Pflanzenwurzeln reagieren auf Phosphat- oder Eisenmangel mit einer vermehrten Wurzelhaarbildung, was eine Vergrößerung der absorptiven Oberfläche bewirkt. Die erhöhte Anzahl an Wurzelhaaren wird dabei auf verschiedene Weise gebildet. Phosphat-defiziente Arabidopsis-Pflanzen erhöhen die Anzahl an Wurzelhaarzellen, während sich unter Eisenmangel verzweigte Wurzelhaare entwickeln. Die Fe- und P-Homöostase wird durch systemische und lokale Signalwege reguliert. Der Einfluss dieser Signale auf die Fe- bzw. Psensitive Wurzelhaarentwicklung wurde mithilfe von split-root-Experimenten untersucht, die mit einem systemischen Mangel- oder Suffizienzsignal kombiniert wurden. Die Verzweigung der Wurzelhaare Fe-defizienter Pflanzen wurde durch ein dominantes Suffizienzsignal reprimiert, unabhängig von seiner lokalen oder systemischen Herkunft. Die Erhöhung der Wurzelhaarzahl bei P-Mangelpflanzen wurde durch ein dominantes Defizienzsignal induziert. Um herauszufinden, welches Entwicklungsstadium von dem jeweiligen Nährstoff beeinflusst wird, wurden Mutanten mit Defekten in frühen und späten Wurzelhaarentwicklungsstadien untersucht. Mutanten mit beeiträchtigter Wurzelhaar-Spezifikation wichen in ihrer Wurzelhaarzahl und –lokalisation vom Wildtyp ab, zeigten aber eine Fe- oder P-sensitive Veränderung. Die Gene aus frühen Entwicklungsstadien sind demnach essentiell für die Reaktion, sind aber nicht das direkte Ziel der Mangelsignale. Frühe Zelleigenschaften in der meristematischen Region waren durch die Eisen- oder Phosphatverfügbarkeit nicht verändert, was darauf hindeutet, dass die Wurzelhaarbildung erst in einem späteren Entwicklungsstadium durch die Nährstoffe beeinflusst wird. Mutanten mit Defekten in späteren Entwicklungsstadien zeigten kurze oder verformte Wurzelhaare unabhängig von der Nährstoffversorgung. Das Fe- oder P-Signal mündet also vor der Wirkung dieser Komponenten in die Wurzelhaarbildung ein. Das heisst, nachdem die korrekte Wurzelhaar-Position und -Anzahl in Anpassung an das Fe- oder P-Angebot festgelegt wurde, werden die Wurzelhaare unter allen Wachstumsbedingungen von einer gemeinsamen Maschinerie elongiert. Zur Identifikation potentiell neuer Gene, die die Wurzelhaarbildung in Anpassung an P-Mangel regulieren, wurden sechs Mutanten isoliert, die keine Wurzelhaare bei P-Mangel bilden, aber nach dem Transfer auf P-suffizientes Medium nicht beeinträchtigt waren. Eine dieser Mutanten, per2, wurde phänotypisch und genetisch charakterisiert. Neben der veränderten Wurzelhaarbildung zeigte per2 auch eine konstitutiv erhöhte Lateralwurzelbildung und eine erhöhte Anthozyan-Akkumulation bei P-Mangel. Laut epistatischen Analysen gehört die per2 Mutante zu einem Signalweg, der unabhängig von frühen Zellspezifikationsgenen wirkt. Der per2-Locus wurde innerhalb eines 87,5 kpb großen Abschnittes auf dem oberen Arm von Chromosom 3 kartiert. Mutanten die einen per2-ähnlichen Phänotyp zeigen, wurden bisher nicht beschrieben. Daher handelt es sich bei PER2 möglicherweise um ein neues Gen, das die Wurzelhaarbildung bei Phosphatmangel reguliert und weitere P-Mangelreaktionen beeinflusst. / Limitation of immobile nutrients, such as iron (Fe) and phosphate (P), induces the development of additional root hairs that lead to an increase of the absorptive surface of the root. The increased root hair frequency of Fe- and P-deficient Arabidopsis was realized by different strategies. Phosphate-deficient plants increased the number of root hairs while in Festarved plants root hairs were branched. The Fe and P starvation responses in plants are thought to be regulated by a systemic signaling mechanism that communicates the nutrient status of the shoot to the root and by a local signaling mechanism that perceives the Fe or P availability in the soil. The influence of local and systemic signals on the respective root hair phenotype was investigated in split-root experiments. This treatment was combined with either a nutrient-sufficient or -deficient shoot. The root hair branching typical of Fe-deficient plants only occured in the presence of both a local and a systemic Fe-deficiency signal. As a consequence, an Fe sufficiency signal acted dominantly to any deficiency signal, independent of its origin. The increased number of root hairs in P-deficient plants, conversely, was activated through either a local or a systemic P deficiency signal. Thus, the P deficiency signal acted dominantly to any sufficiency signal. To determine, which stage of root hair development was influenced by iron and phosphate, mutants with defects in different stages of root hair development were investigated for their root hair phenotype. Mutants affected in the early stages of root hair development, such as specification, displayed marked changes in the number and localization of root hairs. However, the nutritional signal was perceived and translated in this group of mutants. This indicates that the specification genes are involved in the nutrient-sensitive root hair formation, but may not be the direct targets. Early cell characteristics of root hairs in the late meristematic region of the root, like the expression of marker genes, were unaltered in plants adapted to Fe or P deficiency. This suggested the nutritional signal modulates root hair development after these characteristics have been established. Mutants with defects in the later stages of root hair development, such as root hair elongation, showed short or deformed root hairs in the proper position and frequency and were, thus, impaired independent of the Fe or P supply. Thus, the nutritional signal may enter the root hair developmental pathway around the stage of root hair initiation and bulge formation. Finally, six mutants were screened that did not form root hairs under P deficiency but developed normal, when the plants were transferred to P-sufficient medium. One of these mutants, per2 (phosphate deficiency root hair defective2), was characterized phenotypically and genetically. In addition to the impaired root hair growth, the per2 mutant displayed a constitutively high lateral root number and accumulated an increased amount of anthocyanins under P starvation. Epistatic analysis revealed that per2 action is independent of early cell specification genes. The per2 mutation was mapped to a 87.6 kbp region on the upper arm of chromosome 3 containing 19 genes. The per2 phenotype has not been described before. Thus, PER2 is a potential new gene involved in root hair development under phosphate deficiency.

Eisenmangel ist ein weltweites Ernährungsproblem für Pflanzen und allen von Ihnen abhängigen Sekundärkonsumenten. Er reduziert den Ertrag, die Qualität und Produktivität von z.B. Kulturpflanzen, was wiederum zu Mangelerscheinungen beim Menschen führen kann. Die Nahrungsmittelforschung hat ein großes ökonomisches und wirtschaftliches Interesse daran, die Eisenverfügbarkeit und -Aufnahme der Pflanzen zu erhöhen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine kleine Familie von fünf (VTL1-5) neuen potentiellen Eisentransportern in Arabidopsis thaliana identifiziert und charakterisiert und somit ein weiterer Baustein zu der Aufklärung der Eisenhomöostase hinzugefügt. Bei den fünf Transportern handelt es sich um CCC1-like Proteine, von denen vier (VTL1-3 und 5) eine eisenabhängig regulierte Expression zeigen. Für VTL1 kann mittels Protein-tag Markierung sehr überzeugend eine Lokalisation in der Vakuolenmembran und ein damit verbundener Eisentransport in die Vakuole, analog zur Funktion von VIT1, gezeigt werden. Da vermutlich ein knockout von VTL1 zur Embryo Lethalität führt und auch die vit1-1 Mutante einen sehr verkümmerten Phänotyp unter Eisenmangel zeigt, scheinen beide Proteine getrennt voneinander an verschiedenen Schlüsselpositionen im Eisenhaushalt zu wirken. Auch für VTL2 und VTL5 kann eine Lokalisation an der Vakuolenmembran und der damit verbundene Eisenimport postuliert werden. Die heterologe Expression aller drei Gene in ∆ccc1 Zellen führt zur Erhöhung der vakuolären Eisenkonzentration. Für VTL4 wird mittels Protein-tag Markierung eine Lokalisation an der Plasmamembran mit einer Exportfunktion vorgeschlagen. VTL3 und VTL4 heterolog exprimierende ∆ccc1 Hefe-Zellen weisen einen geringeren Eisengehalt als Kontrollzellen auf. Alle fünf Proteine sind in der Lage sowohl den Mutanten-Phänotyp der ∆ccc1 Hefe-Mutante, wie auch der Arabidopsis vit1-1 und nramp3/nramp4 Doppelmutante zu komplementieren. Anhand dieser Tatsachen konnte die Eisentransportfähigkeit bewiesen werden. / Iron deficiency is a worldwide nutritional problem for plants and in general all heterotrophic organisms. Iron deficiency reduces crop productivity, quality and yield, which in consequence lead to iron deficiency symptoms in humans. Because approximately 50 % of the global human caloric intake is derived from a cereal grain diet, it is not surprising that the emphasis of nutrition research is on uptake, transport and storage of iron in plants, specifically in seeds. In this doctoral thesis a small family of five potential iron transporters (VTL1-5) in Arabidopsis thaliana has been identified and characterized. These five transporters are CCC1-like proteins, four of which (VTL1-3, 5) show a pattern of iron-dependent expression. Through the use of a protein tag, VTL1 is shown to be localized on the vacuolar membrane and associated with import of iron into the vacuole. In this respect VTL1 displays an analogous function to VIT1. Since the knockout of VTL1 likely leads to embryo lethality and seedlings of the vit1-1 mutant display an ephemeral phenotype caused by iron deficiency, both proteins seem to uniquely influence the iron homeostasis. As for VTL1 both VTL2 and VTL5 are localized on the vacuolar membrane and catalyze iron import. The heterologous expression of all three genes in ∆ccc1 cells leads to an increased vacuolar iron concentration. In contrast, VTL3 and VTL4 may function as iron exporters and play possibly roles in xylem loading. This conclusion is supported by the facts that a mCherry-VTL4 signal is localized to the plasma membrane of tobacco leaf cells and that ∆ccc1 cells in which VTL3 and VTL4 are heterologous expressed, show a decreased iron content compared to control cells. All five proteins are able to complement the ∆ccc1 yeast mutant and the two Arabidopsis vit1-1 and nramp3/nramp4 mutant phenotypes, thereby demonstrating a function in iron transport.

Die Tetrapyrrolbiosynthese (TBS) führt zu wichtigen Endprodukten wie Häm und Chlorophyll. Das gemeinsame Vorstufenmolekül aller Tetrapyrrole ist die 5-Aminolävulinsäure (ALA), die in Pflanzen über den C5-Weg aus Glutamat synthetisiert wird. Das erste spezifische Enzym der ALA-Synthese und somit auch der TBS ist die Glutamyl-tRNA Reduktase (GluTR). Sie unterliegt als Schlüsselenzym einer strengen Regulation. Aufgrund der unterschiedlichen Expression der HEMA-Gene in Arabidopsis wird ein differenzieller Beitrag der GluTR-Isoformen zu den Endprodukten der TBS vermutet. Analysen von knockout-Mutanten gaben Aufschluss darüber, inwiefern die Isoformen den Verlust des jeweils anderen kompensieren können. Die knockout-Mutante von HEMA1 zeigte einen blassgrünen Phänotyp, war nicht mehr in der Lage photoautotroph zu wachsen und demonstrierte eine essentielle Rolle der GluTR1 gegenüber GluTR2, wohingegen hema2-Mutanten einen wildtypartigen Phänotyp aufzeigten. Die Bedeutung der N-terminalen GluTR-Domäne in der posttranslationalen Regulation der ALA-Synthese wurde durch BiFC-Analysen und Komplementationsversuche aufgeklärt. BiFC-Analysen zeigten eine Interaktion der N-terminalen Domäne der GluTR1 mit Proteinen der Clp Proteasen und dem GluTR-Bindeprotein (GBP). Veränderte GluTR-Stabilitäten in gbp-Mutanten lassen eine schützende Funktion des GBP gegenüber dem Abbau des Proteins postulieren. Die Expression einer N-terminal verkürzten GluTR1 komplementierte hema1-Mutanten vollständig. Die in diesen Pflanzen und in clp-Mutanten beobachteten erhöhten GluTR1-Proteinstabilitäten im Dunkeln lassen einen Abbau der GluTR durch Clp Proteasen vermuten, bei dem der N-Terminus des Enzyms für die Substraterkennung notwendig zu sein scheint. Die Detektion von erhöhten Pchlid-Mengen als Folge der erhöhten Proteinstabilität in Linien, die die verkürzte GluTR1 exprimierten, demonstriert erstmals die Bedeutung einer kontrollierten Proteolyse der GluTR in der Regulation der ALA-Synthese. / In plants 5-aminolevulinic acid (ALA) is the common precursor of all tetrapyrrols and formed from glutamate via the C5 pathway. Glutamyl-tRNA reductase (GluTR) is the initial enzyme of ALA synthesis and thus tetrapyrrole biosynthesis (TBS). The most important control point of the TBS is the synthesis of ALA and GluTR is the key enzyme, that is tightly regulated. Due to the different expression of HEMA genes in Arabidopsis, a differential contribution to endproducts of the TBS is proposed for GluTR isoforms. Analysis of knockout mutants gave some indications of how the isoforms can compensate each other. I introduced a new knockout mutant of HEMA1 that was pale-green and not able to grow photoautotrophically, indicating that the remaining GluTR2 does not sufficiently compensate ALA synthesis for the extensive needs of chlorophyll. In contrast, hema2 mutants were wild-type-like. The function of the N-terminal region of GluTR1 in posttranslational regulation has been analyzed by BiFC analysis and complementation experiments of hema1. BiFC analysis showed an interaction of the N-terminal region of GluTR1 with the GluTR binding protein (GBP) and with proteins of the Clp proteases. Mutants of GBP revealed a decreased GluTR1 stability during the dark period, indicating a protective role of GBP against proteolysis of GluTR1 in darkness. The expression of a GluTR1 lacking the N-terminal amino acid residues successfully complemented hema1. These plants as well as clp mutants revealed an increased GluTR1 stability in darkness, suggesting a degradation of the protein through Clp proteases. Thereby, the N-terminal region of GluTR1 seems to be necessary for the recognition by Clp proteins. The observed high amount of truncated GluTR1 in transformed hema1 mutants was caused by the increased GluTR1 stability and lead to an accumulation of Pchlide in prolonged dark periods, demonstrating the importance of a controlled proteolysis of GluTR in the regulation of ALA synthesis.