Orientador: Manoel Victor Franco Lemos / Coorientador: Arlindo Leal Boiça Junior / Banca: Lúcia Maria Carareto Alves / Banca: Fernando Hercos Valicente / Resumo: Bioinseticidas a base de Bacillus thuringiensis são utilizados há décadas no controle de Thyrinteina arnobia (Stoll, 1782) (Lepidoptera: Geometridae) em plantios de eucalipto no Brasil. No entanto, não há relatos de quais genes cry são eficientes para o controle desta praga. Neste sentido, 74 isolados de B. thuringiensis foram caracterizados por PCR para a detecção dos genes cry1, cry1Ab e cry1Ac e sua eficiência no controle de T. arnobia verificada por bioensaios. Os isolados Br9, Br69 Br74, Br81 e R26 apresentaram elevada mortalidade e sua CL50 foi determinada. Os genes cry1Ab e cry1Ac ocorreram isoladamente em 16% e 45% dos isolados, respectivamente, quando presentes em conjunto o controle das lagartas foi superior a 50%, e os valores de CL50 foram os mais elevados. Ambos os genes ocorreram em 11% dos isolados, os níveis de controle foram superiores a 80% e a CL50 era mais baixa, o que sugere que sua presença em conjunto confere maior toxicidade. É evidente que mais estudos em relação à detecção dos genes presentes em isolados de B. thuringiensis e sua contribuição no controle para T. arnobia são fundamentais para esclarecer quais genes conferem maior toxicidade e como eles atuam isoladamente ou em conjunto no controle dessas lagartas, visando a construção de plantas geneticamente modificadas, formulação de bioinseticidas ou desenvolvimento de programas de manejo de resistência destes insetos para a cultura do eucalipto no Brasil / Abstract: Biopesticides based on Bacillus thuringiensis have been used for decades to control Thyrinteina arnobia (Stoll, 1782) (Lepidoptera: Geometridae) in eucalyptus plantations in Brazil. However, there are no reports of which cry genes are efficient to control this insect pest. In this study, 74 strains of B. thuringiensis were characterized by PCR for detection of cry1, cry1Ab and cry1Ac genes and its efficiency in controlling T. arnobia was verified by bioassays. The strains Br9, Br69, Br74, Br81 and R26 showed the highest mortality rates and their LC50 was determined. The cry1Ab and cry1Ac genes occurred separately in 16% and 45% of the isolates, respectively, and when present together the larvae control was above 50%, and the LC50 values were the highest. Both genes occured in 11% of the isolates, the control levels exceeded 80% and the LC50 was lower, suggesting that their presence together confers higher toxicity. It became evident that further studies regarding the detection of the genes present in isolates of B. thuringiensis, and its contribution to control T. arnobia are essential to clarify which genes confer higher toxicity and how they act individually or together to control these caterpillars, aiming the construction of genetically modified plants, biopesticides formulation or development of more effective resistance management programs for these insects for the cultivation of eucalyptus in Brazil / Mestre

Orientador: Janete Apparecida Desidério / Resumo: O potencial biotecnológico das proteínas Cry e Vip provenientes da bactéria Bacillus thuringiensis é amplamente conhecido. Porém, a evolução da resistência de pragas é a principal ameaça a longo prazo do controle de insetos-praga por plantas transgênicas com toxinas desta bactéria. Estudos relatam a necessidade de se retardar a evolução da resistência e dentre as possibilidades, a utilização de mais de um gene na construção de plantas transgênicas mostra-se eficiente. Dessa forma, é importante buscar novos genes, com diferentes modos de ação, e selecionar os que apresentam atividade entomotóxica diferenciada para Diatraea flavipennella e Elasmopalpus lignosellus, que são pragas secundárias e potenciais da cana-de-açúcar. Para tanto, proteínas Cry1 e Vip3 foram expressas em Escherichia coli e a toxicidade verificada por meio de bioensaios com lagartas neonatas de ambas as espécies de insetos-praga. As proteínas foram purificadas, solubilizadas, ativadas com tripsina e biotiniladas. As BBMVs (Brush Border Membrane Vesicles) foram preparadas a partir dos intestinos de lagartas das duas espécies para realização de ensaios de competição homóloga e heteróloga. Considerando a CL50, as proteínas Cry1Ac e Vip3Aa foram as mais efetivas no controle dos insetos-praga em estudo. O ensaio de ligação mostrou que ocorreu interação entre todas as proteínas e os receptores das duas espécies de lagartas. Os ensaios de competição heteróloga demonstraram não haver competição entre as proteínas Cr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The biotechnological potential of Cry and Vip proteins from the bacterium Bacillus thuringiensis is widely known. However, the evolution of pest resistance is a major threat to long-term control of insect pests by transgenic plants with toxins of this bacterium. Studies have reported the need to slow down the evolution of resistance and, among the possibilities, the use of more than one gene in the construction of transgenic plants is shown to be efficient. Thus, it is important to look for new genes with different modes of action, and select those with different entomotoxic activity to Diatraea flavipennella and Elasmopalpus lignosellus, which are secondary and potential sugarcane pests. Therefore, Cry1 and Vip3 proteins were expressed in Escherichia coli and the toxicity was verified by bioassays using neonate larvae of both species of the insect pests. The proteins were purified, solubilized, and activated with trypsin and biotinylated. The BBMVs (Brush Border Membrane Vesicles) were prepared using the intestines of the two species to perform the homologous and heterologous competition assays. Considering the LC50, the Cry1Ac and Vip3Aa proteins were the most effective in controlling the insect pests in this study. The binding assays showed that there was interaction between the proteins and the receptors of the two species of larvae. The heterologous competition assays showed no competition between Cry1 and Vip3 proteins for the same binding sites for both species studied... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-12-16Bitstream added on 2014-08-13T18:01:02Z : No. of bitstreams: 1 000748612_20150116.pdf: 262543 bytes, checksum: 83687670798f532aa71d1023029e6d35 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-01-23T10:59:20Z: 000748612_20150116.pdf,Bitstream added on 2015-01-23T10:59:52Z : No. of bitstreams: 1 000748612.pdf: 1126755 bytes, checksum: d94522b75e5a7b2b4fd318e70207535a (MD5) / Os inseticidas químicos são amplamente utilizados no controle de insetos-praga, no entanto, causam enormes prejuízos ambientais. Uma alternativa a esses inseticidas é a utilização de microrganismos entomopatogênicos, que controlam seletivamente os insetos e preservam o meio ambiente. A bactéria Bacillus thuringiensis Berliner é considerada a espécie de maior interesse neste cenário, pois é responsável pela produção de proteínas inseticida. Genes de B. thuringiensis vêm sendo amplamente estudados e utilizados na construção de culturas transgênicas no mundo todo. No entanto, quando não associadas a áreas de refúgio podem acelerar a seleção de organismos resistentes em populações de insetos-praga. Estudos relatam a necessidade em retardar a evolução da resistência a insetos-praga e dentre as possibilidades, a utilização de mais de um gene na construção de plantas transgênica mostra-se eficiente. Desta forma, o presente estudo avaliou a suscetibilidade de Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) (Lepidoptera: Erebidae) e Chrysodeixis includens (Walker, 1857) (Lepidoptera: Noctuidae) às proteínas de B. thuringiensis, Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ca, Cry1Ea, Vip3Aa, Vip3Ae e Vip3Af. Após estimar a CL50 de cada proteína para cada espécie avaliou-se a interação entre as combinações de Vip3A+Cry1 e Cry1+Cry1. Os resultados sugerem que todas as proteínas foram eficientes no controle de ambas as espécies, destacando-se a proteína Cry1Ac (0,75 ng.cm-2) para A. gemmatalis e a proteína Vip3Af (1,4 ng.cm-2) para C. includens. O padrão geral de comparação da suscetibilidade das espécies frente às proteínas avaliadas indicou que há uma diferença significativa na toxicidade das proteínas para cada espécie. Verificou-se uma grande inibição do desenvolvimento larval de lagartas sobreviventes a CL50 de cada proteína. As interações das proteínas indicaram ... / Chemical insecticides are widely used to control insect pests, however, cause enormous environmental damage. An alternative to these insecticides is the use of entomopathogenic microorganisms which selectively control insects and preserve the environment. The Bacillus thuringiensis Berliner is the species of greatest interest responsible for production of insecticidal proteins. Genes of B. thuringiensis have been widely studied and used in the construction of transgenic crops worldwide. However, when not associated with refuge areas can accelerate the selection of resistant organisms in populations of insect pests. Studies have reported the need to slow the evolution of resistance to insect pests and among the possibilities, the use of more than one gene in the construction of transgenic plants proves efficient. Thus, the present study evaluated the susceptibility of Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) (Lepidoptera: Erebidae) and Chrysodeixis includens (Walker, 1857) (Lepidoptera: Noctuidae), from the proteins isolated from B. thuringiensis Cry1Aa , Cry1Ab , Cry1Ac , Cry1Ca , Cry1Ea , Vip3Aa , Vip3Ae and Vip3Af . After estimating the LC50 of each protein for each species evaluated the interaction between combinations of Vip3A + Cry1 and Cry1 + Cry1. The results suggest that all proteins were effective in controlling both species, emphasized the Cry1Ac protein (0.75 ng.cm-2) to A. gemmatalis and Vip3Af protein (1.4 ng.cm-2) to C. includens. A comparison of the susceptibility of the species to proteins indicated that there is a significant difference in toxicity for each species. There was a large inhibition of larval development of caterpillars surviving the LC50 of each protein. The interactions of proteins indicated the synergistic combinations Vip3Aa + Cry1Ea, Cry1Aa + Cry1Ab and Cry1Ea + Cry1Ac as alternatives for the control and management of resistance in A. gemmatalis and C. includens ...

Orientador: Janete Apparecida Desidério / Coorientador: Odair Aparecido Fernandes / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Ricardo Antonio Polanczyk / Banca: Alexandre de Sene Pinto / Banca: Ana Maria Guidelli Thuler / Resumo: Os inseticidas químicos são amplamente utilizados no controle de insetos-praga, no entanto, causam enormes prejuízos ambientais. Uma alternativa a esses inseticidas é a utilização de microrganismos entomopatogênicos, que controlam seletivamente os insetos e preservam o meio ambiente. A bactéria Bacillus thuringiensis Berliner é considerada a espécie de maior interesse neste cenário, pois é responsável pela produção de proteínas inseticida. Genes de B. thuringiensis vêm sendo amplamente estudados e utilizados na construção de culturas transgênicas no mundo todo. No entanto, quando não associadas a áreas de refúgio podem acelerar a seleção de organismos resistentes em populações de insetos-praga. Estudos relatam a necessidade em retardar a evolução da resistência a insetos-praga e dentre as possibilidades, a utilização de mais de um gene na construção de plantas transgênica mostra-se eficiente. Desta forma, o presente estudo avaliou a suscetibilidade de Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) (Lepidoptera: Erebidae) e Chrysodeixis includens (Walker, 1857) (Lepidoptera: Noctuidae) às proteínas de B. thuringiensis, Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ca, Cry1Ea, Vip3Aa, Vip3Ae e Vip3Af. Após estimar a CL50 de cada proteína para cada espécie avaliou-se a interação entre as combinações de Vip3A+Cry1 e Cry1+Cry1. Os resultados sugerem que todas as proteínas foram eficientes no controle de ambas as espécies, destacando-se a proteína Cry1Ac (0,75 ng.cm-2) para A. gemmatalis e a proteína Vip3Af (1,4 ng.cm-2) para C. includens. O padrão geral de comparação da suscetibilidade das espécies frente às proteínas avaliadas indicou que há uma diferença significativa na toxicidade das proteínas para cada espécie. Verificou-se uma grande inibição do desenvolvimento larval de lagartas sobreviventes a CL50 de cada proteína. As interações das proteínas indicaram ... / Abstract: Chemical insecticides are widely used to control insect pests, however, cause enormous environmental damage. An alternative to these insecticides is the use of entomopathogenic microorganisms which selectively control insects and preserve the environment. The Bacillus thuringiensis Berliner is the species of greatest interest responsible for production of insecticidal proteins. Genes of B. thuringiensis have been widely studied and used in the construction of transgenic crops worldwide. However, when not associated with refuge areas can accelerate the selection of resistant organisms in populations of insect pests. Studies have reported the need to slow the evolution of resistance to insect pests and among the possibilities, the use of more than one gene in the construction of transgenic plants proves efficient. Thus, the present study evaluated the susceptibility of Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1818) (Lepidoptera: Erebidae) and Chrysodeixis includens (Walker, 1857) (Lepidoptera: Noctuidae), from the proteins isolated from B. thuringiensis Cry1Aa , Cry1Ab , Cry1Ac , Cry1Ca , Cry1Ea , Vip3Aa , Vip3Ae and Vip3Af . After estimating the LC50 of each protein for each species evaluated the interaction between combinations of Vip3A + Cry1 and Cry1 + Cry1. The results suggest that all proteins were effective in controlling both species, emphasized the Cry1Ac protein (0.75 ng.cm-2) to A. gemmatalis and Vip3Af protein (1.4 ng.cm-2) to C. includens. A comparison of the susceptibility of the species to proteins indicated that there is a significant difference in toxicity for each species. There was a large inhibition of larval development of caterpillars surviving the LC50 of each protein. The interactions of proteins indicated the synergistic combinations Vip3Aa + Cry1Ea, Cry1Aa + Cry1Ab and Cry1Ea + Cry1Ac as alternatives for the control and management of resistance in A. gemmatalis and C. includens ... / Doutor