Pseudomonas aeruginosa (Pa) est un pathogène opportuniste et constitue un facteur de morbidité et de mortalité important chez les patients atteints de fibrose kystique II est responsable d'infections pulmonaires chroniques. Sa capacité à se maintenir chez l'hôte et à causer des infections résulte de l'expression de nombreux facteurs de virulence. Le traitement à l'aide d'antibiotiques fonctionne pour une durée limitée selon la capacité de Pa à développer de la résistance. Il est donc impératif de trouver d'autres alternatives afin de traiter les patients atteints de ce type d'infections chroniques. Les peptides antibactériens sont une des avenues envisagées puisque leurs cibles sont différentes et qu'ils n'engendrent pas de résistance. Par contre, les modes d'action des peptides antibactériens comme la pré-élafine sont encore mal connus. La pré-élafine est une protéine humaine sécrétée notamment par les cellules épithéliales. Elle possède des propriétés inhibitrices contre certaines peptidases à serine ainsi que des propriétés antimicrobiennes contre différentes souches de levures et de bactéries, incluant Pa. Nous avons étudié le mode d'action antibactérien de la pré-élafine contre Pa à l'aide de différentes approches. Nous avons d'abord observé que toutes les souches de Pa ne sont pas affectées de la même manière par la pré-élafine. La souche PA33348 est particulièrement sensible. Nous avons montré que cette hypersensibilité résulte de l'inhibition spécifique par le domaine élafine d'une peptidase sécrétée par cette souche, la peptidase IV, ce qui, affecte la croissance et/ou la viabilité en milieu complexe. Nous avons également montré que la pré-élafine et chacun de ses deux domaines se lie aux membranes. Le domaine N-terminal, ou cementoïne, qui est polycationique se lie plus particulièrement aux membranes chargées négativement. À l'aide de différentes techniques dont le dichroïsme circulaire et la résonance magnétique nucléaire, nous avons montré que ce domaine est peu structuré en solution aqueuse, mais adopte une conformation en hélices a dans un environnement hydrophobe. Cette caractéristique est commune à un grand nombre de peptides antimicrobiens, la plupart ayant la capacité de détruire l'intégrité des membranes microbiennes. Toutefois, et contrairement à ces peptides, les domaines cementoïne, élafine et la pré-élafine ne possèdent qu'une faible activité lytique. Par contre, nos résultats suggèrent que la pré-élafine aurait la capacité de traverser les membranes biologiques sans causer de lyse. Bien que d'autres expériences soient nécessaires pour confirmer cette hypothèse de la translocation au travers des membranes de la pré-élafine, nous avons montré que in vitro le domaine élafine et la pré-élafine, mais non la cementoïne, peuvent se lier à l'ADN. De plus nous avons noté une corrélation entre cette caractéristique et le fait que ces deux peptides permettent de diminuer l'expression de plusieurs facteurs de virulence de Pa. En résumé, nos travaux ont contribué à mieux comprendre les mécanismes d'action de la pré-élafine contre Pa. Cette protéine pourrait devenir une solution dans le traitement des patients atteints de fibrose kystique. Des études à l'aide de modèles animaux seraient le moyen idéal de confirmer notre travail et poursuivre la recherche sur le potentiel thérapeutique de la pré-élafine ou de ses domaines.

L’impact des infections bactériennes couplé à l’émergence des mécanismes de résistance aux antibiotiques suscite un besoin urgent de nouvelles classes d’agents antibactériens. D’ailleurs, la résistance du pathogène opportuniste P. aeruginosa diminue l’efficacité de traitement et met en danger la vie des personnes infectées. Dans le but d’identifier de nouveaux antimicrobiens, nous exploitons la machinerie de division cellulaire bactérienne en tant que cible. Ainsi, les protéines de division cellulaire FtsZ et FtsA de P. aeruginosa ont été utilisées afin d’identifier des inhibiteurs protéiques spécifiques à l’aide de la technique de présentation phagique. Nous avons identifié des peptides détenant une affinité pour les enzymes FtsZ et FtsA puis nous avons caractérisé 3 peptides inhibiteurs de l’activité GTPase de FtsZ. Le peptidomimétisme devrait permettre le développement d’une nouvelle classe d’agents antimicrobiens à partir de ces peptides. / The impact of bacterial infections and emergence of antibiotic resistance led to a serious need to develop new class of antibacterials. The acute resistance of the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa lowers the treatment efficiency of infected cystic fibrosis patients and immuno-compromised individuals. In the perspective of finding new antimicrobial agents, we are using the bacterial cell division machinery of as a new target. Thus, P. aeruginosa cell division proteins FtsZ and FtsA have been used to identify inhibitory peptides with the phage-display technique. We identified FtsZ and FtsA tight binding peptides and we characterized three inhibitory peptides of FtsZ GTPase activity. Peptidomimetism will allow the development of new antimicrobial agents with these leader peptides.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable des infections pulmonaires chroniques chez les patients atteints de fibrose kystique (FK). L’émergence de nouvelles souches épidémiques hypervirulentes, multi-résistantes aux antibiotiques et possédant une grande capacité de transmission, telles que LESB58, entraîne de grandes difficultés de traitement et une augmentation de la mortalité chez ces patients. Le séquençage complet de LESB58 a révélé un génome à 90% hautement conservé additionné de 455 gènes regroupés sous six prophages (PPs) et cinq îlots génomiques (GIs). Cette étude a pour objectif de déterminer l’implication de ces régions supplémentaires dans la pathogénie de LESB58. Une mutagenèse à étiquette signature (STM) suivie de plusieurs criblages ont permis de sélectionner 162 mutants dont 11 portant une insertion dans un GI ou PP. Des analyses subséquentes ont été réalisées sur ces mutants afin d’évaluer leur niveau de virulence in vivo dans un modèle d’infection pulmonaire chronique chez le rat. Des analyses de génomique ont été effectuées sur deux de ces mutants afin de mieux comprendre leur incapacité à établir l’infection dans le modèle d’infection in vivo. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen and causes chronic pulmonary infection to cystic fibrosis (CF) patients. The hypervirulent epidemic strain LESB58 is associated with high transmissibility and is highly resistant to antibiotics causing increased morbidity and mortality. Whole genome sequencing of LESB58 revealed a 90% highly conserved core genome and 455 additional genes grouped in five genomics islands (GIs) and six prophages (PPs). The aim of this study was to determine the implication of the accessory genome in LESB58 virulence. We performed a signature tagged mutagenesis (STM) followed by an in vivo screening of the mutants. From 162 STM mutants defective for in vivo maintenance, we selected 11 harbouring an insertion in GI or PP for further virulence analysis. Two of these mutants were used for genomics analysis in order to better understand their incapacity for in vivo maintenance in the rat model of chronic lung infection.

Chez les procaryotes, FtsZ est reconnu comme étant la protéine clé impliquée dans le contrôle de la septation lors de la division cellulaire. Le gène correspondant, ftsZ, semblait être hautement conservé dans l’évolution chez les bactéries à Gram positif et à Gram négatif. Afin d'amplifier une région génique homologue chez Pseudomonas aeruginosa, deux amorces dirigées contre une région conservée du gène ftsZ ont été conçues à partir de la table d’utilisation des codons riches en GC. Un amplicon de 220 pb a été généré, séquencé et utilisé comme sonde moléculaire afin de cribler une banque génomique de P. aeruginosa PAO dans le vecteur phagique λSE6. Le phage recombinant isolé et cartographié contenait un fragment d’ADN chromosomique de P. aeruginosa de 16.5 kb. L’analyse de la séquence partielle d’un fragment de 4,5 kb BamHl a révélé un arrangement génique ftsA-ftsZ-envA suggérant une organisation similaire à celle observée chez Escherichia coli. L’étude de l’expression protéique in vitro a démontré la présence d’une protéine de 40 kDa. L’alignement des séquences de 8 gènes ftsZ a démontré que ces protéines sont hautement conservées. Une analyse phylogénétique des gènes ftsZ séparant les espèces en deux groupes de bactéries à Gram positif et à Gram négatif semble en accord avec la phylogénie des ARNr de ces espèces. / Québec Université Laval, Bibliothèque 2018 / Ottawa Bibliothèque nationale du Canada, Direction des acquisitions et des services bibliographiques 19 . --

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste pouvant causer des infections pulmonaires chroniques chez les gens atteints de la Fibrose Kystique (FK). Pour réussir à s’implanter dans les voies respiratoires des patients FK, P. aeruginosa dispose d’un important arsenal de facteurs de virulence, dont la sécrétion de protéases, de lipases, de phospholipases ainsi que la production de toxines spécifiques. Le séquençage complet du chromosome de P. aeruginosa souche PAO1 (6.3 Mb) a révélé une organisation génomique hautement régulée. Dans le but de mieux comprendre l’interaction hôte-pathogène, nous avons utilisé la technique de mutagenèse à étiquette (STM). La STM a permis d’isoler 214 mutants incapables de maintenir l’infection pulmonaire chronique chez le rat. Parmi ceux-ci, le mutant STM2895, contenant un transposon dans le gène PA2895, a été retenu pour des analyses plus approfondies. L'étude phénotypique de STM2895 a permis de constater un défaut dans la production d’exoprotéases lorsque comparé à la souche sauvage PAO1. La caractérisation biochimique de ce défaut, utilisant des tests de dégradation spécifiques et l’immunobuvardage, a démontré qu’au moins deux des quatre protéases majeures sécrétées par P. aeruginosa sont impliquées. En effet, les élastases LasA et LasB ont été démontrées non fonctionnelles probablement dues à un problème de repliement. PA2895, une protéine possédant un domaine transmembranaire prédit, ne code pour aucune fonction connue, mais il est co-transcrit avec le gène PA2896, un facteur sigma putatif de type ECF (extracytoplasmic function). Des analyses en transcriptome sur le mutant STM2895, ainsi que sur un mutant de délétion de PA2896, ont permis de lier l’opéron au métabolisme du fer. De plus, des études in vivo dans le modèle d’infection pulmonaire chronique chez le rat ont clairement démontré que le mutant STM2895 est incapable de se maintenir dans l’hôte au même niveau que la souche sauvage PAO1. Le gène PA2895 est donc essentiel au maintien in vivo de P. aeruginosa dans le poumon de rat. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that can cause pulmonary infections in cystic fibrosis patients (CF). To overcome innate self defense, P. aeruginosa possesses a wide arsenal of virulence factors. These include degradation enzymes such as proteases, lipases and phospholipases and the production of three specific toxins: exotoxin A and exoenzymes S and T. Sequencing of the complete P. aeruginosa chromosome (strain PAO1) of 6.3 Mb revealed a highly regulated and complex genomic organization. In order to better understand host-pathogen molecular interactions, we developped a new signature-tagged mutagenesis (STM) approach based on PCR screening. The PCR-based STM technology lead to the identification of 214 mutants deficient in their ability to maintain a chronic pulmonary infection in the rat lung. In that pool of STM mutants, STM2895, which contains a transposon insertion in functional PA2895, was the most frequently drafted during the whole mutant library screening. Phenotypic analyses of the STM2895 strain allowed us to identify an exoprotease production defect as compared with wild type strain PAO1. The biochemical characterization of that proteolytic default using specific degradation assays combined with western blotting revealed that at least two (LasA and LasB) of the four major exoproteases from P. aeruginosa STM2895 strain are inactive. In fact, LasA and LasB elastases were shown to be present in the STM2895 culture supernatant, correctly processed but inactive due to a probable misfolding of proteins. The PA2895 gene (unknown function) encodes a protein with a predicted transmembrane domain. Basic genomic context analyses strongly suggest a cotranscription unit with the downstream gene PA2896, a putative sigma 70 factor from ECF (extracytoplasmic function) type. Microarray experiments on the STM2895 strain and an insertional mutant of the PA2896 gene were performed to establish a link between the putative PA2895-PA2896 operon and the metabolism of iron. Transcriptome analysis also demonstrated a repressive action of PA2895 on the transcription of PA2896 putative sigma factor. Finally, in vivo studies in the rat lung chronic infection model clearly showed a ten-fold decrease in survival capacity of the mutant strain when compared to the PAO1 wild-type strain.

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste, hautement résistant à une multitude d’antibiotiques qui infecte principalement les patients immunosupprimés. Il représente la cause principale de morbidité et de mortalité chez les patients atteints de fibrose kystique (mucoviscidose). Le but principal de ce projet consistait à identifier et à caractériser des gènes essentiels à l’infection et au maintien de P. aeruginosa dans un modèle animal d’infection pulmonaire chronique. À partir d’une banque de mutants transpositionnels, nous avons identifié 148 mutants de P. aeruginosa déficients à causer l’infection pulmonaire chronique chez le rat. Suite à des analyses bioinformatiques, le mutant inactivant le gène PA5437 a été sélectionné. L’opéron adjacent code pour les sous unités du pyruvate carboxylase (pycA et pycB) et est régulé par le gène PA5437, d’où l’appellation pycR pour pyruvate carboxylase regulator. Le pycR a été identifié comme étant un régulateur transcriptionnel de type LysR ayant une région typique de liaison à l’ADN. Le codon d’initiation de la transcription des gènes pycR et pycA a été identifié par élongation d’amorce. La capacité de liaison de la protéine PycR à l’ADN a été confirmée à l’aide du gel à retardement. L’implication de PycR dans la virulence bactérienne in vivo a été confirmée par indice de compétition et après 7 jours d’infection le mutant déficient ΔpycR est complètement éliminé du poumon du rat. L’importance de PycR a aussi été confirmée in vitro à l’aide des tests phénotypiques et enzymatiques démontrant la déficience dans la production de la lipase, de l’estérase et du biofilm. Finalement, l’analyse des résultats métaboliques et transcriptomiques a confirmé l’importance de PycR dans la régulation du métabolisme de lipides, de l’activité lipolytique, de la respiration anaérobique, de la formation du biofilm et des gènes régulés par le quorum sensing. Dans un second volet, une étude comparative entre souches prototypes (PAO1 et PA14) de P. aeruginosa et un isolat clinique (LESB58) de la fibrose kystique a été réalisée dans un modèle de l’infection pulmonaire chronique chez le rat. Cette étude a permis d’identifier des différences significatives au niveau de la localisation bactérienne dans les tissus pulmonaires de l’isolat clinique LESB58. D’importantes différences ont également été notées au niveau des facteurs de virulence comme la mobilité et la formation du biofilm. À long terme, les nouvelles connaissances acquises en génomique fonctionnelle devraient permettre d’identifier et de développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant de combattre et mieux comprendre les infections causées par cette bactérie. / The opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa is highly resistant to most classes of antibiotics and causes a wide variety of infections in compromised hosts. In addition, it represents the major cause of morbidity and mortality in cystic fibrosis (CF) patients. The principal goal of the present research project was to identify and to characterise P. aeruginosa genes essential for causing a chronic lung infection. Using a PCR-based signature-tagged mutagenesis, we identified a P. aeruginosa STM5437 mutant having an insertion into the PA5437 gene; its inactivation causes attenuation of virulence in vivo. The PA5437 gene, now called pycR, regulates the adjacent operon encoding the pyruvate carboxylase subunits (pyruvate carboxylase regulator). PycR has the signature of a putative transcriptional regulator with a predicted helix-turn-helix motif binding to a typical LysR DNA-binding motif identified in the PA5436 (pycA)-PA5437 (pycA) intercistronic region. Transcriptional start sites of pycA and pycR were identified by primer extension and the DNA binding capacity of PycR was confirmed by a DNA mobility gel shift assay. Genome-wide transcriptional profiling indicated that the genes whose control were differentially expressed by PycR implicated genes responsible for lipid metabolism, lipolytic activity, anaerobic respiration, biofilm formation and a number of quorum sensing regulated genes. This study defines PycR as a major regulator in virulence and where mutations in pycR have pleiotropic effects on the expression of multiple virulence factors such as lipase, esterase and biofilm formation. The expressions of several of these genes are associated with chronic lung persistence. In the second part of the study, P. aeruginosa prototype strains PAO1 and PA14 were compared with the CF isolate LESB58 in the rat model of chronic lung infection. This comparative study identified major differences for LESB58; in vivo in bacterial localisation in the rat lung and in vitro for motility and biofilm production. Functional genomics of P. aeruginosa will provide new insights for the development of novel therapeutic targets. Genomic biodiversity may explain the variation in severity of the P. aeruginosa infections in CF disease.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 61-69. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1998. / Bibliogr.: f. 72-84. Publié aussi en version électronique.

Thèse (Ph. D.) -- Université Laval, 1997. / Bibliogr.: f. 121-136. Publié aussi en version électronique.

Les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRS) jouent un rôle essentiel dans la synthèse des protéines. Ces enzymes lient un acide aminé particulier sur un ARNt correspondant. Cependant, il y a deux types d'aaRS : des aaRS discriminantes (aaRS-D) et des aaRS non discriminantes (aaRS-ND). Chez certaines bactéries, une aaRS-ND charge deux types d'ARNts. L'AspRS-ND et l'AdT de P. aeruginosa ont été surproduites et purifiées. L'AspRS-ND a servi pour la synthèse d'Asp-ARNtAsn , un des substrats de l'AdT; une valeur de 0.93 fiM a été obtenue pour la Km de l'AdT pour ce substrat et une kcat de 0.8 s"1 . Ensuite, nous avons montré que l'aspartycine et la glutamycine, deux analogues des substrats Asp-ARNt^11 et Glu-ARNtGln , sont des inhibiteurs compétitifs de l'AdT par rapport à l'Asp-ARNr^11 avec des Zic de 125 et 50 pM., respectivement. Enfin, une sulfone analogue d'un intermédiaire de la réaction de transamidation est un inhibiteur compétitif de l'AdT avec une KK de 65 uM.