Pseudozyma flocculosa is a biological control agent related to anamorphs of the Ustilaginales. Its mode of action against powdery mildew fimgi is antibiosis, and the metabolite flocculosin is believed to be a key factor in its biocontrol properties. In order to identify genes involved in the control of these properties, random insertional mutagenesis had previously been attempted, but a genetic transformation method yielding single genomic insertions was required. To this end, genetic transformation by Agrobacterium tumefaciens was optimized in the related species P. antarctica, in the hope of eventually adapting this method to P. flocculosa. However, the type of genomic insertions obtained in P. antarctica differed from expectations, and thus the emphasis was rather placed on identification of specific genes. To this end, we searched for homologs of genes identified in Ustilago maydis as involved in the biosynthesis of ustilagic acid, a molecule of very similar chemical structure to flocculosin. Homologs of U. maydis cypl, catalyzing the terminal hydroxylation of palmitic acid prior to its incorporation to the cellobiose via a Oglycosidic bond, were isolated and sequenced in P. flocculosa and P. fusiformata. Furthermore, a homolog of U. maydis uatl, involved in acetylation of ustilagic acid, was partially sequenced from P. flocculosa. Ail three newly sequenced genes showed strong séquence similarity to their counterparts in U. maydis. Cypl expression followed a similar pattern of down-regulation when P. flocculosa was actively growing in vitro and in vivo, thereby suggesting that the molecule was preferentially synthesized early in the process of searching for a growth substrate. Also, an attempt was made to generate a P. flocculosa knockout mutant of cypl, although no transformant obtained showed disruption of the cypl genomic locus. This study provides the first évidence of genes potentially involved in the production of flocculosin, a molecule associated with the biocontrol properties of P. flocculosa. / Pseudozyma flocculosa est un agent de lutte biologique contre le blanc des cultures apparenté aux anamorphes des Ustilaginales. Son mode d'action contre le blanc est l'antibiose, et la flocculosine serait la molécule antifongique lui conférant cette action. Dans le but d'identifier des gènes impliqués dans le contrôle de l'antibiose, des essais de mutagenèse insertionnelle aléatoire avaient déjà été entrepris. Afin de faciliter ces travaux, une méthodologie de transformation génétique générant des insertions uniques devait être mise au point. Dans ce but, la transformation génétique par Agrobacterium iumefaciens a été appliquée chez l'espèce voisine P. antarcîica dans le but éventuel de pouvoir l'adapter à P. flocculosa. Toutefois, le type d'insertions obtenues dans le génome ne correspondait pas aux attentes chez P. antarcîica. L'approche a ainsi été redirigée vers l'identification de gènes spécifiques, dont les homologues caractérisés chez Ustilago maydis sont impliqués dans la synthèse de l'acide ustilagique, une molécule dont la structure chimique est très similaire à celle de la flocculosine. Des homologues du gène cypl d'U. maydis, dont le produit serait impliqué dans l'hydroxylation terminale de l'acide palmitique avant son incorporation au cellobioside via un lien O-glycoside, ont été isolés et séquences chez P. flocculosa et P. fusiformata. De plus, un homologue du gène uatl d'U. maydis, dont le produit serait impliqué dans l'acétylation de la molécule, a été partiellement séquence chez P. flocculosa. L'expression de cypl a montré un patron de sous-expression similaire lorsque P. flocculosa était en croissance active in vitro et in vivo, suggérant donc que la flocculosine est synthétisée principalement au début du processus de recherche d'un nouveau substrat de croissance. Par ailleurs, un essai de génération d'un mutant de P. flocculosa contenant une délétion du gène cypl a été effectué, mais le locus génomique cypl était intact chez tous les transformants obtenus. Cette étude représente la première découverte de gènes dont les produits sont potentiellement impliqués dans la production de la flocculosine, une molécule associée au potentiel de lutte biologique de P. flocculosa.

Nesse trabalho foram produzidas lipases da levedura Pseudozyma hubeiensis (HB85A) em reator de 14 L. Após produção da enzima, a lipase foi imobilizada por adsorção em suporte hidrofóbico por processo contínuo em reator de leito fixo. As melhores condições de imobilização foram: tempo de imobilização de 2 h e 29 min., pH de 4,76 e quantidade de enzima livre adicionada por grama de suporte de 1282 U/ g de suporte, sendo que, a máxima atividade da lipase imobilizada obtida foi de 143 U/g de suporte. O sobrenadante contendo lipase e o biocatalisador heterogênio foram caracterizados por planejamento fatorial. A máxima atividade da enzima imobilizada (71 U/g de suporte) foi obtida em pH 6,0 à temperatura de 52 °C. A imobilização da lipase resultou em um aumento na estabilidade dessa enzima em temperaturas altas, pH ácidos e neutros, presença de detergentes não-iônicos e altas concentrações de solventes orgânicos como iso-propanol, metanol e acetona. Foi possível a reutilização da lipase imobilizada por apenas uma vez na reação de hidrólise, havendo uma perda de 72 % da atividade após o primeiro reuso. Analisou-se ainda a estabilidade da lipase livre e imobilizada durante 40 dias de armazenamento a 4 °C. Durante o período de armazenamento, a lipase imobilizada manteve 50 % de sua atividade original e a lipase livre apresentou 80 %. O catalisador heterogêneo foi testado quanto a sua eficácia na produção de biodiesel. A reação de transesterificação foi realizada na ausência de co-solvente utilizando-se como matérias-primas metanol, etanol e iso-propanol e quatro fontes diferentes de triglicerídeo (óleo de soja, óleo de mamona, óleo residual de restaurante e a gordura bovina). A partir dos testes realizados, obteve-se um rendimento máximo quanto à produção de biodiesel de 3,15 % utilizando-se óleo de mamona e iso-propanol como matéria-prima pelo período de 24 h. A produção de biodiesel utilizando diferentes quantidades de lipase imobilizada e também a lipase livre como catalisador foi testada na presença de hexano, iso-propanol e óleo de mamona pelo período de 24 h nas temperaturas de 40, 50 e 60 °C. No entanto, não houve produção de biodiesel nas condições analisadas. / In this work, lipases from yeast Pseudozyma hubeiensis (strain HB85A) were produced in a 14 L reactor. After lipase from yeast P. hubeiensis (strain HB85A) production, the enzyme was immobilized by adsorption in polyestyrene divinylbenzene hydrophobic support in a packet bed column. The best conditions for lipase immobilization were: 2 h and 29 min. immobilizing time, pH 4.76 and rate of free enzyme added per gram of support equal to 1282 U/g. The maximum activity of immobilized lipase was reached of 143 U/g. The lipases of P. hubeiensis (HB85A) supernatant culture and the heterogeneous catalyst were characterized through response surface methodology by factorial design. The maximum activity of immobilized lipase was reached for a support rate of 71 U/g, with pH 6.0 and temperature of 52 °C. It was detected that lipase immobilization increased enzyme stability under high temperatures, neutral and acid pH levels, non-ionic detergent and high concentration of organic solvent like iso-propanol, methanol and acetone. The reuse of immobilized lipase was possible only once for hydrolysis reaction, with activity losses of 72 % after first re-use. Also, it was tested lipase stability in a period of 40 days, under 4 °C storage conditions. During storage period, immobilized lipase kept 50 % of its original activity. Free lipase kept 80 %. After the development of heterogeneous catalyst, its efficiency as catalyst for biodiesel production was analyzed in this study. The transesterification reaction was tested in co-solvent absence using as raw material three differents sources of alcohols (methanol, ethanol and iso-propanol) and four differents triglicerides source (soybean oil, castor oil, waste cooking oil and bovine fat) and as catalystis the immobilized lipase. Based in test results, the maximum biodiesel production yield was 3.15 % using castor oil and methanol as raw material for 24 h. The biodiesel production was also tested with different amount of immobilized lipase and with free lipase as catalystis at the presence of methanol, castor oil and the co-solvent hexane for 24 h at 40, 50 e 60 °C. However there was no biodiesel production at the tested conditions.

Nesse trabalho foram produzidas lipases da levedura Pseudozyma hubeiensis (HB85A) em reator de 14 L. Após produção da enzima, a lipase foi imobilizada por adsorção em suporte hidrofóbico por processo contínuo em reator de leito fixo. As melhores condições de imobilização foram: tempo de imobilização de 2 h e 29 min., pH de 4,76 e quantidade de enzima livre adicionada por grama de suporte de 1282 U/ g de suporte, sendo que, a máxima atividade da lipase imobilizada obtida foi de 143 U/g de suporte. O sobrenadante contendo lipase e o biocatalisador heterogênio foram caracterizados por planejamento fatorial. A máxima atividade da enzima imobilizada (71 U/g de suporte) foi obtida em pH 6,0 à temperatura de 52 °C. A imobilização da lipase resultou em um aumento na estabilidade dessa enzima em temperaturas altas, pH ácidos e neutros, presença de detergentes não-iônicos e altas concentrações de solventes orgânicos como iso-propanol, metanol e acetona. Foi possível a reutilização da lipase imobilizada por apenas uma vez na reação de hidrólise, havendo uma perda de 72 % da atividade após o primeiro reuso. Analisou-se ainda a estabilidade da lipase livre e imobilizada durante 40 dias de armazenamento a 4 °C. Durante o período de armazenamento, a lipase imobilizada manteve 50 % de sua atividade original e a lipase livre apresentou 80 %. O catalisador heterogêneo foi testado quanto a sua eficácia na produção de biodiesel. A reação de transesterificação foi realizada na ausência de co-solvente utilizando-se como matérias-primas metanol, etanol e iso-propanol e quatro fontes diferentes de triglicerídeo (óleo de soja, óleo de mamona, óleo residual de restaurante e a gordura bovina). A partir dos testes realizados, obteve-se um rendimento máximo quanto à produção de biodiesel de 3,15 % utilizando-se óleo de mamona e iso-propanol como matéria-prima pelo período de 24 h. A produção de biodiesel utilizando diferentes quantidades de lipase imobilizada e também a lipase livre como catalisador foi testada na presença de hexano, iso-propanol e óleo de mamona pelo período de 24 h nas temperaturas de 40, 50 e 60 °C. No entanto, não houve produção de biodiesel nas condições analisadas. / In this work, lipases from yeast Pseudozyma hubeiensis (strain HB85A) were produced in a 14 L reactor. After lipase from yeast P. hubeiensis (strain HB85A) production, the enzyme was immobilized by adsorption in polyestyrene divinylbenzene hydrophobic support in a packet bed column. The best conditions for lipase immobilization were: 2 h and 29 min. immobilizing time, pH 4.76 and rate of free enzyme added per gram of support equal to 1282 U/g. The maximum activity of immobilized lipase was reached of 143 U/g. The lipases of P. hubeiensis (HB85A) supernatant culture and the heterogeneous catalyst were characterized through response surface methodology by factorial design. The maximum activity of immobilized lipase was reached for a support rate of 71 U/g, with pH 6.0 and temperature of 52 °C. It was detected that lipase immobilization increased enzyme stability under high temperatures, neutral and acid pH levels, non-ionic detergent and high concentration of organic solvent like iso-propanol, methanol and acetone. The reuse of immobilized lipase was possible only once for hydrolysis reaction, with activity losses of 72 % after first re-use. Also, it was tested lipase stability in a period of 40 days, under 4 °C storage conditions. During storage period, immobilized lipase kept 50 % of its original activity. Free lipase kept 80 %. After the development of heterogeneous catalyst, its efficiency as catalyst for biodiesel production was analyzed in this study. The transesterification reaction was tested in co-solvent absence using as raw material three differents sources of alcohols (methanol, ethanol and iso-propanol) and four differents triglicerides source (soybean oil, castor oil, waste cooking oil and bovine fat) and as catalystis the immobilized lipase. Based in test results, the maximum biodiesel production yield was 3.15 % using castor oil and methanol as raw material for 24 h. The biodiesel production was also tested with different amount of immobilized lipase and with free lipase as catalystis at the presence of methanol, castor oil and the co-solvent hexane for 24 h at 40, 50 e 60 °C. However there was no biodiesel production at the tested conditions.

Nesse trabalho foram produzidas lipases da levedura Pseudozyma hubeiensis (HB85A) em reator de 14 L. Após produção da enzima, a lipase foi imobilizada por adsorção em suporte hidrofóbico por processo contínuo em reator de leito fixo. As melhores condições de imobilização foram: tempo de imobilização de 2 h e 29 min., pH de 4,76 e quantidade de enzima livre adicionada por grama de suporte de 1282 U/ g de suporte, sendo que, a máxima atividade da lipase imobilizada obtida foi de 143 U/g de suporte. O sobrenadante contendo lipase e o biocatalisador heterogênio foram caracterizados por planejamento fatorial. A máxima atividade da enzima imobilizada (71 U/g de suporte) foi obtida em pH 6,0 à temperatura de 52 °C. A imobilização da lipase resultou em um aumento na estabilidade dessa enzima em temperaturas altas, pH ácidos e neutros, presença de detergentes não-iônicos e altas concentrações de solventes orgânicos como iso-propanol, metanol e acetona. Foi possível a reutilização da lipase imobilizada por apenas uma vez na reação de hidrólise, havendo uma perda de 72 % da atividade após o primeiro reuso. Analisou-se ainda a estabilidade da lipase livre e imobilizada durante 40 dias de armazenamento a 4 °C. Durante o período de armazenamento, a lipase imobilizada manteve 50 % de sua atividade original e a lipase livre apresentou 80 %. O catalisador heterogêneo foi testado quanto a sua eficácia na produção de biodiesel. A reação de transesterificação foi realizada na ausência de co-solvente utilizando-se como matérias-primas metanol, etanol e iso-propanol e quatro fontes diferentes de triglicerídeo (óleo de soja, óleo de mamona, óleo residual de restaurante e a gordura bovina). A partir dos testes realizados, obteve-se um rendimento máximo quanto à produção de biodiesel de 3,15 % utilizando-se óleo de mamona e iso-propanol como matéria-prima pelo período de 24 h. A produção de biodiesel utilizando diferentes quantidades de lipase imobilizada e também a lipase livre como catalisador foi testada na presença de hexano, iso-propanol e óleo de mamona pelo período de 24 h nas temperaturas de 40, 50 e 60 °C. No entanto, não houve produção de biodiesel nas condições analisadas. / In this work, lipases from yeast Pseudozyma hubeiensis (strain HB85A) were produced in a 14 L reactor. After lipase from yeast P. hubeiensis (strain HB85A) production, the enzyme was immobilized by adsorption in polyestyrene divinylbenzene hydrophobic support in a packet bed column. The best conditions for lipase immobilization were: 2 h and 29 min. immobilizing time, pH 4.76 and rate of free enzyme added per gram of support equal to 1282 U/g. The maximum activity of immobilized lipase was reached of 143 U/g. The lipases of P. hubeiensis (HB85A) supernatant culture and the heterogeneous catalyst were characterized through response surface methodology by factorial design. The maximum activity of immobilized lipase was reached for a support rate of 71 U/g, with pH 6.0 and temperature of 52 °C. It was detected that lipase immobilization increased enzyme stability under high temperatures, neutral and acid pH levels, non-ionic detergent and high concentration of organic solvent like iso-propanol, methanol and acetone. The reuse of immobilized lipase was possible only once for hydrolysis reaction, with activity losses of 72 % after first re-use. Also, it was tested lipase stability in a period of 40 days, under 4 °C storage conditions. During storage period, immobilized lipase kept 50 % of its original activity. Free lipase kept 80 %. After the development of heterogeneous catalyst, its efficiency as catalyst for biodiesel production was analyzed in this study. The transesterification reaction was tested in co-solvent absence using as raw material three differents sources of alcohols (methanol, ethanol and iso-propanol) and four differents triglicerides source (soybean oil, castor oil, waste cooking oil and bovine fat) and as catalystis the immobilized lipase. Based in test results, the maximum biodiesel production yield was 3.15 % using castor oil and methanol as raw material for 24 h. The biodiesel production was also tested with different amount of immobilized lipase and with free lipase as catalystis at the presence of methanol, castor oil and the co-solvent hexane for 24 h at 40, 50 e 60 °C. However there was no biodiesel production at the tested conditions.

Afin d'améliorer nos pratiques agricoles dans le contexte d'une agriculture durable, plusieurs agents de lutte biologique (ALB) ont été développés, testés et sont maintenant utilisés dans le monde pour combattre les pertes de rendements causées par les maladies. Blumeria graminis f. sp. hordei ( Bgh) est l'agent pathogène responsable du blanc de l'orge et peut réduire les rendements de cette culture jusqu'à 40%. Un champignon épiphyte, Pseudozyma flocculosa, a été découvert et identifié en 1987 en association étroite avec le blanc du trèfle. Les chercheurs ont alors remarqué que ce champignon exhibait une forte activité antagoniste contre le blanc en détruisant les structures de l'agent pathogène. Suite à d'autres travaux, il est apparu que ce comportement antagoniste était dirigé contre tous les membres des Erysiphales et semblait lié à la synthèse d'un glycolipide antifongique soit la flocculosine. Toutefois, on n'est toujours pas parvenus à associer l'efficacité de l'ALB avec la production de ce glycolipide. Ces observations suggèrent que d'autres facteurs seraient impliqués lorsque les deux protagonistes, l'ALB et le blanc, sont en contact. L'objectif principal de ce projet était donc de chercher d'autres mécanismes moléculaires pouvant expliquer l'interaction P. flocculosa-blanc et orge, en faisant une analyse transcriptomique complète des trois protagonistes en même temps. L'interaction tripartite a été échantillonnée à différents temps suivant l'inoculation de P. flocculosa sur des feuilles d'orge présentant déjà une intensité de blanc d'environ 50%. Les échantillons de feuilles prélevés ont ensuite été utilisés pour l'extraction de l'ARN qui ont été ensuite transformés en ADNc pour la préparation des librairies. Cinq répliquats ont été effectués pour chaque temps et le tout a été séquencé à l'aide de séquençage par synthèse Illumina HiSeq. Les séquences obtenues (reads) ont ensuite été analysées à l'aide du logiciel CLC Genomics Workbench. Brièvement, les séquences obtenues ont été cartographiées sur les trois génomes de référence. Suite à la cartographie, les analyses d'expression ont été conduites et les gènes exprimés de façon différentielle ont été recherchés. Cette étape a été conduite en portant une attention particulière aux gènes codant pour un groupe de protéines appelées CSEP pour “candidate secreted effector proteins” qui seraient possiblement impliquées dans l'interaction tripartite. Parmi les protéines exprimées de façon différentielle en présence du blanc ou en absence de ce dernier, nous avons pu constater que certaines CSEP étaient fortement exprimées en présence du blanc. Ces résultats sont prometteurs et nous offrent une piste certaine pour l'élucidation des mécanismes impliqués dans cette interaction tripartite.