Thesis (Ph. D. in Cancer Biology)--Vanderbilt University, May 2008. / Title from title screen. Includes bibliographical references.

In the field of protein research in general and the pharmaceutical industry in particular, it is now necessary to perform measurements of the secondary structure of proteins on many samples simultaneously, for instance to screen for molecules that stabilize proteins or to evaluate the action of multiple environmental conditions. In this context, we have proposed a new approach to evaluate the secondary structure of proteins on a very large scale (approximately 2000 to 4000 samples / cm2), by combining infrared imaging and 2D printing of protein microarrays. In view of the large amount of data, in a first step, methods for automating the extraction of spectra of interest from microarray infrared images and for automating the processing of the spectra were developed. Since the estimation of the secondary structure from infrared spectra is based on the construction of prediction models by chemometric methods, a relevant set of proteins for calibration was mandatory. A protein bank consisting of 92 commercially available proteins, the structure of which was well characterized by X-ray crystallography, was established for this purpose. After the development of predictive models for secondary structure determination and the validation of the protein microarray approach, we tried to optimize the models to improve the secondary structure prediction by different approaches as secondary structure definition, partial deuteration or subtraction of side chain contribution to the spectra. On the other hand, dealing with non-native structures not present in the reference protein library was a challenge. We took the opportunity to analyze the structural modifications of a subset of our protein library subjected to moderate denaturation conditions. Multivariate curve resolution-alternating least squares (MCR-ALS) was used to model a new spectral component appearing in the protein set subjected to denaturing conditions, which could represent a potential spectroscopic marker of aggregation and could allow a semi-quantitative evaluation of the aggregation. While the assessment of secondary structure was well established in the first part of this work, tertiary structure and stability are also critical. Hydrogen / deuterium exchange (HDX) is a potential approach for studying the structure and dynamics of proteins. In the last part of this work, we built a device which allowed to follow the HDX exchange kinetics simultaneously on the entire microarray. In conclusion, protein microarray FTIR imaging opens the door to high throughput analysis of protein secondary structure without any labelling and would allow better understanding of three-dimensional structure and dynamics of proteins through recording HDX curves. / Dans le domaine de la recherche sur les protéines et de l'industrie pharmaceutique, il s’avère désormais nécessaire d'effectuer des mesures de la structure secondaire des protéines sur de nombreux échantillons simultanément, de cribler des molécules qui stabilisent les protéines, ou d'évaluer l'action de multiples conditions environnementales. Dans ce contexte, nous avons proposé une nouvelle approche pour évaluer la structure secondaire des protéines à très grande échelle (environ 2 000 à 4 000 échantillons / cm2), en associant l'imagerie infrarouge et l'impression 2D de damiers de protéines. Dans un premier temps, des méthodes d'automatisation de l'extraction des spectres d'intérêt à partir des images infrarouges des damiers et d'automatisation des spectres ont été développées. L'estimation de la structure secondaire à partir des spectres infrarouges étant basée sur la construction de modèles de prédiction à partir de méthodes chimiométriques, un ensemble pertinent de protéines pour l'étape de calibration était obligatoire. Une banque de protéines constituée de 92 protéines disponibles dans le commerce, dont la structure était bien caractérisée par cristallographie aux rayons X, a été constituée dans ce but. Après élaboration des modèles prédictifs de la structure secondaire et la validation de l'approche des damiers de protéines, nous avons tenté d'optimiser les modèles pour améliorer les prédictions de structure secondaire par différentes approches. D'autre part, traiter des protéines présentant une structure jamais rencontrée dans les structures natives de notre bibliothèque de protéines de référence constituait un défi. Nous avons saisi l'opportunité d'analyser les modifications structurales d'un sous-ensemble de notre bibliothèque de protéines, caractérisé par un contenu structurel secondaire très différent en le soumettant à des conditions de dénaturation modérées La méthode de résolution de courbes multivariées des moindres carrés alternés (MCR-ALS) a été utilisée pour modéliser une nouvelle composante spectrale apparaissant dans l'ensemble protéique soumis à des conditions dénaturantes, et a permis de révéler un marqueur spectroscopique potentiel d'agrégation protéique permettant une évaluation semi-quantitative de son contenu. Alors que l’évaluation de la structure secondaire a été bien établie dans la première partie de ce travail, la structure tertiaire et la stabilité sont également critiques. L'échange hydrogène / deutérium (HDX) est une approche potentielle pour l’étude de la structure et de la dynamique des protéines. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons construit un dispositif qui a permis de suivre la cinétique d’échange HDX simultanément sur l'ensemble d’un damier. En conclusion, l'imagerie FTIR de damiers de protéines ouvre la porte à une analyse à haut débit de la structure secondaire des protéines et permettrait de mieux comprendre la structure et la dynamique tridimensionnelles grâce à l'enregistrement des courbes HDX. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'épilepsie est une maladie neurologique chronique caractérisée par des crises spontanées et récurrentes. Les crises sont générées par un déséquilibre dans le fonctionnement des neurotransmetteurs et des canaux ioniques qui contrôlent l'excitabilité. L'épileptogenèse est majoritairement associée à des pertes neuronales, une gliose, une inflammation plus ou moins importants. Un tiers des patients deviennent réfractaires. Récemment, plusieurs équipes ont montré une association entre les épilepsies focales pharmacorésistantes et la rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE). De plus, une implication du système immunitaire ainsi qu'une cause auto-immune de l'épilepsie ont été suggérées. Dans cette thèse, nous avons observé dans le tissu de patients atteints d'épilepsie pharmacorésistante du lobe temporal (ELT), des fuites d'Immunoglobulines G (IgG) dans le parenchyme et leur accumulation dans les neurones présentant des signes de neurodégénérescence. Le récepteur d'IgG de grande affinité FcyRI est surexprimé sur les cellules ayant une morphologie de type microglie/ macrophages, tandis que le récepteur de faible affinité FcyRIII et le récepteur inhibiteur FcγRII sont moins présents. Dans ce même tissu nous avons noté que les protéines du complément C3c et C5b9 sont exprimées. Ensuite, nous avons étudié si le modèle murin d'épilepsie focale induite par injection intra-amygdalienne de kaïnate reproduit la physiopathologie de l'ELT associée à une rupture de la BHE. ZO-1, la principale protéine des jonctions serrées, présente un marquage discontinu indiquant que la BHE a été affectée. Nous avons remarqué des fuites d'IgGs et d'albumine ainsi que leur accumulation dans le parenchyme coïncidant avec la survenue des crises. La présence d‘IgG dans l'épilepsie pourrait également avoir une cause auto-immune. Nous avons utilisé des puces à protéines pour identifier des antigènes qui induisent une réponse immunitaire, dans le plasma des patients atteints d'ELT, Nous avons sélectionné 19 auto-anticorps spécifiques qui peuvent servir de potentiels biomarqueurs diagnostiques L'ensemble de ces résultats suggère que les fuites d'IgG sont associées à une déficience neuronale, conduisant à des changements immunologiques dans le foyer épileptique qui participent à la pathogénèse de l'ELT. Nous pensons qu'une meilleure interprétation des profils de ces auto-anticorps pourrait offrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. / Epilepsy is a chronic neurologic disorder characterized by recurrent unprovoked seizures. Seizures are generated by an imbalance in the functioning of neurotransmitters and ion channels that control excitability. Epileptogenesis is mostly associated with neuronal loss, gliosis, and inflammation more or less important. A third of patients become drug refractory. Recently, several teams have shown an association between drug-resistant focal epilepsy and disruption of the blood-brain barrier (BBB). In addition, a possible role of the immune system and an autoimmune nature in epilepsy has been suggested. In this thesis, in the tissue of patients with drug-resistant temporal lobe epilepsy (TLE), leakage of immunoglobulin G (IgG) into the parenchyma and IgG accumulation in neurons with attendant signs of neurodegeneration was observed. In addition, the high affinity IgG receptor, FcγRI was expressed on microglia/macrophage shaped cells. The expression of the low affinity IgG receptor, FcγRIII and the inhibitory IgG receptor, FcγRII was decreased. In the same tissue the complement proteins C3c and C5b9 were present on astrocyte/ microglia and macrophage/ microglia shaped cells respectively. Then, we evaluated whether the mouse model of focal epilepsy induced by intra-amygdala microinjection of kainic acid reproduced a pathophysiology of TLE associated with BBB impairment. ZO-1, the main tight junction protein presented discontinuous staining indicating that BBB was affected. Both IgG and albumin extravasations from blood vessels were noted and its parenchymal accumulation was concomitant with seizure occurrence. Another hypothesis of IgG presence in epilepsy incriminates an auto-immune cause. Protein microarray technology was used for identification in pooled plasma samples, of antigens that bind plasma antibody from TLE patients. 19 potential autoantibodies were identified as potential diagnostic biomarkers. Together, these observations suggest that IgG leakage is associated with neuronal impairment, leading to immunological changes in epileptic focus involved in the pathogenesis of TLE. A better interpretation of the profiles of these autoantibodies could offer new therapeutic and diagnostic perspectives.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / During pregnancy, maternal liver exhibits robust growth to meet the metabolic demands of the developing placenta and fetus. Although hepatocyte hypertrophy and hyperplasia are seen in the maternal liver, the molecular and cellular mechanisms mediating the maternal hepatic adaptations to pregnancy is poorly understood. Previous microarray analysis revealed a most upregulated gene named Ascl1, a transcription factor essential for neural development, in the maternal liver at mid-gestation. The aims of the study were to (1) validate the activation of Ascl1 gene; (2) identify Ascl1-expressing cells; and (3) determine the fate of Ascl1-expressing cells, in the maternal liver during the course of gestation. Timed pregnancy was setup in mice and the maternal livers were collected at various stages of gestation. Maternal hepatic Ascl1 mRNA expression was evaluated by qRT-PCR and northern blotting. The results demonstrated that the transcript level of maternal hepatic Ascl1 is exponentially increased during the second half of pregnancy in comparison with a non-pregnant state. Using a Ascl1-GFP mouse model generated by others to monitor the behavior of neural progenitor cells, we found that maternal hepatic Ascl1-expressing cells are non-parenchymal cells, very small in size, and expanding during pregnancy. To map the fate of this cell population, we generated an in vivo tracing mouse model named Ascl1-CreERT2/ROSA26-LacZ. Using this model, we permanently labeled maternal hepatic Ascl1-expressing cells at midgestation by giving tamoxifen and analyzed the labeled cells in the maternal liver prior to parturition. We observed that the initial small Ascl1-expressing cells undergoing expansion at mid-gestation eventually became hepatocyte-like cells at the end stage of pregnancy. Taken together, our findings strongly suggest that Ascl1-expressing cells represent a novel population of hepatic progenitor cells and they can differentiate along hepatocyte lineage and contribute to pregnancy-induced maternal liver growth. Further studies are needed to firmly establish the nature and property of maternal hepatic Ascl1-expressing cells. At this stage, we have gained significant insights into the cellular mechanism by which the maternal liver adapts to pregnancy.