Köln, Univ., Diss., 2005. / Computerdatei im Fernzugriff.

Zugl.: Düsseldorf, Univ., Diss., 2008

Universiẗat, Diss., 2002--Würzburg.

Universiẗat, Diss., 2005--Köln.

RS1, ein Genprodukt von RSC1A1, ist entscheidend an der zelldichteabhängigen transkriptionellen Herunterregulation von SGLT1 in LLC-PK1 Zellen und an der post-transkriptionellen Herunterregulation von SGLT1 im Dünndarm beteiligt. RS1 hemmt die Freigabe von SGLT1 enthaltenden Vesikeln aus dem trans-Golgi Netzwerk und wandert in den Zellkern wo es die Transkription von SGLT1 inhibiert. In der vorliegenden Arbeit identifizierten wir eine neuartige 21 Aminosäuren lange nicht-konventionelle Kernlokalisierungssequenz (RS1 NLS) in RS1 vom Schwein (pRS1), die für die Kernlokalisierung von pRS1 nötig und ausreichend ist. RS1 NLS ist von zwei Konsensussequenzen für Phosphorylierung umrahmt, welche für die konfluenzabhängige Regulierung von RS1 NLS verantwortlich sind: Eine Stelle für Casein Kinase 2 (CK2) in der Position 348 und eine Stelle für Protein Kinase C (PKC) in der Position 370. Es wurde eine konfluenz-abhängige Kernlokalisierung mit den Aminosäuren 342-374 (R-NLS-Reg) beobachtet. Die Mutationsanalyse deutete darauf hin, dass Kernlokalisierung durch die Phosphorylierung von Serin 370 (PKC) geblockt wird, und dass die Phosphorylierung von Serin 348 (CK2) die Phosphorylierung von Serin 370 verhindert. Da während der Konfluenz CK2 herunterreguliert und PKC hochreguliert wird, deuten unsere Daten darauf hin, dass die Kernlokalisierung die zelldichteabhängigen Veränderungen in der transkriptionellen und posttranskriptionellen Hemmung von SGLT1 Expression koordiniert. / RS1, a gene product of RSC1A1, is critically involved in cell density-dependent transcriptional down-regulation of SGLT1 in LLC-PK1 cells and in the post-transcriptional down-regulation of SGLT1 in small intestine. RS1 inhibits the release of SGLT1 containing vesicles from the trans-Golgi network and migrates into the nucleus where it inhibits transcription of SGLT1. In the present work we identified a novel 21 amino acids-long nonconventional nuclear localization sequence (RS1 NLS) in porcine RS1 (pRS1) that is necessary and sufficient for nuclear targeting of pRS1. RS1 NLS is framed by two consensus sequences for phosphorylation which are responsible for confluence-dependent regulation of RS1 NLS: a casein kinase 2 (CK2) site in position 348 and a protein kinase C (PKC) site in position 370. Confluence-dependent nuclear targeting was observed with amino acids 342-374 (R-NLS-Reg). Mutation analysis suggested that nuclear targeting is blocked by phosphorylation of serine 370 (PKC) and that phosphorylation of serine 348 (CK2) prevents phosphorylation of serine 370. Because CK2 is down-regulated and PKC is up-regulated during confluence of LLC-PK1 cells, our data suggest that nuclear localization coordinates cell density-dependent changes in transcriptional and post-transcriptional inhibition of SGLT1 expression.

Die Pilzkörper von Drosophila melanogaster stellen eine für die Lebensfähigkeit dieses Organismus entbehrliche Gehirnstruktur dar. Die Entwicklungsprozesse, die der Bildung dieser zentralnervösen Struktur zugrunde liegen, sind gut erforscht. Die neuronalen Stammzellen, die für die Bildung dieser Gehirnstruktur verantwortlich sind, sind identifiziert und experimentell gut zugänglich. Daher bietet sich die Drosophila-Pilzkörperentwicklung als neurogenetisches Modellsystem an, grundlegende Mechanismen der Gehirnentwicklung durch die Untersuchung von Pilzkörperstrukturmutanten zu erforschen. In dieser Arbeit wurde mushroom bodies undersized P1 (mbuP1) als eine durch Transposon- Insertion in den Casein-Kinase-2ß-Genlokus verursachte, hypomorphe Mutation identifiziert, die zu einer starken Verringerung der Anzahl der die Pilzkörper bildenden intrinsischen Neurone führt. Eine Reversion des mbuP1-Pilzkörperphänotyps konnte unter anderem durch die Expression von Casein-Kinase-2ß-(CK2ß)-Transgenen im mbuP1-Hintergrund erzielt werden. Durch Rekombination wurde ein fertiler mbuP1-Stamm etabliert, der nun die Untersuchung der zellulären mbuP1-Defekte ermöglicht. Eine partielle, letale Deletion der CK2ß-Transkriptionseinheit wurde erzeugt. Die Letalität dieser Deletion konnte sowohl durch ein genomisches CK2ß-Transgen als auch durch die ubiquitäre Expression einer CK2ß-cDNA gerettet, und hierdurch die essentielle Funktion der CK2ß-Transkriptionseinheit in Drosophila belegt werden. Durch die ubiquitäre Expression von in vitro-mutagenisierten CK2ß-cDNAs im CK2ß-Letalhintergrund wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der regulatorischen CK2ß-Untereinheit durch die katalytisch aktive CK2α-Untereinheit kein lebensnotwendiger Prozess ist. Gleichartige Experimente wurden zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung eines CK2ß-Zinkfingermotivs und eines CK2ß-Destruction-Box-Motivs durchgeführt. Diese legen nahe, daß das Zinkfingermotiv im Gegensatz zum Destruction-Box-Motiv für die in vivo-Funktion der CK2ß-Untereinheit essentiell ist. Expression der in vitro-mutagenisierten CK2ß-cDNAs im mbuP1-Hintergrund werden die funktionelle Bedeutung der ausgetauschten Aminosäuren für die Pilzkörperentwicklung zeigen. Eine letale genetische Interaktion von mbuP1 mit einer Mutation des Drosophila-MAP-Kinase-Gens rolled (rlSem) und eine lebensfähige Interaktion von mbuP1 mit einer Mutation des Drosophila-S6-Kinase-p90rsk-Gens ignorant (ignP1), bei der Flügel- und Augenent-wicklungsdefekte zu beobachten sind, wurden gefunden. Es wurde zudem gezeigt, daß rlSem als Suppressor des Pilzkörperphänotyps eines schwächeren mbu-Allels wirkt. Hierdurch konnte eine Beteiligung der Casein-Kinase-2 an MAP-Kinase-Signalübertragungswegen wahrscheinlich gemacht werden. / Mushroom bodies are dispensable for the developing and adult Drosophila fly. The developmental processes underlying mushroom body formation are well studied, the neural stem cells responsable for their development are identified and experimentally well accessable. Therefore Drosophila mushroom body development can be used as a powerful neurogenetic model system to find out about fundamental mechanisms underlying brain development by studying mutant flies showing aberrant mushroom body development. In the course of this work, mushroom bodies undersized P1 (mbuP1) was identified as a hypomorphic casein kinase 2ß-allele (CK2ß) caused by the insertion of transposable elements in the casein kinase 2ß gene locus. The mbuP1-mutation leads to a drastic reduction of the number of intrinsic neurons forming the adult mushroom body. Expression of transgenic CK2ß in a mbuP1-mutant background led to a reversion of the mbuP1-associated mushroom body phenotype. Fertility of mbuP1-flies could be partially restored by recombining the original mbuP1{P3843/2}-chromosome with a w1118-chromosome. This will allow future studies to identify the cellular defects caused by mbuP1. A partial deletion of the CK2ß gene causes lethality which could be rescued by either a genomic CK2ß-transgene or by ubiquitous expression of a CK2ß-cDNA. Therefore, CK2ß has been shown to be an essential gene in Drosophila. By ubiquitous expression of in vitro mutagenized CK2ß-cDNAs in a CK2ß-lethal background, a non-essential role of phosphorylation of the regulatory CK2ß-subunit by the catalytically active CK2α-subunit could be shown. Similar experiments were performed to examine the role of a CK2ß-zincfinger motif and a CK2ß-destruction-box motif. The obtained results suggest a non-essential in vivo function for the destruction-box motif and an essential in vivo function for the zincfinger-motif. Expression of the in vitro mutagenized CK2ß-cDNAs in a mbuP1-background will reveal the functional significance of the substituted amino acids for mushroom body development. Performed genetic interaction studies showed a lethal interaction of mbuP1 with a mutation in the Drosophila-MAP-kinase gene rolled (rlSem) and a viable genetic interaction with a mutation in the Drosophila-S6-kinase-p90rsk gene ignorant (ignP1) which revealed defects in wing formation and eye development. It also could be shown that rlSem acts as a suppressor of the mushroom body phenotype associated with a weaker mbu-allele. These observations point towards a role of casein kinase 2 in MAP-kinase signalling.

Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der Länge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquitär exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abhängigen Funktionen führt. Der um 83 Aminosäuren verlängerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches für die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte überraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator für Gbetagamma-abhängige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden Fähigkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verlängerten N-Terminus durch die ubiquitäre Casein Kinase 2 (CK2) zurückgeführt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) führte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsfähigkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinität nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsfähigkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminosäure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsfähigkeit, als auch die Fähigkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuhängen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinfärbung) nicht die Funktionsfähigkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu können. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass möglicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein könnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Domänen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma führte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert. / Phosducin-like protein (PhLP) exists in two splice variants PhLPLONG (PhLPL) and PhLPSHORT (PhLPS): They differ in the length of their N-termini and their expression pattern: The long form (PhLPL) is a ubiquitously expressed protein and binds G-protein betagamma-subunits (Gbetagamma) and thereby inhibits Gbetagamma-mediated function. The extended N-terminus of PhLPL (83 amino acids) contains a highly conserved Gbetagamma-binding motif which plays the crucial role in binding and regulating Gbetagamma-subunits. In contrast, the short splice variant PhLPS, which has a more restricted expression, lacks this motif and did not seem to exert a major Gbetagamma-inhibition, when tested with purified proteins. In the present work, for the first time, we investigated the Gbetagamma-inhibiting properties of PhLPL and PhLPS in intact cells. Surprisingly, PhLPS was the more potent and effective Gbetagamma inhibitor, while PhLPL was limited in this respect. The reason for the limited ability to inhibit Gbetagamma in intact cells was found in a constitutive phosphorylation by the ubiquitious kinase casein kinase 2 (CK2). The responsible phosphorylation sites could be identified (S18, T19, S20) and mutation of those sites into alanines could ameliorate the function of PhLPL. We therefore hypothesised that CK2 dependent phosphorylation of PhLPL should reduce binding affinity towards Gbetagamma subunits. But instead, direct phosphorylation of recombinant PhLPL by CK2 did not reduce its binding affinites. A thorough analysis of the N terminus of PhLPL revealed that a single mutation of the conserved N terminal binding motif (W66V) was sufficient to ablate Gbetagamma binding and Gbetagamma inhibition in intact cells. A first hint to an alternative mechanism came from the observation that - in the presence of PhLPS - the protein content of Gbeta and Ggamma subunits was dramatically reduced (as determined by Western blotting). This phenomenon seemed to be dependent on a proteasomal pathway (which was shown by effects of the specific proteasome inhibitor lactacystine). But a stabilization of the Gbeta and Ggamma subunits through N terminal fusion of a dye-labeling protein could not restore the function of Gbetagamma in the presence of PhLPS. Instead, it could be demonstrated that under these conditions Gbeta and Ggamma did not form functional dimers any more. This finding led to the conclusion that a protein folding mechanism was possibly involved. A postulated role in the folding of WD40 repeat proteins (like the Gbeta subunit) was assumed for the cytosolic chaperonin complex CCT in the literature. PhLPS was able to bind to TCP-1alpha, a subunit of CCT, as were the functionally active domains of PhLPS. We further demonstrated that the inhibition of CCT by RNA interference with TCP-1alpha also led to down-regulation of Gbeta and Ggamma subunits. So, in this thesis, a novel mechanism of G-protein regulation through inhibition of Gbetagamma protein folding was described. Further, a switch mechanism between direct Gbetagamm binding (induced by phosphorylation of PhLPL) and inhibition of Gbetagamm folding (induced by alternative splicing or dephosphorylation of PhLP) is postulated.