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Charakterisierung von Arabidopsis HEMA-Mutanten und in vivo-Analyse funktioneller Domänen der pflanzlichen Glutamyl-tRNA-ReduktasenApitz, Janina 09 June 2016 (has links)
Die Tetrapyrrolbiosynthese (TBS) führt zu wichtigen Endprodukten wie Häm und Chlorophyll. Das gemeinsame Vorstufenmolekül aller Tetrapyrrole ist die 5-Aminolävulinsäure (ALA), die in Pflanzen über den C5-Weg aus Glutamat synthetisiert wird. Das erste spezifische Enzym der ALA-Synthese und somit auch der TBS ist die Glutamyl-tRNA Reduktase (GluTR). Sie unterliegt als Schlüsselenzym einer strengen Regulation. Aufgrund der unterschiedlichen Expression der HEMA-Gene in Arabidopsis wird ein differenzieller Beitrag der GluTR-Isoformen zu den Endprodukten der TBS vermutet. Analysen von knockout-Mutanten gaben Aufschluss darüber, inwiefern die Isoformen den Verlust des jeweils anderen kompensieren können. Die knockout-Mutante von HEMA1 zeigte einen blassgrünen Phänotyp, war nicht mehr in der Lage photoautotroph zu wachsen und demonstrierte eine essentielle Rolle der GluTR1 gegenüber GluTR2, wohingegen hema2-Mutanten einen wildtypartigen Phänotyp aufzeigten. Die Bedeutung der N-terminalen GluTR-Domäne in der posttranslationalen Regulation der ALA-Synthese wurde durch BiFC-Analysen und Komplementationsversuche aufgeklärt. BiFC-Analysen zeigten eine Interaktion der N-terminalen Domäne der GluTR1 mit Proteinen der Clp Proteasen und dem GluTR-Bindeprotein (GBP). Veränderte GluTR-Stabilitäten in gbp-Mutanten lassen eine schützende Funktion des GBP gegenüber dem Abbau des Proteins postulieren. Die Expression einer N-terminal verkürzten GluTR1 komplementierte hema1-Mutanten vollständig. Die in diesen Pflanzen und in clp-Mutanten beobachteten erhöhten GluTR1-Proteinstabilitäten im Dunkeln lassen einen Abbau der GluTR durch Clp Proteasen vermuten, bei dem der N-Terminus des Enzyms für die Substraterkennung notwendig zu sein scheint. Die Detektion von erhöhten Pchlid-Mengen als Folge der erhöhten Proteinstabilität in Linien, die die verkürzte GluTR1 exprimierten, demonstriert erstmals die Bedeutung einer kontrollierten Proteolyse der GluTR in der Regulation der ALA-Synthese. / In plants 5-aminolevulinic acid (ALA) is the common precursor of all tetrapyrrols and formed from glutamate via the C5 pathway. Glutamyl-tRNA reductase (GluTR) is the initial enzyme of ALA synthesis and thus tetrapyrrole biosynthesis (TBS). The most important control point of the TBS is the synthesis of ALA and GluTR is the key enzyme, that is tightly regulated. Due to the different expression of HEMA genes in Arabidopsis, a differential contribution to endproducts of the TBS is proposed for GluTR isoforms. Analysis of knockout mutants gave some indications of how the isoforms can compensate each other. I introduced a new knockout mutant of HEMA1 that was pale-green and not able to grow photoautotrophically, indicating that the remaining GluTR2 does not sufficiently compensate ALA synthesis for the extensive needs of chlorophyll. In contrast, hema2 mutants were wild-type-like. The function of the N-terminal region of GluTR1 in posttranslational regulation has been analyzed by BiFC analysis and complementation experiments of hema1. BiFC analysis showed an interaction of the N-terminal region of GluTR1 with the GluTR binding protein (GBP) and with proteins of the Clp proteases. Mutants of GBP revealed a decreased GluTR1 stability during the dark period, indicating a protective role of GBP against proteolysis of GluTR1 in darkness. The expression of a GluTR1 lacking the N-terminal amino acid residues successfully complemented hema1. These plants as well as clp mutants revealed an increased GluTR1 stability in darkness, suggesting a degradation of the protein through Clp proteases. Thereby, the N-terminal region of GluTR1 seems to be necessary for the recognition by Clp proteins. The observed high amount of truncated GluTR1 in transformed hema1 mutants was caused by the increased GluTR1 stability and lead to an accumulation of Pchlide in prolonged dark periods, demonstrating the importance of a controlled proteolysis of GluTR in the regulation of ALA synthesis.
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Charakterisierung und Nutzung der mikrobiellen Diversität extremer Habitate der Kamtschatka-Region / Characterization of the microbial diversity of extreme habitats in the Kamchatka-regionSchuldes, Jörg 30 April 2008 (has links)
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The intramembrane proteases SPPL2a and SPPL2b regulate the homeostasis of selected SNARE proteinsBallin, Moritz, Griep, Wolfram, Patel, Mehul, Karl, Martin, Mentrup, Torben, Rivera-Monroy, Jhon, Foo, Brian, Schappach, Blanche, Schröder, Bernd 22 February 2024 (has links)
Signal peptide peptidase (SPP) and SPP-like (SPPL) aspartyl intramembrane proteases are known to contribute to sequential processing of type II-oriented membrane proteins referred to as regulated intramembrane proteolysis. The ER-resident family members SPP and SPPL2c were shown to also cleave tail-anchored proteins, including selected SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) proteins facilitating membrane fusion events. Here, we analysed whether the related SPPL2a and SPPL2b proteases, which localise to the endocytic or late secretory pathway, are also able to process SNARE proteins. Therefore, we screened 18 SNARE proteins for cleavage by SPPL2a and SPPL2b based on cellular co-expression assays, of which the proteins VAMP1, VAMP2, VAMP3 and VAMP4 were processed by SPPL2a/b demonstrating the capability of these two proteases to proteolyse tail-anchored proteins. Cleavage of the four SNARE proteins was scrutinised at the endogenous level upon SPPL2a/b inhibition in different cell lines as well as by analysing VAMP1-4 levels in tissues and primary cells of SPPL2a/b double-deficient (dKO) mice. Loss of SPPL2a/b activity resulted in an accumulation of VAMP1-4 in a cell type- and tissue-dependent manner, identifying these proteins as SPPL2a/b substrates validated in vivo. Therefore, we propose that SPPL2a/b control cellular levels of VAMP1-4 by initiating the degradation of these proteins, which might impact cellular trafficking.
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Histologische Charakterisierung eines murinen Knorpeldestruktionsmodells in der BALB/c MausNaue, Janine 02 November 2015 (has links) (PDF)
Die rheumatoide Arthritis ist eine chronisch-entzündliche Bindegewebserkrankung mit symmetrischem Befall der Gelenke. Die genaue Ätiologie ist bisher unbekannt. Aktivierte synoviale Fibroblasten sollen durch gesteigerte Adhäsion und Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Matrix-lysierenden Proteasen maßgeblich an der Gelenkdestruktion beteiligt sein. Ziel dieser Arbeit war es, ein neues in-vivo-Knorpeldestruktions-Modell zu etablieren, in welchem unter immunkompetenten Bedingungen, die Invasion und Destruktion von Gelenkknorpel durch die Fibroblasten-Zelllinie LS48 über einen längeren Zeitraum simuliert werden kann. Die am Institut für klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig etablierte Zelllinie LS48 wurde in die ipsilateralen Kniegelenke von BALB/c-Mäusen injiziert. Die dadurch induzierte Gewebsdestruktion wurde über zehn Wochen in zweiwöchigem Abstand histopathologisch beurteilt und klassifiziert. Als vergleichende Fibroblasten-Zelllinie wurden nicht-invasive NIH/3T3-Zellen eingesetzt. An Hand der Score-Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion wurde eine mäßige bis schwer-wiegende Gewebsdestruktion durch die LS48-Zellen bereits ab der zweiten Untersuchungswoche lichtmikroskopisch nachgewiesen, ohne dass dabei pathologische Effekte in den kontralateralen Kniegelenken aufgetreten sind. Polarisationsmikroskopisch wurden für den Parameter Knorpeldestruktion vergleichbare Ergebnisse erzielt. Damit wurde gezeigt, dass das Modell BALB/c LS48 ein erfolgversprechendes Instrument darstellt, das zur Testung neuer therapeutischer Strategien gegen die Gelenkdestruktion verwendet werden kann. Inwieweit die Auseinandersetzung der LS48-Zellen mit dem spezifischen Immunsystem der BALB/c-Maus Auswirkungen auf den Verlauf der Gewebsdestruktion hat, sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden.
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Histologische Charakterisierung eines murinen Knorpeldestruktionsmodells in der BALB/c MausNaue, Janine 21 September 2015 (has links)
Die rheumatoide Arthritis ist eine chronisch-entzündliche Bindegewebserkrankung mit symmetrischem Befall der Gelenke. Die genaue Ätiologie ist bisher unbekannt. Aktivierte synoviale Fibroblasten sollen durch gesteigerte Adhäsion und Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Matrix-lysierenden Proteasen maßgeblich an der Gelenkdestruktion beteiligt sein. Ziel dieser Arbeit war es, ein neues in-vivo-Knorpeldestruktions-Modell zu etablieren, in welchem unter immunkompetenten Bedingungen, die Invasion und Destruktion von Gelenkknorpel durch die Fibroblasten-Zelllinie LS48 über einen längeren Zeitraum simuliert werden kann. Die am Institut für klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig etablierte Zelllinie LS48 wurde in die ipsilateralen Kniegelenke von BALB/c-Mäusen injiziert. Die dadurch induzierte Gewebsdestruktion wurde über zehn Wochen in zweiwöchigem Abstand histopathologisch beurteilt und klassifiziert. Als vergleichende Fibroblasten-Zelllinie wurden nicht-invasive NIH/3T3-Zellen eingesetzt. An Hand der Score-Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion wurde eine mäßige bis schwer-wiegende Gewebsdestruktion durch die LS48-Zellen bereits ab der zweiten Untersuchungswoche lichtmikroskopisch nachgewiesen, ohne dass dabei pathologische Effekte in den kontralateralen Kniegelenken aufgetreten sind. Polarisationsmikroskopisch wurden für den Parameter Knorpeldestruktion vergleichbare Ergebnisse erzielt. Damit wurde gezeigt, dass das Modell BALB/c LS48 ein erfolgversprechendes Instrument darstellt, das zur Testung neuer therapeutischer Strategien gegen die Gelenkdestruktion verwendet werden kann. Inwieweit die Auseinandersetzung der LS48-Zellen mit dem spezifischen Immunsystem der BALB/c-Maus Auswirkungen auf den Verlauf der Gewebsdestruktion hat, sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden.:Bibliographische Zusammenfassung II
Inhaltsverzeichnis III
Abkürzungsverzeichnis IV
1 Einleitung 1
1.1 Rheumatische Erkrankungen 1
1.2 Die rheumatoide Arthritis 2
1.2.1 Immunologische Grundlagen der rheumatoiden Arthritis 2
1.2.1.1 Hypothese der Fibroblasten-Abhängigkeit 3
1.2.1.2 Hypothese der T-Zell-Abhängigkeit 4
1.3 Allgemeine Anatomie und Histologie des Kniegelenks 6
1.4 Die Histopathologie der rheumatoiden Arthritis 9
1.4.1 Verschiedene Synovialmembrantypen bei rheumatoider Arthritis 10
1.5 Tiermodelle zur Untersuchung der rheumatoiden Arthritis 11
1.5.1 Das Tiermodell der Fibroblasten-induzierten Gelenkdestruktion in der BALB/c-Maus 12
1.6 Histopathologische Score-Systeme der rheumatoiden Arthritis in Tiermodellen 13
1.7 Ziel 13
1.7.1 Fragestellungen 14
2 Material und Methoden 16
2.1 Zelllinien und Versuchstiere 16
2.1.1 Die Fibroblasten-Zelllinie NIH/3T3 16
2.1.2 Die Fibroblasten-Zelllinie LS48 16
2.1.3 Die BALB/c-Maus 17
2.2 Tierversuchsplan 18
2.3 Zellkultur 19
2.3.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 19
2.3.2 Reagenzien 20
2.3.3 Durchführung 21
2.4 Isolation der murinen Kniegelenke 22
2.5 Histologische Aufarbeitung 23
2.5.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 23
2.5.2 Reagenzien 24
2.5.3 Entkalkung, Entwässerung, Einbettung und Schneiden der Präparate 26
2.5.4 Azanfärbung nach Heidenhain (Kernechtrubin-Anillinblau-Orange G-Färbung) 27
2.6 Klassifikation mit dem Durchlichtmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (Balb/c-LS48) 29
2.7 Klassifikation mit dem Polarisationsmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (Balb/c-LS48) 29
2.8 Statistik 30
3 Ergebnisse 31
3.1 Score-Erhebung mit dem Lichtmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 31
3.1.1 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Zellinvasion 32
3.1.2 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Pannusformation 35
3.1.3 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Knorpeldestruktion 38
3.2 Datenanalyse der lichtmikroskopisch untersuchten Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 41
3.2.1 Zellinvasion 41
3.2.2 Pannusformation 45
3.2.3 Knorpeldestruktion 48
3.2.4 Gesamtscore 51
3.3 Score-Erhebung mit dem Polarisationsmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 56
3.3.1 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Knorpeldestruktion 56
3.4 Datenanalyse des polarisationsmikroskopisch untersuchten Parameters Knorpel-destruktion für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 59
3.5 Statistischer Vergleich der licht- und polarisationsmikroskopischen Analysemethoden für den Parameter Knorpeldestruktion 62
3.6 Statistischer Vergleich der medialen und lateralen histologischen Sagittalschnitte der Kniegelenke 63
4 Diskussion 64
4.1 Die Bedeutung der histopathologischen Score-Parameter für das Modell der Fibroblasten-induzierten Gelenkdestruktion in der BALB/c-Maus 65
4.1.1 Der Score-Parameter Zellinvasion 65
4.1.1.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Zellinvasion 67
4.1.1.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Zellinvasion für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 69
4.1.2 Der Score-Parameter Pannusformation 70
4.1.2.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Pannusformation 71
4.1.2.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Pannusformation für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 73
4.1.3 Der Score-Parameter Knorpeldestruktion 74
4.1.3.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Knorpeldestruktion 75
4.1.3.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Knorpeldestruktion für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 76
4.1.4 Interpretation des lichtmikroskopisch erhobenen Gesamtscores für das Knorpeldestruktionsmodell (BALB/c-LS48) im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 78
4.1.4.1 Verlaufsvergleich zu anderen Tiermodellen 81
4.2 Die histopathologischen Auswirkungen der Zelllinien LS48 und NIH/3T3 im ipsilateralen Kniegelenk der BALB/c-Maus im Vergleich 83
4.3 Vergleich der medialen und lateralen Sagittalebenen der histologischen Präparate der Kniegelenke 85
4.4 Beurteilung histopathologischer Veränderungen in den kontralateralen Kniegelenken im Verlauf von zehn Wochen 86
4.5 Vergleich der licht- und polarisationsmikroskopischen Untersuchungsergebnisse 87
4.6 Schlussfolgerungen und Ausblick 89
Zusammenfassung 94
Literaturverzeichnis 99
Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 116
Eigenständigkeitserklärung VIII
Danksagung IX
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