulo de proteínas de grãos de cevada e sua relação com a melhoria da qualidade nutricional. Análises proteômicas e transcriptômicas integradas foram realizadas em um conjunto de linhagens transgênicas de cevada com o perfil de proteínas de reserva alterados em comparação à linhagem não transgênica cv. Golden Promise. Os resultados foram apresentados na forma de três manuscritos (capítulos 2, 3 e 4). O primeiro (capítulo 2) descreveu um novo método de extração de proteínas dos grãos em combinação com métodos de estudo de proteínas diversos, incluindo a quantificação bioquímica, composição de aminoácidos, eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) seguido de identificação por espectrometria de massas (MS) e estratégia shotgun para identificação e quantificação relativa das proteínas. Os resultados mostram a mutabilidade das proteínas entre os diferentes grupos e a importância da escolha de um método adequado para a sua identificação de acordo com a complexidade das misturas proteicas. No segundo manuscrito (capítulo 3) o perfil proteico diferencial da linhagem não transgênica e transgênica foi obtido por eletroforese bidimensional (2-DE) para proteínas solúveis, e aquelas expressas diferencialmente foram identificadas por MS. Os resultados demonstram que a supressão das C-hordeínas não afeta exclusivamente a síntese e o acúmulo de hordeínas, e que a composição de aminoácidos mais equilibrada destas linhagens pode ser uma consequência de fontes de proteína distintas entre os diferentes eventos de transgenia, embora a regulação positiva de proteínas ricas em lisina foi estável. No terceiro manuscrito (capítulo 4) foram avaliados os efeitos da adubação nitrogenada sobre a família das hordeínas. Os resultados mostraram que as respostas foram diferentes entre as linhagens não transgênica e transgênica. Um efeito específico de supressão e respostas particulares foi verificado entre os subgrupos da família multigênica das C-hordeínas na linhagem transgênica. Em resumo, a estratégia de pesquisa multimétodo foi aplicada com sucesso na obtenção de informações abrangentes sobre a síntese e o acúmulo de proteínas nos grãos de cevada, e pelo menos em parte, explicou sua relação com a melhoria da qualidade nutricional. Esses resultados podem ser úteis em programas de melhoramento de cevada que visam alterações seletivas de alelos/homólogos específicos para alterar a composição de aminoácidos, através de mudanças nas proporções relativas das proteínas dos grãos.

Barley (Hordeum vulgare L.) is the fourth largest produced cereal worldwide. About two thirds of barley production is used to animal feed. When used to feed monogastric animals, the main shortcoming of barley grains is the deficiency of essential amino acids, especially lysine, threonine and methionine. The unbalanced amino acid composition is due to the main storage protein, the hordeins, which account for about 50% of total grain protein content. The nitrogen fertilization promotes C-hordein expression and accumulation, the hordein subgroup with the lowest content of essential amino acids, and the highest content of non-essential amino acids. Due to the importance of grain protein content and composition in the end use grain quality the key objective of the present study was to obtain a detailed insight into synthesis and accumulation of barley grain proteins and their relation to improved nutritional quality. An integrated proteomic and transcriptomic analysis have been undertaken in a set of transgenic antisense barley lines with the grain protein profile altered in comparison to the non-transgenic line cv. Golden Promise. The results were presented in three manuscripts in the thesis (chapters 2, 3 and 4). The first manuscript (chapter 2) reported a new grain protein extraction method combined with multi-method protein evaluation, including biochemical quantification, amino acid composition, sodium dodecyl-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) couple with mass spectrometry (MS) identification and a gel free shotgun MS identification and relative quantification. The results showed the changeability of proteins between protein groups and the importance of choosing an adequate proteomic-based method for protein identification according to the complexity of protein mixtures. In the second manuscript (chapter 3) a differential protein profile of non-transgenic barley cv. Golden Promise and the transgenic antisense C-hordein barley lines was achieved by two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) for salt soluble proteins and the differentially expressed proteins were identified by MS. The key results showed that the suppression of C-hordeins, the poor nutritional hordein subgroup, does not exclusively affects hordein synthesis and accumulation, and that the more balanced amino acid composition of these lines may be a consequence of distinct protein sources among different transgenic events, though a stable lysine-rich proteins upregulation occurs in all lines. In the third manuscript (chapter 4) the effects of nitrogen fertilization on hordein family at transcriptional and proteome level were assessed. The main results showed differential responses to N nutrition between non-transgenic and transgenic lines. In relation to C-hordein, specific C-hordein downregulation effect and in particular different responses to N were verified among subgroups of C-hordein multigene family in the transgenic line at transcriptional and proteomic level. In summary, the multi-method strategy used in the present work was successfully applied to obtain comprehensive information about barley grain proteins synthesis and accumulation and explain, at least in part, their relation to improved nutritional quality. These results can be useful in barley breeding programs aiming selective alterations of specific alleles/homologues to change amino acid composition by changing the relative proportions of the grain proteins in order to improve the barley grains nutritional quality. / A cevada (Hordeum vulgare L.) é o quarto cereal mais produzido no mundo. Cerca de dois terços desta produção é utilizada na alimentação animal. A principal desvantagem dos grãos de cevada na alimentação de animais monogástricos é a deficiência de aminoácidos essenciais, principalmente lisina, treonina e metionina. Esta composição desfavorável ocorre devido à principal proteína de reserva dos grãos, as hordeínas, que representam cerca de 50% do teor total de proteína no grão. O nitrogênio promove a expressão e o acúmulo de C-hordeínas, o subgrupo com o menor teor de aminoácidos essenciais e o maior teor de aminoácidos não essenciais. Devido à importância do teor e composição de proteínas nos grãos na determinação de sua qualidade no uso final, o principal objetivo do presente trabalho foi obter uma visão detalhada sobre a síntese e acúmulo de proteínas de grãos de cevada e sua relação com a melhoria da qualidade nutricional. Análises proteômicas e transcriptômicas integradas foram realizadas em um conjunto de linhagens transgênicas de cevada com o perfil de proteínas de reserva alterados em comparação à linhagem não transgênica cv. Golden Promise. Os resultados foram apresentados na forma de três manuscritos (capítulos 2, 3 e 4). O primeiro (capítulo 2) descreveu um novo método de extração de proteínas dos grãos em combinação com métodos de estudo de proteínas diversos, incluindo a quantificação bioquímica, composição de aminoácidos, eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) seguido de identificação por espectrometria de massas (MS) e estratégia shotgun para identificação e quantificação relativa das proteínas. Os resultados mostram a mutabilidade das proteínas entre os diferentes grupos e a importância da escolha de um método adequado para a sua identificação de acordo com a complexidade das misturas proteicas. No segundo manuscrito (capítulo 3) o perfil proteico diferencial da linhagem não transgênica e transgênica foi obtido por eletroforese bidimensional (2-DE) para proteínas solúveis, e aquelas expressas diferencialmente foram identificadas por MS. Os resultados demonstram que a supressão das C-hordeínas não afeta exclusivamente a síntese e o acúmulo de hordeínas, e que a composição de aminoácidos mais equilibrada destas linhagens pode ser uma consequência de fontes de proteína distintas entre os diferentes eventos de transgenia, embora a regulação positiva de proteínas ricas em lisina foi estável. No terceiro manuscrito (capítulo 4) foram avaliados os efeitos da adubação nitrogenada sobre a família das hordeínas. Os resultados mostraram que as respostas foram diferentes entre as linhagens não transgênica e transgênica. Um efeito específico de supressão e respostas particulares foi verificado entre os subgrupos da família multigênica das C-hordeínas na linhagem transgênica. Em resumo, a estratégia de pesquisa multimétodo foi aplicada com sucesso na obtenção de informações abrangentes sobre a síntese e o acúmulo de proteínas nos grãos de cevada, e pelo menos em parte, explicou sua relação com a melhoria da qualidade nutricional. Esses resultados podem ser úteis em programas de melhoramento de cevada que visam alterações seletivas de alelos/homólogos específicos para alterar a composição de aminoácidos, através de mudanças nas proporções relativas das proteínas dos grãos.