Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Titre de l'écran-titre (visionné le 5 mai 2008). Bibliogr.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2008-2009 / Dans cette étude, nous avons comparé le potentiel de lutte biologique et le développement de quatre espèces du genre Pseudozyma {P. antárctica, P. flocculosa, P. fusiformata et P. rugulosa), reconnues pour leur production de glycolipides aux propriétés antifongiques in vitro. Pour ce faire, nous avons d'abord généré des transformants GFP et conçu des amorces spécifiques pour chacune des espèces testées. Par la suite, nous avons pu observer ces espèces en conditions naturelles et quantifier leurs populations en temps réel, sur des feuilles saines et infectées par le blanc. Bien que Pseudozyma spp. présentent plusieurs caractéristiques similaires, seulement P. flocculosa a été en mesure de contrôler efficacement le blanc et de croître en sa présence, comme en témoigne l'augmentation constante de sa population, tel qu'observée en qRT-PCR. De tels résultats suggèrent ainsi que la production de glycolipides n'est pas le seul facteur définissant l'activité antagoniste de Pseudozyma spp. en conditions naturelles. De plus, ces résultats soulignent également la nécessité d'avoir recours à des tests in situ pour une juste évaluation du potentiel de lutte biologique d'un champignon ainsi qu'une compréhension exhaustive de son écologie, et ce toujours dans le but d'optimiser l'efficacité d'un agent de lutte biologique potentiel

La transformation génétique est un outil grandement utilisé pour étudier les comportements biologiques de certains organismes ou encore, pour leur donner des caractères désirés. C'est dans ces optiques qu'une technique de transformation chimique sur des protoplastes de Pseudozyma spp. a été développée; toutefois certaines limitations nous ont poussés à développer une alternative comme celle discutée ici, l'électroporation. Il s'est avéré que P. antarctica peut être transformé par électroporation sous les conditions de 1400 volts et 400Q tout en donnant de bons rendements. Le type d'insertion de l'ADN plasmidique a été évalué sur les transformants et il semble que le plasmide s'insère préférablement en tandem à un ou quelques sites dans l'ADN génomique du champignon. En ce qui a trait à P. flocculosa, en dépit d'essais variés et répétés, l'électroporation ne semble pas fournir les conditions nécessaires pour mener à sa transformation.

Le champignon Pseudozyma flocculosa a été particulièrement étudié pour son activité biologique contre le blanc (Érysiphales). Par génie génétique, un glycolipide à activité antifongique, la flocculosine, a été isolé et caractérisé. Bien que le spectre d'activité de cette molécule ait été identifié, les conditions in vitro et in vivo dans lesquelles ce composé est synthétisé ne sont pas encore élucidées. La première partie de ce travail consistait à déterminer les besoins nutritionnels de P. flocculosa ainsi que les paramètres jouant un rôle primordial dans la synthèse de la flocculosine. Suite à cette étude, nous avons pu atteindre une productivité de 15 g/1 de flocculosine et définir certains éléments influençant la synthèse de la molécule. En bref, la disponibilité d'une source de carbone et l'ajout de l'extrait de levure sont apparus comme les deux principaux facteurs ayant un impact majeur sur la synthèse du glycolipide. Dans la deuxième partie de ce projet, nous nous sommes intéressés à l'investigation des changements métaboliques corrélés à la synthèse de la flocculosine. Pour ce faire, nous avons effectué une étude protéomique dans deux conditions de production différentes (inductrice et répressive). La comparaison des deux profils protéomiques a montré une diminution drastique du nombre total des protéines suggérant que le champignon produit cette molécule pour contourner le déséquilibre métabolique provoqué par la condition de stress. Enfin, nous avons tenté de déterminer le rôle exact de la flocculosine dans le cadre de la relation tritrophique plante-agent pathogène-P. flocculosa. Nous avons suivi en particulier l'expression du gène cypl, impliqué dans la synthèse de cette molécule, lorsque P. flocculosa était soumis à différentes conditions environnementales. Cette étude nous a permis de conclure que P. flocculosa synthétisait la flocculosine in vivo en réponse aux disponibilités variables des substrats à la surface de la feuille.

Le champignon Pseudozyma flocculosa a été particulièrement étudié pour son activité de lutte biologique contre le blanc. Par génie génétique, une molécule à activité antifongique, la flocculosine, a été isolée et caractérisée. Suite à ces travaux, l'utilisation des champignons du genre Pseudozyma pour la production de protéines recombinantes a présenté un nouvel axe de recherche. Toutefois, la variété des outils moléculaires disponibles pour l'étude des Pseudozyma spp. est limitée aux séquences régulatrices (promoteur, terminateur) du gène HSP70 d'un champignon voisin, Ustilago maydis. Les objectifs de notre recherche étaient donc les suivants : 1) obtenir des séquences promotrices de P. flocculosa; 2) comparer l'activité de ces séquences promotrices avec le promoteur HSP70; et 3) démontrer l'utilité de ces outils moléculaires dans le contexte d'une nouvelle approche d'étude de l'écologie de P. flocculosa. Dans un premier temps, un promoteur spécifique a été ciblé, soit le promoteur du gène d'actine car celui-ci est reconnu comme étant fort et constitutif chez d'autres champignons. En parallèle, un promoteur dont les transcrits étaient parmi les plus abondants dans des conditions de cultures déterminées a été identifié et cloné. Le gène codant pour la glycéraldéhyde 3-phosphate-déshydrogénase (GPD), une enzyme importante du métabolisme carboné de la cellule, a donc pu être cloné et séquencé. Nous avons ainsi obtenu 1133 pb de la séquence promotrice du gène d'actine et 1139 pb du gène GPD de P. flocculosa. Dans un deuxième temps, la comparaison de la force de ces deux promoteurs avec celle du promoteur HSP70 a permis d'établir que les promoteurs d'actine et de GPD présentaient une activité forte chez P. flocculosa et comparable à celle de HSP70 chez P. antarctica. Enfin, le développement d'une souche de P. flocculosa (Act4) exprimant de façon constitutive la GFP a permis son observation in situ pendant l'interaction tritrophique plante-agent pathogène-agent de lutte biologique. Il a ainsi été possible de montrer que P. flocculosa ne présentait pas de croissance remarquable en absence du blanc sur la feuille et ce, quelle que soit la plante-hôte utilisée. Néanmoins, en présence des structures du champignon pathogène, le développement de la souche Act4 était clairement stimulé.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Ce projet de recherche avait pour but d'identifier les facteurs favorisant l'activité de Pseudozyma flocculosa, un agent de lutte biologique contre le blanc des cultures agricoles. Pour réaliser cette identification, nous avons d'abord analysé le développement de P. flocculosa en présence d'extrait de levure (YNB), reconnu pour reproduire le comportement de P. flocculosa en conditions naturelles d'antagonisme du blanc. Les objectifs de l'étude étaient: 1) évaluer l'activité des différentes fractions de l'extrait de levure sur la croissance et la morphologie de P. flocculosa; 2) caractériser la nature de la (des) molécule(s) dans la fraction active et 3) déterminer la relation entre la (les) molécule(s) provenant de l'extrait de levure et celle(s) exsudée(s) par le blanc au contact de P. flocculosa. Les expériences ont démontré que le zinc et le manganèse étaient responsables de la stimulation du métabolisme de croissance et production de conidies de P. flocculosa. Ces deux oligoéléments permettent d'obtenir les mêmes effets que ceux obtenus avec l'extrait de levure. Pour valider ces résultats in vivo, une solution de zinc et manganèse a été vaporisée sur des feuilles de tomates saines sur lesquelles P. flocculosa a ensuite été appliqué. Les observations en microscopie électronique à balayage ont confirmé que P. flocculosa se développait de façon abondante sur la feuille en association avec la solution de zinc et manganèse, résultat qui laisse supposer que le champignon extrait ces minéraux essentiels à sa croissance à partir des colonies de blanc et exerce ainsi son effet délétère sur cet agent pathogène. Le zinc et le manganèse jouent donc un rôle clé dans la transition morphologique de P. flocculosa, lui conférant son activité de lutte biologique et sa spécificité à l'égard des colonies des Érysiphales.

La lutte aux maladies des cultures est une bataille de tous les instants. Au cours du XXe siècle, l’essor de l’industrie chimique a mené à la création de nombreux produits phytosanitaires d’une grande efficacité qui a permis d’accroître de manière substantielle la productivité des cultures. Aujourd’hui, l’utilisation intensive de certains de ces produits est reconnue comme entrainant de fâcheuses conséquences sur la santé humaine ou celle des écosystèmes. À la suite de cette prise de conscience, plusieurs initiatives visant à réduire la dépendance des systèmes agricoles aux pesticides les plus nocifs ont vu le jour. Une des approches préconisées, celle de la lutte biologique, consiste à tirer profit de l’antagonisme naturel qui caractérise la relation qu’entretiennent certains organismes entre eux. La découverte de l’agent de lutte biologique (ALB) Pseudozyma flocculosa et les efforts de recherche qui en ont découlé s’inscrivent directement dans cette mouvance. Depuis 1987, les découvertes concernant ce champignon n’ont cessé d’étonner et d’entretenir de grands espoirs quant à l’élaboration d’un biofongicide efficace et écologique pour la lutte contre la maladie du blanc (oïdium) qui affecte plusieurs espèces végétales. La présente thèse constitue la somme des découvertes les plus récentes concernant P. flocculosa. En effet, l’avènement des technologies de séquençage a créé de nouvelles opportunités de recherche qui ont mené à de nombreuses découvertes d’une importance capitale. D’une part, il a été possible de caractériser avec précision la batterie de gènes associée à la synthèse de la flocculosine. Pour ce faire, l’utilisation d’un système d’expression hétérologue basé sur la transformation génétique de l’espèce Ustilago maydis a été nécessaire pour déterminer la fonction de certains gènes. D’autre part, une analyse comparative en profondeur du génome de l’ALB et de ceux d’Ustilaginales apparentées a permis de mieux comprendre l’évolution de l’organisme tout en générant un ensemble d’informations de haute qualité et de grande valeur. Le développement de nouvelles approches basées sur la biologie d’organismes bénéfiques demande beaucoup d’efforts. Cependant, les retombées potentielles associées à la réduction de l’utilisation de produits nocifs pour l’environnement et la santé humaine dépassent bien souvent les investissements qui y sont consacrés. / Controlling pests is an important part of crop cultivation. The rise of the chemical industry during the XXth century led to the design of efficient molecules for the control of plant diseases that prompted a substantial increase in crop productivity. However, the intensive use of pesticides in agricultural systems quickly raised doubts about sustainablility. In response to those concerns, many initiatives were put in place to reduce the reliance of farmers on synthetic pesticides. Biological control, one of these initiatives, is about favoring the growth and the dispersal of natural antagonists in agricultural systems to fight plant diseases as ecological alternatives to pesticides. The discovery and characterization of the biocontrol agent Pseudozyma flocculosa was part of this trend. Since 1987, the discoveries regarding the biology of the fungus never ceased to amaze, maintaining hopes for the development of an efficicent biofongicide to control powdery mildews in many crops. This thesis presents the most recent work that was accomplished to reveal the most interesting properties associated with the biology of the biocontrol agent. Much of this work was made possible, or at least facilitated, by the access to emerging and powerful DNA sequencing and bioinformatics tools that created opportunities to answer pending questions in new ways. First, we characterized with precision the function and structure of the flocculosin gene cluster. Using the genomic sequences of P. flocculosa, we localized a putative gene cluster for flocculosin and caraterized the function of the most ambiguous genes using Ustilago maydis as a heterologous expression system. Second, we conducted an in-depth comparative analysis of P. flocculosa genome with those of other Ustilaginales species. This work shed a new light on the evolution of the species and that generated a data set of high quality that will be available for future projects. The development of novel alternatives to pesticides based on the biology of beneficial organisms requires time and effort. However, the beneficial impact associated with a reduction in pesticide use often exceeds the investments that lead to such a positive outcome.

La flocculosine est un glycolipide de 854 Da qui a été reconnu responsable de l'activité antagoniste de Pseudozyma flocculosa, un agent de lutte biologique contre le blanc et principe actif du biofongicide Sporodex®. Il a été démontré récemment que cette molécule avait une activité délétère contre plusieurs microorganismes. Or, selon le dernier rapport de l'organisation mondiale de la santé, les maladies infectieuses arrivent toujours au deuxième rang des principales causes de mortalité au monde. De plus, l'apparition croissante de microorganismes résistants aux agents antimicrobiens a considérablement réduit l'efficacité de l'arsenal thérapeutique disponible, ce qui accentue l'urgence du besoin de nouvelles molécules antimicrobiennes. L'objectif général de ce projet était donc d'évaluer le potentiel antimicrobien de la flocculosine afin de préciser son spectre d'activité, d'évaluer sa toxicité, de clarifier son mode d'action et de définir son implication dans l'écologie de P. flocculosa . En conditions acides, la flocculosine a démontré des effets délétères et très rapides contre une vaste gamme d'agents infectieux comprenant levures et bactéries. De plus, la molécule n'a pas été affectée par les divers mécanismes de résistance présents et l'association de la flocculosine avec l'amphotéricine B a révélé un fort synergisme, suggérant son utilisation comme adjuvant afin de réduire la toxicité et de contourner certaines résistances. Par ailleurs, la flocculosine n'a démontré aucune toxicité sur les différentes lignées cellulaires humaines exposées. Il a aussi été démontré que le glycolipide agissait au niveau de la membrane plasmique et que sa spécificité dépendait de la composition de celles-ci. En outre, ces travaux ont permis de révéler un nouveau rôle de la flocculosine dans le pouvoir adaptatif de P. flocculosa, celui de réserve énergétique. Les études de dégradation ont en effet indiqué que le champignon était capable de cataboliser sa toxine à l'aide d'une enzyme dans certaines conditions limitantes. Cela suggère un rôle beaucoup plus étendu que prévu pour la flocculosine; non pas limité à la protection de la niche écologique du champignon mais aussi impliqué au sein de processus énergétiques complexes. Bref, cette étude a démontré le potentiel antimicrobien de la flocculosine tout en jetant un éclairage nouveau sur ses implications biologiques.

The thesis deals with the study of the different yeast strains from the point of view of extracellular lipolytic enzyme production. First part of this work consisting of appropriate yeasts was developed within study interships in Slovak Academy of Sciences, department of Glycomics in Bratislava. From ten given strains three yeasts such as Pseudozyma fusiformata, Meyerozyma guilliermondii, Yarrowia lipolytica were chosen, these strains showed the highest lipolytic activity and cell growth on basal medium with Tween 80. These yeasts were used for optimization of cultivation conditions and characterization of lipolytic enzymes. The yeasts were cultivated on media with different carbon sources, which appeared to be a most suitable medium the basal medium with Tween. Tween acted as and inducer of lipase production. The substrate specificity was determined using three p-nitrophenylester substrates with varying sizes of the fatty acid site chains. The results showed that tested lipases are probably triacylglycerol-acyl-hydrolases which has the highest activity towards in the water insoluble substrates with medium long chains. The pH optimum and temperature optimum were measured. The results showed that the tested lipases had the highest activity in neutral and mild acid region around 30°C. By measuring of thermal stability has been demonstrated that extracellular lipases are relatively thermostable enzymes. Afterwards the storage stability was measured for 5 weeks when supernatant was kept in fridge at 4°C and in freezing box at -20°C. The results showed that in both cases tested lipases exhibited high storage stability which allows to store the samples without loss of activity for a longer time. Finally, the results of lipolytic and proteolytic activity, cell growth and pH of the medium of yeast Y. lipolytica were compared between the batch cultivation in L-tubes with the continual cultivation in the bioreactor. The highest lipases production was achieved in bioreactor due to the setting conditions of the continual proces to regulate the production and enzymatic stability.