Universiẗat, Diss., 2002--Marburg.

Universiẗat, Diss., 2003--Marburg.

Universiẗat, Diss., 2004--Bayreuth.

Coronaviren sind mit einer Genomgröße von 27-32 kb die größten bekannten RNA-Viren. Sie infizieren ein breites Spektrum von Vertebraten und führen zu beträchtlichen wirtschaftlichen Schäden in der Tierzucht. Eine zentrale Regulationsebene im coronaviralen Lebenszyklus stellt die proteolytische Prozessierung dar. Sie führt zur Freisetzung der einzelnen funktionellen Proteinkomponenten des Replikationskomplexes. Eine Schlüsselfunktion in diesem Prozess haben die viruskodierten 3C-like-Proteasen, die aus diesem Grund attraktive Zielmoleküle für die Entwicklung anticoronaviraler Therapien darstellen. Eine wichtige Voraussetzung für die Entwicklung effektiver und selektiver Inhibitoren stellt die biochemische und strukturelle Charakterisierung der Coronavirus-3C-like-Protease (3CLpro) dar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Substratspezifität der coronaviralen 3C-like-Proteasen in vitro untersucht. Dazu wurden zunächst fünf verschiedene coronavirale 3C-like-Proteinasen (FIPV-, TGEV-, HCoV-, MHV- und IBV-3CLpro) rekombinant als MBP-3CLpro-Fusionsproteine in E.coli exprimiert. Die 3CLpro-Domäne des felinen Coronavirus FIPV wurde dabei erstmals kloniert und sequenziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der FIPV-3CLpro wurde mit der anderer coronaviraler 3C-like-Proteasen verglichen und ergab eine außerordentlich enge phylogenetische Verwandschaft von FIPV und TGEV. Die MBP-Fusionsproteine wurden affinitätschromatographisch aufgereinigt und die authentischen 3C-like-Proteasen durch die Abspaltung des MBP mittels Endoproteinase Faktor Xa freigesetzt. Alle gereinigten 3C-like-Proteasen zeigten Transspaltungsaktivität gegenüber synthetischen Peptiden und konnten somit für die biochemische Charakterisierung verwendet werden. Kompetitive Spaltungsassays mit den 3C-like-Proteasen von HCoV, TGEV und MHV und synthetischen Peptiden, die verschiedene Spaltstellen im coronaviralen Replikasepolyprotein repräsentieren, ergaben eine Schnittstellenhierarchie, die über Speziesgrenzen hinweg konserviert ist. Übereinstimmend konnte für die HCoV-, TGEV- und MHV-3C-like-Protease gezeigt werden, dass die die 3CLpro flankierenden Schnittstellen am effektivsten hydrolysiert werden. Diese Daten lassen auf eine frühzeitige (möglicherweise kotranslationale) Freisetzung der 3C-like-Protease aus dem viralen Polyprotein schließen, die eine weitgehend in trans erfolgende Prozessierung der viralen Polyproteine zur Folge hätte. Interessanterweise wurde das die aminoterminale HCoV-3CLpro-Schnittstelle repräsentierende Peptid von allen getesteten coronaviralen 3C-like-Proteasen überaus effektiv gespalten, so dass diese Sequenz als Grundlage für die Entwicklung eines für Coronaviren universellen Substrates in einem sensitiven, kontinuierlichen Assay für Coronavirus-3C-like-Proteasen dienen konnte. Dieser auf einem fluorogenen Substrat basierende Assay erweitert das Spektrum der bisher verfügbaren analytischen Methoden zur Charakterisierung der coronaviralen 3C-like-Proteasen und könnte in modifizierter Form auch für andere virale Proteasen verwendet werden. Eine initiale Charakterisierung mit klassenspezifischen Inhibitoren zeigte die Eignung des Assays für ein high throughput screening (HTS) nach potentiellen 3CLpro-Inhibitoren, das eine wichtige Technik der pharmazeutischen Industrie für die schnelle und effiziente Suche und Optimierung relevanter Verbindungen darstellt. Für das rationale Design 3CLpro-spezifischer Inhibitoren ist die Kenntnis der dreidimensionalen Struktur essentiell. Von besonderem Interesse ist dabei die Aufklärung der strukturellen Grundlagen der Substratspezifität. Auf der Suche nach coronaviralen 3C-like-Proteasen mit guten Kristallisationseigenschaften wurden im Rahmen dieser Arbeit für die FIPV- und TGEV-3CLpro Reinigungsprozeduren etabliert, die zu hochgereinigten Proteinen mit relativ guten Kristallisationseigenschaften führten, die gute Voraussetzungen für eine röntgenkristallographische Strukturanalyse schaffen. / With genome sizes between 27,000 and 31,000 nucleotides, coronaviruses are the largest RNA viruses known to date. They infect a broad range of vertebrates and cause considerable economic losses in animal breeding. Proteolytic processing of large polyprotein precursors generates the individual functional subunits of the replication complex and thus represents a central regulatory mechanism in the replication cycle of coronaviruses. In this process, the coronavirus 3C-like proteases play a key role and, for this reason, they represent ideal targets for the design of inhibitors to control coronavirus infections. To develop effective and selective enzyme inhibitors, a comprehensive biochemical and structural characterization of the 3C-like protease (3CLpro) is required. In this study, the substrate specificities of coronaviral 3C-like proteases were characterized in vitro. To this end, five different 3C-like proteases (from FIPV, TGEV, HCoV-229E, MHV und IBV) were recombinantly expressed as fusion proteins with the Escherichia coli maltose-binding protein. The complete coding region of the FIPV 3C-like protease was cloned and sequenced for the first time. Upon comparison of the deduced amino acid sequence with the replicase polyprotein sequences of other coronaviruses a close phylogenetic relationship between FIPV and TGEV was revealed. The MBP-3C-like protease fusion proteins were purified by affinity chromatography and the authentic 3C-like proteases were released from the fusion protein by factor Xa cleavage. All recombinant proteases were shown to be active in synthetic peptide-based trans-cleavage assays and, thus, they were suitable for further biochemical characterization. Competition experiments using the purified 3C-like proteases of HCoV, TGEV and MHV, respectively, and peptide substrates representing pp1a/pp1ab cleavage sites revealed a specific ranking of cleavage sites. This ranking proved to be conserved among coronaviruses. The data consistently showed that the sites which flank the 3C-like proteases are most effectively cleaved. It thus seems reasonable to conclude that the release of 3CLpro from the viral polyprotein may be an early, possibly cotranslational step in the pp1a/pp1ab processing pathway. If this hypothesis is correct, most 3CLpro-mediated cleavages would occur in trans. Interestingly, the peptide substrate containing the aminoterminal HCoV 3CLpro cleavage site was cleaved very efficiently by all the coronaviral 3C-like proteases tested in this study. Therefore, the sequence of this peptide was used to develop a universally applicable, sensitive fluorometric assay suitable for the characterization of coronavirus 3C-like proteases and the identification and evaluation of inhibitors. This peptide-based fluorogenic assay not only significantly extends the spectrum of analytical methods in the characterization of coronavirus 3C-like proteases but, in a modified form, could also be applied for other viral proteases. The initial characterization of this novel assay using class-specific protease inhibitors demonstrated its suitability for high-throughput screening (HTS) applications which are widely used in the pharmaceutical industry to identify inhibitory lead compounds from large compound libraries generated by combinatorial chemistry. Structural information is essential for the rational design of 3CLpro-specific inhibitors. In this respect, the elucidation of the structural basis for subrate recognition is of particular interest. In an attempt to identify coronaviral 3C-like proteases with favourable crystallization properties, protocols for the purification of the FIPV and TGEV 3C-like proteases were developed in this study. The established methods proved to be suitable to produce large amounts of highly purified enzymes with significantly improved crystallization properties and thus provide a good basis for structure analyses by X-ray crystallography.

Tübingen, Univ., Diss., 2004.

München, Techn. Univ., Diss., 2009.

University, Diss., 2003--Münster (Westfalen).

Techn. Universiẗat, Diss., 2003--Berlin.

Techn., Hochsch., Diss., 2003--Aachen.

Malaria stellt mit einer Mortalität von über einer Million Menschen pro Jahr die bedeutsamste Tropenkrankheit für den Menschen dar. Wachsende Resistenzen der Malariaerreger gegenüber den verfügbaren Medikamenten erhöhen mehr denn je den Druck, neue Therapiemöglichkeiten sowie einen Impfstoff gegen diese Krankheit zu entwickeln. Eine Unterbrechung des sexuellen Fortpflanzungszyklus im Laufe der Transmission von Mensch zu Stechmücke würde zu einem Verbreitungsstopp des Erregers führen. Sowohl die Identifizierung von molekularen Wechselwirkungen als auch die Erforschung von an Fertilisationsereignissen beteiligten Prozessen sind wichtige Schritte, um die Sexualphase des Erregers aufzuklären und neue Angriffspunkte für Medikamente oder Vakzine zu entwickeln. Dem Genom von P. falciparum konnten 92 putative Proteasen zugeordnet werden, von denen nur ein geringer Bruchteil charakterisiert worden ist. Unter Anwendung von Protease-Inhibitoren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Exflagellation der männlichen Gameten die Beteiligung von Proteasen verschiedener Kategorien benötigt. Die Ergebnisse belegten, dass die Aktivität von zwei oder mehr Serinproteasen, von Falcipain-ähnlichen Cysteinproteasen, von nicht-Thermolysin-ähnlichen Zink-Metalloproteasen und von Aspartatproteasen für den erfolgreichen Abschluss der männlichen Gametogenese eine wichtige Voraussetzung ist. Die Lokalisation des Cysteinproteasen- und Falcipain-hemmenden Inhibitors bADA konnte erstmals im Zytosol von Sexualstadien nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurden zusätzlich die Proteasen Calpain, DPAP2, GPI8, Metacaspase 2, Plasmepsin 6 und PfSub3 näher untersucht. RT-PCR-Analysen konnten die Transkription der sechs ausgesuchten Proteasen in gemischten asexuellen Parasiten sowie zum Großteil in Gametozyten, Gameten und Zygoten belegen. Die Transformation von asexuellen Parasiten mit entsprechenden knockout-Konstrukten deckte für Metacaspase 2 und PfSub3 auf, dass sie im asexuellen Vermehrungszyklus nicht essentiell und die entsprechenden Genloci für Rekombinationsereignisse zugänglich sind. Die Ergebnisse der übrigen Transformationen deuteten darauf hin, dass Calpain essentiell im asexuellen Vermehrungszyklus und dass der Genlocus von Plasmepsin 6 für Rekombinationsereignisse unzugänglich ist. Proteinexpressionsstudien anhand von Western-Blot-Analysen und Immunfluoreszenzstudien für PfSub3 konnten Hinweise darauf liefern, dass diese Serinprotease in asexuellen Parasiten, nicht-aktivierten sowie aktivierten Sexualstadien exprimiert wird. Aufgrund der in dieser Arbeit generierten Ergebnisse konnten im Laufe der Gametogenese auftretende Gametenfilamente morphologisch beschrieben sowie Hinweise auf ihre mögliche Funktion erlangt werden. Durch die Anwendung von Immunfluoreszenzstudien, rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen sowie die Analyse lebender Gameten konnte gezeigt werden, dass die bis zu 180 µm langen Filamente am Ende geschlossen sind und einen Durchmesser von ca. 200 nm aufweisen. Die tubulären Zellausläufer konnten weiterhin als verzweigte sowie nicht-verzweigte Ausläufer der parasitären Plasmamembran dargestellt werden, die mit Zytoplasma gefüllt sind. Es konnte belegt werden, dass die Aktin-assoziierten Filamente in periodischen Abständen von beulenartigen Auswölbungen unterbrochen werden und dass sie in rasterelektronenmikroskopischen Analysen ein perlschnurartiges Erscheinungsbild aufweisen. Weiterhin wurde dokumentiert, dass die Zellausläufer mit typischen sexualstadienspezifischen Proteinen wie Pfs25, Pfs230, Pfs48/45 und PfCCp4 assoziiert vorliegen, wobei das Fehlen einzelner dieser Proteine jedoch nicht das Ausbilden der Gametenfilamente verhinderte. Als typisches Charakteristikum der Filamente konnte ihre Eigenschaft beschrieben werden, mehrere Makrogameten und zum Teil Gametozyten in einem Zellkluster miteinander netzartig zu verbinden, wobei bis zu neun Filamente von einem Makrogameten ausgehend beobachtet werden konnten. Die Gametenfilamente zeigten ebenfalls die Fähigkeit, an umliegende nicht-infizierte Erythrozyten sowie mit asexuellen Parasiten infizierte Erythrozyten zu adhärieren. Die Filamente waren bereits fünf Minuten nach der Aktivierung der Gametozyten und im Laufe der Gametogenese bei 33 bis 73 % der Zellen nachweisbar. Die Gametenfilamente blieben bis zu 12 Stunden nach Aktivierung der Gametozyten mit der Zelloberfläche verbunden. Der aktive Einzug eines Zellfilaments sowie die Bildung der Gametenfilamente im Mitteldarm der Stechmücke konnte ebenfalls demonstriert werden. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse lieferten unter anderem den Grundbaustein einer formulierten Funktionshypothese für diese Gametenfilamente. Es wird angenommen, dass die Filamente aufgrund ihrer adhäsiven Eigenschaften im Laufe der Befruchtung von Plasmodium im Mitteldarm der Stechmücke auftreten. Möglicherweise bedienen sich vitale Gameten dieser Strukturen, um andere Sexualstadien zu finden und sie zu verbinden. / Malaria remains the deadliest among the tropical diseases with a death toll rate of more than one million people annually. Increasing resistance of the causative organism Plasmodium spec. against available drugs heightens the need for the development of new antimalarial drugs and a vaccine. The sexual reproduction phase of this pathogen has garnered increasing attention because of the potential to prevent the transmission of the parasite from human to mosquito by blocking fertilization and following essential processes in the vertebrate host. Therefore, the identification of molecular interactions during fertilization processes is essential to elucidate the sexual replication phase in order to develop new transmission blocking strategies. The genome of P. falciparum encodes for 92 putative proteases among them only few are partly characterized, although they are considered as excellent drug targets. The data herein defines the involvement of proteases belonging to various protease classes in the exflagellation of male gametes in P. falciparum. It was shown that this essential process of male gametogenesis can be blocked by use of different protease inhibitors. The data suggests an involvement of two or more serine proteases, falcipain-like cysteine proteases, non-thermolysin-like zinc metalloproteases and aspartic proteases in microgametocyte exflagellation. Furthermore, the described data defined the localization of the cysteine protease and falcipain-blocking inhibitor bADA. This inhibitor was shown to be localized in the cytosol of trophozoites, schizonts, gametocytes at all stages of maturity and macrogametes. Additionally, the present thesis achieved first evidence about six specifically selected and largely uncharacterized proteases calpain, DPAP2, GPI8, metacaspase 2, plasmepsin 6 and PfSub3. RT-PCR-Analyses were conducted to demonstrate the existence of transcript and consequently genetically active gene loci for mixed asexual parasites and for most of the gametocyte, gamete and zygote stages. The transformation of asexual parasites with metacaspase-2- and PfSub3-knockout-constructs led to the conclusion that these proteases are non-essential during the asexual replication cycle and their gene loci are accessible to homologous recombination. Additional transformation experiments indicated both that calpain is indispensable in the asexual replication cycle and that the gene locus for Plasmepsin 6 might be inaccessible for homologous recombination. The protein expression analysis for PfSub3 was carried out by using western blot and immunofluorescence assays. The analysis suggests that this serine protease is expressed in asexual parasites as well as in non-activated and activated gametocytes. Based on the data described herein, both the morphologic description of newly discovered filaments of gametes emerging during gametogenesis and the assignment of their putative function was possible. Using immunofluorescence analysis, scanning electron microscopy and live imaging analysis of gametes it was shown that these tubular filaments are about 200 nm in diameter and exhibit a length of up to 180 µm. Furthermore, it was demonstrated that they are close-ended, actin-associated and cytoplasm-containing cell extensions of the parasite’s plasma membrane with a branched or straight appearance. The surface of filaments was associated with bulge-like structures and appeared in scanning electron microscopy partly as a beaded structure. Additionally, it was demonstrated that the sexual stage surface proteins Pfs25, Pfs230, Pfs48/45 and PfCCp4 are connected with these cell extensions, whereby the lack of single proteins did not result in a complete blockade of filament formation. The most typical feature of the filaments was described: to connect several macrogametes and even gametocytes within a cell cluster. It was defined that up to nine filaments emerged from the surface of macrogametes, which were able to adhere to non-infected erythrocytes as well as to parasite-infected erythrocytes. Analysis of their formation revealed that the filaments are formed within five minutes after gametocyte activation and are able to persist on the surface of gametes for a time period of up to 12 hours. During gametogenesis, 33 to more than 70 % of macrogametes exhibited the described filaments. It was possible to demonstrate the active retraction of a filament formed by a macrogamete as well as the generation of a filament in the mosquito midgut. Due to these findings a putative function was assigned. Thus, it can be suggested that the filaments likely form during gametogenesis in the mosquito midgut due to their adhesive properties in order to locate and collect other sexual stages. It might be possible that the filaments are used as a tool of vital gametes to enhance fertilization in the vertebrate host.