A Na,K-ATPase é uma proteína encontrada na membrana plasmática de praticamente todas as células animais, que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar 3 íons Na+ e 2 íons K+. É composta por duas subunidades denominadas e . Um aspecto que ainda gera controvérsias se refere à sua forma de associação nativa e funcional como um protômero ou ainda na forma de oligômeros ()2 ou ()4. Uma forma de estudar essa enzima é pela sua solubilização da membrana, e posteriormente reconstituição em lipossomos de DPPC:DPPE. A caracterização cinética e estrutural desse sistema mostra que a enzima se apresenta na forma oligomérica ()2. O objetivo desse trabalho foi avaliar os mecanismos de dissociação e de desnaturação da Na,K-ATPase solubilizada bem como da reconstituída em lipossomos de DPPC:DPPE, por agentes físicos (temperatura) e químicos (relação proteína:detergente, uso de agentes caotrópicos como a guanidina e mudanças de pH), para interpretar as suas formas de associação e regulação. Para isso, foram realizados experimentos de dicroísmo circular (CD), calorimetria (DSC), infravermelho (FTIR), fluorescência de emissão do triptofano, tensão superficial, elasticidade, atividade catalítica (ATPase e pNPPase). Os estudos de CD em função da variação de temperatura mostraram que ocorre uma transição na curva de elipticidade (222 nm) a 43,7°C para a enzima solubilizada e a 42,0°C para a enzima reconstituída em lipossomos. Estas transições foram também encontradas pela técnica de FTIR. Os experimentos por DSC para a enzima solubilizada revelaram a presença de três picos em 54,7; 64,7 e 67,8°C. Já para a enzima reconstituída observam-se transições em menores temperaturas entre 30 a 40ºC (referentes aos lipídios) e ainda a preservação do pico de transição para proteína em 68,0°C. A análise de fluorescência de triptofano para ambas formas de enzima revelou deslocamentos de pico máximo de emissão a partir de 60°C. Já a presença de guanidina mostrou dois pontos de transição em 3 e 5 mol.L-1 para a Na,K-ATPase solubilizada. O efeito de diferentes meios tamponantes revelou que a enzima apresenta maiores conteúdos em -hélice em pH 7,5, concomitante com um aumento na intensidade de emissão de fluorescência do triptofano na faixa de pH de 5,0 a 8,5. Analisando conjuntamente todas as técnicas podemos propor um mecanismo de dissociação/desnaturação da enzima em função da temperatura. Primeiramente a enzima passa do seu estado oligomérico ()2 e forma protômeros . A atividade ATPase é perdida completamente (acima de 60ºC) quando as subunidades são completamente separadas, ocorrendo então uma agregação das subunidades , através dos domínios citoplasmáticos. Finalmente, a análise da enzima em diferentes proporções de proteína:detergente revela que a Na,K-ATPase, na presença de concentrações abaixo da CMC, se encontra na forma ()2 ou ainda ()4 (dependendo da concentração de proteína). Já para concentrações acima da CMC ocorre a separação das subunidades e consequente perda de atividade catalítica. Devido à dependência da atividade ATPase com seu estado conformacional e seu estado de oligomerização, este estudo realizado por técnicas bioquímicas e biofísicas, resulta em novas informações acerca da compreensão dos mecanismos que controlam o processo de associação, o qual é importante para a função da enzima na membrana natural. / Na,K-ATPase is a protein found in the plasmatic membrane of almost all animal cells and it uses the energy from ATP hydrolysis to transport 3 Na+ ions and 2 K+ ions. It is formed by subunits called and. One controversial aspect refers to its native and functional association form as a protomer or still in ()2 or ()4 oligomers form. One way to study this protein in our laboratory is by its solubilization from membrane, and later reconstitution in liposome from DPPC:DPPE. The kinetic and structural characterization fo this system shows that the enzyme presents itself in the oligomeric form ()2. The aim of this work was to evaluate the dissociation and denaturation mechanisms of the solubilized NA,K-ATPase as well as the one reconstituted in DPPC:DPPE liposome, by physic (temperature) and chemical agents (relation protein:detergent, use of chaotropic agents as Guanidine chloride, or still by the pH changes, to interpret its association and regulation forms. To that end, experiments of circular dichroism (CD), calorimetry (DSC), superficial tension, elasticity , catalytic activity (ATPase an pNPPase) were done. The CD studies in function of temperature variation have shown that a transition occurs in the ellipticity curve (222 nm) at 43.7ºC for the solubilized enzyme and at 42.0ºC for the enzyme reconstituted in liposome. These transitions were also found by the FTIR technique. The experiments by DSC for the solubilized enzyme have shown the presence of three peaks at 54.7ºC, 64.7ºC and 67.8ºC. As for the reconstituted enzyme, transitions in lower temperatures between 30ºC and 40ºC (concerning the lipids) and also the preservation of the transition peak for the protein at 68.0ºC were observed. The Tryptophane fluorescence analysis for both enzyme forms has revealed emission maximum peak shifts starting from 60ºC. The Guaniddine presence has shown two transition points at 3 and 5 mol.L-1 for the solubilized Na,K-ATPase. The effect of different buffer media has shown that the enzyme presents higher contents in -helix at pH 7.5, concomitant with an increase of the intensity of tryptophane fluorescence emission in the pH range of 5.0 to 8.5. Analyzing all the techniques together we can propose a dissociation/denaturation mechanism in function of the temperature. First, the enzyme goes from its oligomeric ()2 state and forms protomers. The ATPase activity é totally lost ( over 60ºC) when the subunits are completely separated, when an subunits aggregation then occurs, through the cytoplasmatic domains. Finally, the analysis of the enzyme in different proportions of protein:detergent reveals that the NA,K-ATPase, in the presence of concentrations bellow CMS, is in the ()2 or yet in the ()4 form (Depending on protein concentration). Now for concentrations above CMS, the separation of the subunits occurs and consequent catalytic activity loss. Due to the ATPase activity dependence on its conformational form and oligomerization state, this study done with biophysical and biochemistry techniques, results in new information on the comprehension of the mechanisms that control the association processes, which is important to the enzyme function in the natural membrane.

Os osteoblastos são responsáveis pelo início do processo de biomineralização óssea mediada pela liberação de vesículas da matriz (MVs). As MVs surgem por brotamento das superfícies laterais dos osteoblastos e são secretadas para a matriz. A membrana das MVs possuem níveis elevados de Fosfatase Alcalina (TNAP), entre outra enzimas/proteínas, bem como de Chol, em comparação com a membrana plasmática. O objetivo deste estudo foi a construção de proteolipossomos constituídos por Dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) ou Dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), com Colesterol (Chol) em diferentes proporções para a caracterização cinética da TNAP, utilizando os substratos ATP, PPi e ADP, a fim de se obter um sistema que mimetize as MVs. O aumento da concentração de Chol dificultou a incorporação da TNAP aos sistemas constituídos com DPPC, e facilitou a sua incorporação aos constituídos por DOPC. A presença do Chol em todos os sistemas miméticos preparados afetou os parâmetros cinéticos de hidrólise da TNAP para todos os substratos estudados. Entretanto, independentemente da presença do Chol, a hidrólise do PPi apresentou sempre uma maior eficiência (maior kcat/K0.5), sugerindo que este substrato provavelmente possa ser hidrolisado preferencialmente. O tratamento com 2 mM de ciclodextrina (bmCD), resultou na remoção de apenas 70% do Chol de proteolipossomos constituídos por DPPC:Chol 36% mol. Estudos de calorimetria diferencial (DSC) revelaram que a bmCD fica ligada ao sistemas vesiculares causando interferência para os demais ensaios. Quando 36% mol de colestenona (Achol), um análogo de Chol, foi empregado na construção dos proteolipossomos de DPPC, foram encontrados comportamentos cinéticos distintos para a TNAP. O ATP foi hidrolisado com uma Vmáx menor que a os sistemas constituídos por DPPC:Chol 36% e maior do que para sistemas de DOPC:Chol 36% mol. Os valores de K0.5 foram menores para DPPC:Achol 36 % mol em comparação aos sistemas análogos. Com relação a hidrolise do PPi, os parâmetros cinéticos foram similares, em relação aos sistemas estudados contendo DPPC:Chol ou DOPC:Chol. Por fim, foi avaliada a capacidade de propagação de nódulos de mineralização pelos sistemas vesiculares contendo DPPC, DPPC:Chol e DPPC:Achol (com e sem TNAP incorporada), utilizando o ATP como substrato. A mineralização foi cerda de 16 vezes mais eficiente na presença de protelipossomos que continham tanto Chol ou colestenona, do que para o sistema somente constituído por DPPC (cerca de 4 vezes), quando comparados com os respectivos sistemas de lipossomos (na ausência de enzima). Diante destas diferenças apresentadas, tanto no comportamento cinético, quanto na capacidade de mineralização, pode-se suger que o microambiente lipídico tem um importante papel das MVs. Uma explicação que pode ser sugerida é que fatores termodinâmicos como: a diminuição da entalpia de transição; perda de pré-transição; presença de cargas superficiais; presença de diferentes substratos; bem como, orientações das ligações de hidrogênio com a molécula de água na superfície dos proteolipossomos, podem acarretar em modificações conformacionais na TNAP. A relevância dos resultados apresentados pode contribuir no entendimento da função dos lipídios e de suas interações com as proteínas presentes na MVs no processo de biomineralização. / Osteoblasts are responsible for initiating the bone biomineralization process mediated by the release of matrix vesicles (MVs). The MVs arise by budding from the membrane of the osteoblasts and are secreted into the matrix. The MVs membrane has high levels of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP), among other enzymes/proteins, as well as cholesterol, compared with the plasma membrane. The objective of this study was to build proteoliposomes constituted by Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) or dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), with cholesterol (Chol) in different molar ratios for the kinetic characterization of TNAP, using the substrates ATP, ADP and PPi, in order to obtain systems that mimic the MVs. The increase in the cholesterol concentration hampered the incorporation of TNAP into the DPPC systems, but favored its incorporation into the DOPC liposomes. The presence of cholesterol in all prepared mimetic systems affected the kinetic parameters of hydrolysis for all substrates studied. Regardless of the presence of cholesterol, PPi hydrolysis always showed greater catalytic efficiency (kcat/K0.5), suggesting a preferential hydrolysis of this substrate. Treatment with 2 mM cyclodextrin (BMCD) resulted in removal of 70% of the cholesterol from the proteoliposome constituted of DPPC:Cholesterol 36% (molar ratio). Differential scanning calorimetry (DSC) studies showed that BMCD was bound to the vesicular systems interfering with the other assays. When 36% of cholestenone (Achol), an analogue of cholesterol, was employed in the construction of DPPC proteoliposomes, a different kinetic behavior was observed for TNAP. The Vmax for ATP hydrolysis was lower compared with the systems constituted of DPPC:Chol 36% and higher than that obtained for the DOPC:Chol 36% system. The values of K0.5 were lower for DPPC:Achol 36% compared to the similar systems. With respect to the hydrolysis of PPi, the kinetic parameters were similar for the systems constituted of DPPC:Chol and DOPC:Chol. Finally, we evaluated the ability of the vesicular systems containing DPPC, DPPC:Chol and DPPC:Achol (with and without TNAP incorporated) to propagate mineralization nodules, using ATP as substrate. The mineralization was about 16 times more efficient in the presence of proteoliposomes containing Chol or Achol than for the system constituted of DPPC only (about 4 times more efficient) compared with the corresponding liposome (in the absence of enzyme). Given the differences observed for both the kinetic behavior and the mineralization ability of the different systems, we suggest that the lipid microenvironment plays an important role in MVs function. A possible explanation for these differences is that thermodynamic factors such as the decrease in the enthalpy of transition and the loss of pre-transition, as well as the presence of surface charges, the presence of different substrates, and the orientation of hydrogen bonds with the water molecule on the surface of the proteoliposomes, may cause conformational changes in TNAP molecule. These relevant results can contribute for the understanding of the role of lipids and their interactions with proteins present in MVs in the biomineralization process.

A mineralização do esqueleto começa dentro de vesículas matriz derivadas de células (MVs); então, os minerais se propagam para a matriz de colágeno extracelular. A fosfatase alcalina não específica de tecido (TNAP) degrada o pirofosfato inorgânico (PPi), um potente inibidor da mineralização, quee contribui com Pi (Fosfato) de ATP para iniciar a mineralização. Em comparação com a membrana plasmática, as MVs são ricas em Colesterol (Chol) (32%) e TNAP, mas como o Chol influencia a atividade da TNAP ainda não está claro. Nós reconstituímos TNAP em lipossomos de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dimiristoilfosfocolina (DMPC) dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) combinada com Chol ou seus derivados Colestenona (Achol) e Ergosterol (Ergo). Comparamos as propriedades cinéticas: Velocidade máxima de hidrólise (Vmax), constante de afinidade (k0,5), cooperatividade (n) e eficiência catalítica (kcat / k0,5) da TNAP para os substratos fisiológicos ATP e PPi, quando o TNAP é incorporada nestes diferentes microambientes lípidicos. O DPPC mais 36% de esteróis em lipossomos aumentaram a atividade catalítica do TNAP em relação ao ATP. A presença de Chol também aumentou a propagação de minerais em 3,4 vezes. A eficiência catalítica da TNAP em relação ao ATP foi quatro vezes menor nos proteolipossomos de DOPC, em comparação aos proteolipossomos do DPPC. Os proteolipossomos DOPC também aumentaram a biomineralização 2,8 vezes em comparação com os proteolipossomos de DPPC. O TNAP catalisou a hidrólise do ATP mais eficientemente no caso do proteolipossomo consistindo em DOPC com 36% de Chol. O mesmo comportamento surgiu com Achol e Ergo. A organização do lipídio e a estrutura do esterol influenciaram a tensão superficial (), a atividade fosfohidrolítica do TNAP na monocamada e a eficiência catalítica do TNAP nas bicamadas. Membranas na fase L (Achol) proporcionaram melhores parâmetros cinéticos em relação às membranas na fase Lo (Chol e Ergo). a presença de SM ou Chol: SM 90:10 (mol%), proteolipossomos DPPC não alterou os valores de eficiência catalítica, para a hidrólise do ATP. No entanto, estes proteolipossomos aumentaram a propagação mineral em cerca de 4,5 e 8 vezes, respectivamente, em comparação com DPPC puro. O aumento na eficiência catalítica para proteolipossomos contendo DMPC: SM 90:10 e DMPC: Chol: SM 80:10:10 (% molar) foi observado. Em conclusão, as propriedades físicas e a organização lateral de lipídios em proteolipossomas são cruciais para o controle. propagação mineral mediada pela atividade da TNAP durante a mineralização / Mineralization of the skeleton starts within cell-derived matrix vesicles (MVs); then, minerals propagate to the extracellular collagenous matrix. Tissuenonspecific alkaline phosphatase (TNAP) degrades inorganic pyrophosphate (PPi), a potent inhibitor of mineralization, and contributes Pi (Phosphate) from ATP to initiate mineralization. Compared to the plasma membrane, MVs are rich in Cholesterol (Chol) (32%) and TNAP, but how Chol influences TNAP activity remains unclear. We have reconstituted TNAP in liposomes of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dimyristoylphosphocholine (DMPC) dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) combined with Chol or its derivatives Cholestenone (Achol) and Ergosterol (Ergo). We compare the kinetic properties: maximum rate of hydrolysis (Vmax), affinity constant (k0,5), cooperativity (n) and catalytic efficiency (kcat / k0,5) of TNAP for the physiological substrates ATP and PPi, when TNAP is incorporated in these different microenvironments lipids. DPPC plus 36% sterols in liposome increased the catalytic activity of TNAP toward ATP. The presence of Chol also increased the propagation of minerals by 3.4-fold. The catalytic efficiency of TNAP toward ATP was fourfold lower in DOPC proteoliposomes as compared to DPPC proteoliposomes. DOPC proteoliposomes also increased biomineralization by 2.8-fold as compared to DPPC proteoliposomes. TNAP catalyzed the hydrolysis of ATP more efficiently in the case of the proteoliposome consisting of DOPC with 36% Chol. The same behavior emerged with Achol and Ergo. The organization of the lipid and the structure of the sterol influenced the surface tension (), the TNAP phosphohydrolytic activity in the monolayer, and the TNAP catalytic efficiency in the bilayers. Membranes in the L phase (Achol) provided better kinetic parameters as compared to membranes in the Lo phase (Chol and Ergo). The presence of SM or Chol:SM 90:10 (mol%), DPPC-proteoliposomes did not alter the catalytic efficiency values, for the ATP hydrolysis. However, these proteoliposomes increased the mineral propagation by about 4.5 and 8-fold, respectively, compared to neat DPPC. The increase in catalytic efficiency for proteoliposomes containing DMPC:SM 90:10 and DMPC:Chol:SM 80:10:10 (mol%) was observed. In conclusion, the physical properties and the lateral organization of lipids in proteoliposomes are crucial to control mineral propagation mediated by TNAP activity during mineralization

A mineralização do esqueleto começa dentro de vesículas matriz derivadas de células (MVs); então, os minerais se propagam para a matriz de colágeno extracelular. A fosfatase alcalina não específica de tecido (TNAP) degrada o pirofosfato inorgânico (PPi), um potente inibidor da mineralização, quee contribui com Pi (Fosfato) de ATP para iniciar a mineralização. Em comparação com a membrana plasmática, as MVs são ricas em Colesterol (Chol) (32%) e TNAP, mas como o Chol influencia a atividade da TNAP ainda não está claro. Nós reconstituímos TNAP em lipossomos de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dimiristoilfosfocolina (DMPC) dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) combinada com Chol ou seus derivados Colestenona (Achol) e Ergosterol (Ergo). Comparamos as propriedades cinéticas: Velocidade máxima de hidrólise (Vmax), constante de afinidade (k0,5), cooperatividade (n) e eficiência catalítica (kcat / k0,5) da TNAP para os substratos fisiológicos ATP e PPi, quando o TNAP é incorporada nestes diferentes microambientes lípidicos. O DPPC mais 36% de esteróis em lipossomos aumentaram a atividade catalítica do TNAP em relação ao ATP. A presença de Chol também aumentou a propagação de minerais em 3,4 vezes. A eficiência catalítica da TNAP em relação ao ATP foi quatro vezes menor nos proteolipossomos de DOPC, em comparação aos proteolipossomos do DPPC. Os proteolipossomos DOPC também aumentaram a biomineralização 2,8 vezes em comparação com os proteolipossomos de DPPC. O TNAP catalisou a hidrólise do ATP mais eficientemente no caso do proteolipossomo consistindo em DOPC com 36% de Chol. O mesmo comportamento surgiu com Achol e Ergo. A organização do lipídio e a estrutura do esterol influenciaram a tensão superficial (), a atividade fosfohidrolítica do TNAP na monocamada e a eficiência catalítica do TNAP nas bicamadas. Membranas na fase L (Achol) proporcionaram melhores parâmetros cinéticos em relação às membranas na fase Lo (Chol e Ergo). a presença de SM ou Chol: SM 90:10 (mol%), proteolipossomos DPPC não alterou os valores de eficiência catalítica, para a hidrólise do ATP. No entanto, estes proteolipossomos aumentaram a propagação mineral em cerca de 4,5 e 8 vezes, respectivamente, em comparação com DPPC puro. O aumento na eficiência catalítica para proteolipossomos contendo DMPC: SM 90:10 e DMPC: Chol: SM 80:10:10 (% molar) foi observado. Em conclusão, as propriedades físicas e a organização lateral de lipídios em proteolipossomas são cruciais para o controle. propagação mineral mediada pela atividade da TNAP durante a mineralização / Mineralization of the skeleton starts within cell-derived matrix vesicles (MVs); then, minerals propagate to the extracellular collagenous matrix. Tissuenonspecific alkaline phosphatase (TNAP) degrades inorganic pyrophosphate (PPi), a potent inhibitor of mineralization, and contributes Pi (Phosphate) from ATP to initiate mineralization. Compared to the plasma membrane, MVs are rich in Cholesterol (Chol) (32%) and TNAP, but how Chol influences TNAP activity remains unclear. We have reconstituted TNAP in liposomes of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), dimyristoylphosphocholine (DMPC) dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) combined with Chol or its derivatives Cholestenone (Achol) and Ergosterol (Ergo). We compare the kinetic properties: maximum rate of hydrolysis (Vmax), affinity constant (k0,5), cooperativity (n) and catalytic efficiency (kcat / k0,5) of TNAP for the physiological substrates ATP and PPi, when TNAP is incorporated in these different microenvironments lipids. DPPC plus 36% sterols in liposome increased the catalytic activity of TNAP toward ATP. The presence of Chol also increased the propagation of minerals by 3.4-fold. The catalytic efficiency of TNAP toward ATP was fourfold lower in DOPC proteoliposomes as compared to DPPC proteoliposomes. DOPC proteoliposomes also increased biomineralization by 2.8-fold as compared to DPPC proteoliposomes. TNAP catalyzed the hydrolysis of ATP more efficiently in the case of the proteoliposome consisting of DOPC with 36% Chol. The same behavior emerged with Achol and Ergo. The organization of the lipid and the structure of the sterol influenced the surface tension (), the TNAP phosphohydrolytic activity in the monolayer, and the TNAP catalytic efficiency in the bilayers. Membranes in the L phase (Achol) provided better kinetic parameters as compared to membranes in the Lo phase (Chol and Ergo). The presence of SM or Chol:SM 90:10 (mol%), DPPC-proteoliposomes did not alter the catalytic efficiency values, for the ATP hydrolysis. However, these proteoliposomes increased the mineral propagation by about 4.5 and 8-fold, respectively, compared to neat DPPC. The increase in catalytic efficiency for proteoliposomes containing DMPC:SM 90:10 and DMPC:Chol:SM 80:10:10 (mol%) was observed. In conclusion, the physical properties and the lateral organization of lipids in proteoliposomes are crucial to control mineral propagation mediated by TNAP activity during mineralization

Os osteoblastos são responsáveis pelo início do processo de biomineralização óssea mediada pela liberação de vesículas da matriz (MVs). As MVs surgem por brotamento das superfícies laterais dos osteoblastos e são secretadas para a matriz. A membrana das MVs possuem níveis elevados de Fosfatase Alcalina (TNAP), entre outra enzimas/proteínas, bem como de Chol, em comparação com a membrana plasmática. O objetivo deste estudo foi a construção de proteolipossomos constituídos por Dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) ou Dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), com Colesterol (Chol) em diferentes proporções para a caracterização cinética da TNAP, utilizando os substratos ATP, PPi e ADP, a fim de se obter um sistema que mimetize as MVs. O aumento da concentração de Chol dificultou a incorporação da TNAP aos sistemas constituídos com DPPC, e facilitou a sua incorporação aos constituídos por DOPC. A presença do Chol em todos os sistemas miméticos preparados afetou os parâmetros cinéticos de hidrólise da TNAP para todos os substratos estudados. Entretanto, independentemente da presença do Chol, a hidrólise do PPi apresentou sempre uma maior eficiência (maior kcat/K0.5), sugerindo que este substrato provavelmente possa ser hidrolisado preferencialmente. O tratamento com 2 mM de ciclodextrina (bmCD), resultou na remoção de apenas 70% do Chol de proteolipossomos constituídos por DPPC:Chol 36% mol. Estudos de calorimetria diferencial (DSC) revelaram que a bmCD fica ligada ao sistemas vesiculares causando interferência para os demais ensaios. Quando 36% mol de colestenona (Achol), um análogo de Chol, foi empregado na construção dos proteolipossomos de DPPC, foram encontrados comportamentos cinéticos distintos para a TNAP. O ATP foi hidrolisado com uma Vmáx menor que a os sistemas constituídos por DPPC:Chol 36% e maior do que para sistemas de DOPC:Chol 36% mol. Os valores de K0.5 foram menores para DPPC:Achol 36 % mol em comparação aos sistemas análogos. Com relação a hidrolise do PPi, os parâmetros cinéticos foram similares, em relação aos sistemas estudados contendo DPPC:Chol ou DOPC:Chol. Por fim, foi avaliada a capacidade de propagação de nódulos de mineralização pelos sistemas vesiculares contendo DPPC, DPPC:Chol e DPPC:Achol (com e sem TNAP incorporada), utilizando o ATP como substrato. A mineralização foi cerda de 16 vezes mais eficiente na presença de protelipossomos que continham tanto Chol ou colestenona, do que para o sistema somente constituído por DPPC (cerca de 4 vezes), quando comparados com os respectivos sistemas de lipossomos (na ausência de enzima). Diante destas diferenças apresentadas, tanto no comportamento cinético, quanto na capacidade de mineralização, pode-se suger que o microambiente lipídico tem um importante papel das MVs. Uma explicação que pode ser sugerida é que fatores termodinâmicos como: a diminuição da entalpia de transição; perda de pré-transição; presença de cargas superficiais; presença de diferentes substratos; bem como, orientações das ligações de hidrogênio com a molécula de água na superfície dos proteolipossomos, podem acarretar em modificações conformacionais na TNAP. A relevância dos resultados apresentados pode contribuir no entendimento da função dos lipídios e de suas interações com as proteínas presentes na MVs no processo de biomineralização. / Osteoblasts are responsible for initiating the bone biomineralization process mediated by the release of matrix vesicles (MVs). The MVs arise by budding from the membrane of the osteoblasts and are secreted into the matrix. The MVs membrane has high levels of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP), among other enzymes/proteins, as well as cholesterol, compared with the plasma membrane. The objective of this study was to build proteoliposomes constituted by Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) or dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), with cholesterol (Chol) in different molar ratios for the kinetic characterization of TNAP, using the substrates ATP, ADP and PPi, in order to obtain systems that mimic the MVs. The increase in the cholesterol concentration hampered the incorporation of TNAP into the DPPC systems, but favored its incorporation into the DOPC liposomes. The presence of cholesterol in all prepared mimetic systems affected the kinetic parameters of hydrolysis for all substrates studied. Regardless of the presence of cholesterol, PPi hydrolysis always showed greater catalytic efficiency (kcat/K0.5), suggesting a preferential hydrolysis of this substrate. Treatment with 2 mM cyclodextrin (BMCD) resulted in removal of 70% of the cholesterol from the proteoliposome constituted of DPPC:Cholesterol 36% (molar ratio). Differential scanning calorimetry (DSC) studies showed that BMCD was bound to the vesicular systems interfering with the other assays. When 36% of cholestenone (Achol), an analogue of cholesterol, was employed in the construction of DPPC proteoliposomes, a different kinetic behavior was observed for TNAP. The Vmax for ATP hydrolysis was lower compared with the systems constituted of DPPC:Chol 36% and higher than that obtained for the DOPC:Chol 36% system. The values of K0.5 were lower for DPPC:Achol 36% compared to the similar systems. With respect to the hydrolysis of PPi, the kinetic parameters were similar for the systems constituted of DPPC:Chol and DOPC:Chol. Finally, we evaluated the ability of the vesicular systems containing DPPC, DPPC:Chol and DPPC:Achol (with and without TNAP incorporated) to propagate mineralization nodules, using ATP as substrate. The mineralization was about 16 times more efficient in the presence of proteoliposomes containing Chol or Achol than for the system constituted of DPPC only (about 4 times more efficient) compared with the corresponding liposome (in the absence of enzyme). Given the differences observed for both the kinetic behavior and the mineralization ability of the different systems, we suggest that the lipid microenvironment plays an important role in MVs function. A possible explanation for these differences is that thermodynamic factors such as the decrease in the enthalpy of transition and the loss of pre-transition, as well as the presence of surface charges, the presence of different substrates, and the orientation of hydrogen bonds with the water molecule on the surface of the proteoliposomes, may cause conformational changes in TNAP molecule. These relevant results can contribute for the understanding of the role of lipids and their interactions with proteins present in MVs in the biomineralization process.

A Na,K-ATPase é uma proteína encontrada na membrana plasmática de praticamente todas as células animais, que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar 3 íons Na+ e 2 íons K+. É composta por duas subunidades denominadas e . Um aspecto que ainda gera controvérsias se refere à sua forma de associação nativa e funcional como um protômero ou ainda na forma de oligômeros ()2 ou ()4. Uma forma de estudar essa enzima é pela sua solubilização da membrana, e posteriormente reconstituição em lipossomos de DPPC:DPPE. A caracterização cinética e estrutural desse sistema mostra que a enzima se apresenta na forma oligomérica ()2. O objetivo desse trabalho foi avaliar os mecanismos de dissociação e de desnaturação da Na,K-ATPase solubilizada bem como da reconstituída em lipossomos de DPPC:DPPE, por agentes físicos (temperatura) e químicos (relação proteína:detergente, uso de agentes caotrópicos como a guanidina e mudanças de pH), para interpretar as suas formas de associação e regulação. Para isso, foram realizados experimentos de dicroísmo circular (CD), calorimetria (DSC), infravermelho (FTIR), fluorescência de emissão do triptofano, tensão superficial, elasticidade, atividade catalítica (ATPase e pNPPase). Os estudos de CD em função da variação de temperatura mostraram que ocorre uma transição na curva de elipticidade (222 nm) a 43,7°C para a enzima solubilizada e a 42,0°C para a enzima reconstituída em lipossomos. Estas transições foram também encontradas pela técnica de FTIR. Os experimentos por DSC para a enzima solubilizada revelaram a presença de três picos em 54,7; 64,7 e 67,8°C. Já para a enzima reconstituída observam-se transições em menores temperaturas entre 30 a 40ºC (referentes aos lipídios) e ainda a preservação do pico de transição para proteína em 68,0°C. A análise de fluorescência de triptofano para ambas formas de enzima revelou deslocamentos de pico máximo de emissão a partir de 60°C. Já a presença de guanidina mostrou dois pontos de transição em 3 e 5 mol.L-1 para a Na,K-ATPase solubilizada. O efeito de diferentes meios tamponantes revelou que a enzima apresenta maiores conteúdos em -hélice em pH 7,5, concomitante com um aumento na intensidade de emissão de fluorescência do triptofano na faixa de pH de 5,0 a 8,5. Analisando conjuntamente todas as técnicas podemos propor um mecanismo de dissociação/desnaturação da enzima em função da temperatura. Primeiramente a enzima passa do seu estado oligomérico ()2 e forma protômeros . A atividade ATPase é perdida completamente (acima de 60ºC) quando as subunidades são completamente separadas, ocorrendo então uma agregação das subunidades , através dos domínios citoplasmáticos. Finalmente, a análise da enzima em diferentes proporções de proteína:detergente revela que a Na,K-ATPase, na presença de concentrações abaixo da CMC, se encontra na forma ()2 ou ainda ()4 (dependendo da concentração de proteína). Já para concentrações acima da CMC ocorre a separação das subunidades e consequente perda de atividade catalítica. Devido à dependência da atividade ATPase com seu estado conformacional e seu estado de oligomerização, este estudo realizado por técnicas bioquímicas e biofísicas, resulta em novas informações acerca da compreensão dos mecanismos que controlam o processo de associação, o qual é importante para a função da enzima na membrana natural. / Na,K-ATPase is a protein found in the plasmatic membrane of almost all animal cells and it uses the energy from ATP hydrolysis to transport 3 Na+ ions and 2 K+ ions. It is formed by subunits called and. One controversial aspect refers to its native and functional association form as a protomer or still in ()2 or ()4 oligomers form. One way to study this protein in our laboratory is by its solubilization from membrane, and later reconstitution in liposome from DPPC:DPPE. The kinetic and structural characterization fo this system shows that the enzyme presents itself in the oligomeric form ()2. The aim of this work was to evaluate the dissociation and denaturation mechanisms of the solubilized NA,K-ATPase as well as the one reconstituted in DPPC:DPPE liposome, by physic (temperature) and chemical agents (relation protein:detergent, use of chaotropic agents as Guanidine chloride, or still by the pH changes, to interpret its association and regulation forms. To that end, experiments of circular dichroism (CD), calorimetry (DSC), superficial tension, elasticity , catalytic activity (ATPase an pNPPase) were done. The CD studies in function of temperature variation have shown that a transition occurs in the ellipticity curve (222 nm) at 43.7ºC for the solubilized enzyme and at 42.0ºC for the enzyme reconstituted in liposome. These transitions were also found by the FTIR technique. The experiments by DSC for the solubilized enzyme have shown the presence of three peaks at 54.7ºC, 64.7ºC and 67.8ºC. As for the reconstituted enzyme, transitions in lower temperatures between 30ºC and 40ºC (concerning the lipids) and also the preservation of the transition peak for the protein at 68.0ºC were observed. The Tryptophane fluorescence analysis for both enzyme forms has revealed emission maximum peak shifts starting from 60ºC. The Guaniddine presence has shown two transition points at 3 and 5 mol.L-1 for the solubilized Na,K-ATPase. The effect of different buffer media has shown that the enzyme presents higher contents in -helix at pH 7.5, concomitant with an increase of the intensity of tryptophane fluorescence emission in the pH range of 5.0 to 8.5. Analyzing all the techniques together we can propose a dissociation/denaturation mechanism in function of the temperature. First, the enzyme goes from its oligomeric ()2 state and forms protomers. The ATPase activity é totally lost ( over 60ºC) when the subunits are completely separated, when an subunits aggregation then occurs, through the cytoplasmatic domains. Finally, the analysis of the enzyme in different proportions of protein:detergent reveals that the NA,K-ATPase, in the presence of concentrations bellow CMS, is in the ()2 or yet in the ()4 form (Depending on protein concentration). Now for concentrations above CMS, the separation of the subunits occurs and consequent catalytic activity loss. Due to the ATPase activity dependence on its conformational form and oligomerization state, this study done with biophysical and biochemistry techniques, results in new information on the comprehension of the mechanisms that control the association processes, which is important to the enzyme function in the natural membrane.