In der vorliegenden Arbeit wurden Experimente zur pflanzlichen Eisenassimilation durchgeführt. Zwei cDNAs aus Tomatenwurzeln (LeIRT1 und LeIRT2, GenBank Acc-Nr. AF176579 und AF176580) wurden isoliert. Sie komplementierten Fe-aufnahmedefiziente Hefestämme in Bezug auf das Wachstum auf Fe-limitierendem Medium. Die durch die LeIRT-Proteine vermittelte Fe-Aufnahme wurde in Hefezellen charakterisiert. Sie war temperaturabhängig, sättigbar und Fe2+, nicht Fe3+ wurde transportiert. Kompetitions- und Komplementationsexperimente mit metall-aufnahmedefizienten Hefemutanten legten die Vermutung nahe, daß die beiden cDNAs für Kationentransporter codieren, die eine breite Substratspezifität für Übergangsmetalle aufweisen. Die Transkripte der LeIRT-Gene konnten fast ausschließlich in Wurzeln nachgewiesen werden, wobei LeIRT1 durch Fe-Mangel induziert war, während für LeIRT2 keine Regulation durch die Fe-Ernährung der Pflanzen erkennbar war. Die Genstruktur wurde aufgeklärt (GenBank Acc-Nr. AF246266). Schwierigkeiten in der Analyse der Fe-Assimilation höherer Pflanzen machten es notwendig, einen neuen Modellorganismus zu suchen. Dabei wurde die einzellige Alge Chlamydomonas reinhardtii ausgewählt. Physiologische Studien zeigten, daß diese Alge ähnliche Fe-Mangelreaktionen wie die meisten höheren Pflanzen aufweist. Insbesondere die starke Induktion einer Fe3+-Chelatreduktase und die parallele Induktion der Fe-Transportkapazität unter Fe-Mangel waren deutlich. Mindestens zwei Fe-Transportsysteme wurden postuliert, von denen das höheraffine durch Cu-Ionen gehemmt wurde. / In the present study, experiments were conducted to analyze the iron assimilation in plants. Two cDNAs from tomato roots (LeIRT1 and LeIRT2, GenBank Acc-Nr. AF176579 and AF176580) were isolated that complemented the growth defect of Fe uptake-deficient yeast mutants. The Fe uptake mediated by the LeIRT proteins was characterized in yeast. It was temperature-dependent, saturable and Fe2+ rather than Fe3+ was transported. Competition and complementation experiments with metal uptake-deficient yeast mutants suggested that both cDNAs code for cation transporters exhibiting broad substrate specificity for transition metals. The transcripts of both genes were predominantly detected in roots, LeIRT1 being induced by Fe deficiency whereas LeIRT2 was unaffected by the Fe status of the plants. The gene structure was determined (GenBank Acc-Nr. AF246266). Problems in the analysis of Fe assimilation in higher plants made it necessary to establish a new model organism. The unicellular eucaryotic alga, Chlamydomonas reinhardtii, was chosen. Physiological studies indicated that this alga reacted to Fe deficiency similar to most higher plants. Particularly the strong induction of an Fe3+-chelate reductase paralleled by the induction of Fe transport capacitiy under Fe deficiency were evident. At least two Fe transporters were postulated, one of which was inhibited by Cu ions.

Eisenmangel ist ein weltweites Ernährungsproblem für Pflanzen und allen von Ihnen abhängigen Sekundärkonsumenten. Er reduziert den Ertrag, die Qualität und Produktivität von z.B. Kulturpflanzen, was wiederum zu Mangelerscheinungen beim Menschen führen kann. Die Nahrungsmittelforschung hat ein großes ökonomisches und wirtschaftliches Interesse daran, die Eisenverfügbarkeit und -Aufnahme der Pflanzen zu erhöhen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine kleine Familie von fünf (VTL1-5) neuen potentiellen Eisentransportern in Arabidopsis thaliana identifiziert und charakterisiert und somit ein weiterer Baustein zu der Aufklärung der Eisenhomöostase hinzugefügt. Bei den fünf Transportern handelt es sich um CCC1-like Proteine, von denen vier (VTL1-3 und 5) eine eisenabhängig regulierte Expression zeigen. Für VTL1 kann mittels Protein-tag Markierung sehr überzeugend eine Lokalisation in der Vakuolenmembran und ein damit verbundener Eisentransport in die Vakuole, analog zur Funktion von VIT1, gezeigt werden. Da vermutlich ein knockout von VTL1 zur Embryo Lethalität führt und auch die vit1-1 Mutante einen sehr verkümmerten Phänotyp unter Eisenmangel zeigt, scheinen beide Proteine getrennt voneinander an verschiedenen Schlüsselpositionen im Eisenhaushalt zu wirken. Auch für VTL2 und VTL5 kann eine Lokalisation an der Vakuolenmembran und der damit verbundene Eisenimport postuliert werden. Die heterologe Expression aller drei Gene in ∆ccc1 Zellen führt zur Erhöhung der vakuolären Eisenkonzentration. Für VTL4 wird mittels Protein-tag Markierung eine Lokalisation an der Plasmamembran mit einer Exportfunktion vorgeschlagen. VTL3 und VTL4 heterolog exprimierende ∆ccc1 Hefe-Zellen weisen einen geringeren Eisengehalt als Kontrollzellen auf. Alle fünf Proteine sind in der Lage sowohl den Mutanten-Phänotyp der ∆ccc1 Hefe-Mutante, wie auch der Arabidopsis vit1-1 und nramp3/nramp4 Doppelmutante zu komplementieren. Anhand dieser Tatsachen konnte die Eisentransportfähigkeit bewiesen werden. / Iron deficiency is a worldwide nutritional problem for plants and in general all heterotrophic organisms. Iron deficiency reduces crop productivity, quality and yield, which in consequence lead to iron deficiency symptoms in humans. Because approximately 50 % of the global human caloric intake is derived from a cereal grain diet, it is not surprising that the emphasis of nutrition research is on uptake, transport and storage of iron in plants, specifically in seeds. In this doctoral thesis a small family of five potential iron transporters (VTL1-5) in Arabidopsis thaliana has been identified and characterized. These five transporters are CCC1-like proteins, four of which (VTL1-3, 5) show a pattern of iron-dependent expression. Through the use of a protein tag, VTL1 is shown to be localized on the vacuolar membrane and associated with import of iron into the vacuole. In this respect VTL1 displays an analogous function to VIT1. Since the knockout of VTL1 likely leads to embryo lethality and seedlings of the vit1-1 mutant display an ephemeral phenotype caused by iron deficiency, both proteins seem to uniquely influence the iron homeostasis. As for VTL1 both VTL2 and VTL5 are localized on the vacuolar membrane and catalyze iron import. The heterologous expression of all three genes in ∆ccc1 cells leads to an increased vacuolar iron concentration. In contrast, VTL3 and VTL4 may function as iron exporters and play possibly roles in xylem loading. This conclusion is supported by the facts that a mCherry-VTL4 signal is localized to the plasma membrane of tobacco leaf cells and that ∆ccc1 cells in which VTL3 and VTL4 are heterologous expressed, show a decreased iron content compared to control cells. All five proteins are able to complement the ∆ccc1 yeast mutant and the two Arabidopsis vit1-1 and nramp3/nramp4 mutant phenotypes, thereby demonstrating a function in iron transport.

Eisen (Fe) liegt an vierter Stelle in der Fülle von Elementen in der Erdkruste, aber Fe-Mangel ist ein weit verbreitetes Problem bei Pflanzen und Tieren, da die Fe-Oxide unlöslich sind. Fe-Mangel führt zu einer Verringerung der Pflanzenproduktivität und am deutlichsten zu einer erhöhten Fe-induzierten Anämie beim Menschen. Es wurde angenommen, dass die Biofortifizierung von Fe ein praktischer Ansatz zur Verbesserung der Nährstoffqualität in Pflanzen und damit auch in Lebensmitteln oder Tierfutter ist. In dieser Arbeit wurden neue Strategien zur Erhöhung des Fe-Gehalts in der Modellpflanze Arabidopsis getestet. Vakuoläre Fe-Transportgene der VTL-Familie wurden in Kombination mit dem neu entdeckten Fe-Regulierungsprotein IMA1oder dem Fe-Bindungspeptid NAS3 überexprimiert. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass die Überexpression von VTL1, 2, 3, 4 oder 5, IMA1 oder NAS3 mit erhöhtem Eisengehalt im Samen korreliert. Die Expression der Gene für die Aufnahme von Fe und die Homöostase bestätigten den erhöhten Fe-Gehalt in diesen überexprimierenden Pflanzen. Die doppelte Überexpression der VTL-Gene in Kombination mit IMA1 oder NAS3 führte zu keinem weiteren Anstieg des Fe-Gehaltes, der wahrscheinlich durch die Regulation der VTL-Gene durch IMA1-Expression und den Mangel an erhöhtem Nicotianamin im Fall von VTL5 / NAS3-Überexpressionpflanzen verursacht würde. Zukünftige Forschung sollte der Übertragbarkeit dieser Ergebnisse auf Kulturpflanzen gewidmet sein. / Iron (Fe) ranks fourth in an abundance of elements in the Earth’s crust, but Fe deficiency is a widespread problem in plants and animals because of the insolubility of Fe oxides. Fe deficiency leads to reduce plant productivity and most significantly to enhanced Fe-induced anemia in humans. Fe biofortification has been suggested to be a practical approach for improving the nutritional quality of plants for food or feed. In this work, we have tested new strategies for increasing Fe content in the model plant Arabidopsis. Vacuolar Fe transport genes of the VTL family (VIT1-like) were over-expressed in combination with the newly discovered Fe regulatory protein IMA1 (IronMan1) or the Fe-binding peptide NAS3. Over-expression of each of the five VTL genes (VTL1 – 5) led to an increased Fe content by 2- to 3-fold in Arabidopsis seeds. IMA1 was greatly induced under Fe deficiency. Over-expression of IMA1 resulted in an Fe deficiency response also in Fe-sufficient plants. Fe content was an increase by 3-fold in seed, leaves, roots, and seedlings of Arabidopsis. The expression of Fe uptake and homeostasis genes was greatly induced in over-expressing plants independent of the Fe supply compared to the wild type. Analyses of NAS3 OE plants showed that Fe content in seeds was increased approximately 2-fold compared to WT. In conclusion, we have demonstrated that single over-expression of VTL1, 2, 3, 4 or 5, IMA1 or NAS3 correlated with increased seed Fe. Expression of Fe uptake and homeostasis genes confirmed the increased Fe content in these over-expressing plants. Double over-expression of the VTL genes in combination with IMA1 or NAS3 resulted in no further increase in Fe likely caused by the regulation of the VTL genes by IMA1 expression and the lack of increased nicotianamine in the case of VTL5/NAS3 over-expressing plants. Future research should be dedicated to extending these findings to crop plants.