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O mutante pso9-1 de Saccharomyces cerevisiae, sensível a psoralenos fotoativados, contém um alelo mutante do gene MEC3 envolvido em checkpointCardone, Jacqueline Moraes January 2002 (has links)
Análises de complementação do mutante pso9-1, sensível a psoralenos mono- e bifuncionais fotoativados, UV254nm e nitrosoguanidina, com os mutantes pso1 a pso8, confirmou que este contém uma nova mutação pso. A clonagem molecular a partir de um banco genômico de levedura sugeriu pso9-1 como alelo mutante do gene de checkpoint que responde a danos no DNA MEC3. A não-complementação de vários fenótipos de sensibilidade em diplóides pso9-1/mec3∆ confirmou o alelismo dos dois mutantes. A sensibilidade à calcofluor white e à cafeína não foi aumentada nas linhagens pso9-1 e mec3∆, em relação as suas respectivas selvagens, sugerindo que o mutante pso9-1 não porta uma mutação na região promotora. O fenótipo mutante de mec3∆ foi levemente mais pronunciado para sensibilidade à 8-MOP + UVA e UVC, e para a supressão de mutação para frente induzida por UVC, sugerindo uma função residual para a proteína produzida por este alelo mutante.
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O mutante pso9-1 de Saccharomyces cerevisiae, sensível a psoralenos fotoativados, contém um alelo mutante do gene MEC3 envolvido em checkpointCardone, Jacqueline Moraes January 2002 (has links)
Análises de complementação do mutante pso9-1, sensível a psoralenos mono- e bifuncionais fotoativados, UV254nm e nitrosoguanidina, com os mutantes pso1 a pso8, confirmou que este contém uma nova mutação pso. A clonagem molecular a partir de um banco genômico de levedura sugeriu pso9-1 como alelo mutante do gene de checkpoint que responde a danos no DNA MEC3. A não-complementação de vários fenótipos de sensibilidade em diplóides pso9-1/mec3∆ confirmou o alelismo dos dois mutantes. A sensibilidade à calcofluor white e à cafeína não foi aumentada nas linhagens pso9-1 e mec3∆, em relação as suas respectivas selvagens, sugerindo que o mutante pso9-1 não porta uma mutação na região promotora. O fenótipo mutante de mec3∆ foi levemente mais pronunciado para sensibilidade à 8-MOP + UVA e UVC, e para a supressão de mutação para frente induzida por UVC, sugerindo uma função residual para a proteína produzida por este alelo mutante.
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O mutante pso9-1 de Saccharomyces cerevisiae, sensível a psoralenos fotoativados, contém um alelo mutante do gene MEC3 envolvido em checkpointCardone, Jacqueline Moraes January 2002 (has links)
Análises de complementação do mutante pso9-1, sensível a psoralenos mono- e bifuncionais fotoativados, UV254nm e nitrosoguanidina, com os mutantes pso1 a pso8, confirmou que este contém uma nova mutação pso. A clonagem molecular a partir de um banco genômico de levedura sugeriu pso9-1 como alelo mutante do gene de checkpoint que responde a danos no DNA MEC3. A não-complementação de vários fenótipos de sensibilidade em diplóides pso9-1/mec3∆ confirmou o alelismo dos dois mutantes. A sensibilidade à calcofluor white e à cafeína não foi aumentada nas linhagens pso9-1 e mec3∆, em relação as suas respectivas selvagens, sugerindo que o mutante pso9-1 não porta uma mutação na região promotora. O fenótipo mutante de mec3∆ foi levemente mais pronunciado para sensibilidade à 8-MOP + UVA e UVC, e para a supressão de mutação para frente induzida por UVC, sugerindo uma função residual para a proteína produzida por este alelo mutante.
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Funções da proteína Pso9/Mec3 no controle do ciclo celular e reparação de DNA em Saccharomyces cerevisiaeCardone, Jacqueline Moraes January 2006 (has links)
A manutenção da estabilidade do material hereditário das células requer fidelidade na replicação do DNA, precisão na segregação dos cromossomos e a capacidade de evitar mutações herdáveis, causadas por injúrias espontâneas e induzidas no genoma. Para enfrentar estes desafios, as células possuem processos evolutivamente conservados, incluindo reparação do DNA e mecanismos de checkpoint. Falhas no cumprimento destes mecanismos podem resultar em morte celular, no acúmulo de mutações herdáveis e na indução de instabilidade genômica, a qual é uma característica predominante de células tumorais. Em Saccharomyces cerevisiae, a visão mais recente dos estágios iniciais da resposta de checkpoint indica que dois complexos de proteínas, Mec1-Ddc2 e Rad17- Mec3-Ddc1, são recrutados à região de lesão no DNA. Rad17p, Mec3p, e Ddc1p (os homólogos humanos são Rad1, Hus1, e Rad9, respectivamente) formam um complexo heterotrimérico estruturalmente relacionado ao antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), o fator de processividade das DNA polimerases δ e ε. Recentemente, identificamos um alelo mutante de MEC3 – pso9-1 – o qual é fortemente sensível a vários agentes indutores de danos no DNA e apresenta baixa mutabilidade induzida. Para prosseguir nas investigações dos efeitos da proteína mutante Pso9-1, a seqüência completa do alelo mutante foi determinada. A comparação das seqüências obtidas com a seqüência tipo-selvagem depositada nos bancos de dados revelou a deleção de um único nucleotídeo, na posição 802 (802delA), a qual leva a uma forma truncada de Pso9p. O alelo mutante pso9-1[802delA] codifica, um polipeptídeo de 276 aminoácidos, no qual os últimos nove aminoácidos estão fora da fase leitura apropriada e seu domínio carboxi-terminal, drasticamente diminuído. Esta mutação afetou as propriedades de ligação de Pso9-1p, impedindo as interações com seus parceiros de complexo Rad17p e Ddc1p. Ensaios adicionais de interação empregando construções de mec3 que não continham os últimos 25 e 75 aminoácidos do domínio carboxiterminal também não foram capazes de manter interações estáveis. Além disso, a linhagem mutante pso9-1 perdeu a capacidade de detectar danos no DNA, uma vez que dava continuidade no ciclo-celular, após tratamento com 8-metoxipsoraleno fotoativado. Uma vez analisada a reposta a danos no DNA de mutantes deficientes no componente de PCNA-like, Pso9p/Mec3p, em combinação à inativação de subunidades de DNA polimerases replicativas (Pols α, δ and ε), foi encontrada uma interação aditiva entre PSO9/MEC3 e POL32, o qual codifica a terceira subunidade da DNA polimerase δ. A hipersensibilidade de pol32Δ a 8-MOP fotoativado, revelada por estas análises genéticas, sugeriu fortemente a participação ainda não descrita de uma polimerase replicativa na reparação de pontes intercadeias. Esta hipótese foi confirmada, já que o mutante pol32Δ também se mostrou extremamente deficiente em ligar extremidades de DNA não-coesivas, particularmente em casos de extremidades protuberantes 5’, sugerindo um papel para a DNA polimerase δ em recombinação não-homóloga (NHEJ). A coleção de dados apresentada neste trabalho reafirma a importância de proteínas como Pso9p/Mec3p que iniciam a sinalização de anormalidades no DNA. Além disso, amplia a rede de proteínas que responde a danos do tipo pontes intercadeias, mostrando que uma proteína em particular, como visto para Pol32p, pode ter tarefas adicionais como mecanismo de segurança, a fim de garantir a estabilidade genômica. / Maintenance of stability of hereditary material of cells requires fidelity in DNA replication, precision in chromosome segregation, and the ability to avoid heritable mutations caused by spontaneous and induced genomic insults. To cope with these challenges cells have evolved evolutionarily conserved processes, including DNA repair and checkpoint mechanisms. Failure to enforce these mechanisms can result in cell death or in accumulation of heritable mutations and the induction of genome instability, which is a predominant characteristic of cancer cells. In Saccharomyces cerevisiae, it is the current understanding of the initial stages of the checkpoint response that two protein complexes, Mec1-Ddc2 and Rad17-Mec3- Ddc1, are recruited to sites near a DNA lesion. Rad17p, Mec3p, and Ddc1p (the human homologues are Rad1, Hus1, and Rad9, respectively) form a heterotrimeric complex structurally related to the proliferating cell nuclear antigen (PCNA), the processivity factor of DNA polymerases δ and ε. We have recently identified a yeast mutant allele of MEC3 – pso9-1 – which is strongly sensitive to DNA damaging agents and confers low induced mutability. To further investigate the effects of the Pso9-1 mutant protein, the complete sequence of the mutant allele was determined. The comparison of obtained sequences with the databank-deposited wild-type MEC3 sequence revealed a single deletion of nucleotide position 802 (802delA) that leads to a truncated Pso9p. The 802delA frameshift mutant allele thus encodes a 276 amino acid polypeptide in which the last nine amino acids are out of proper reading frame and that has its carboxyl terminus dramatically shortened. This mutation affected the binding properties of Pso9-1p, abolishing its interactions with both Rad17p and Ddc1p. Further interaction assays employing mec3 constructions lacking the last 25 and 75 amino acid carboxyl termini were also not able to maintain stable interactions. Moreover, the pso9-1 mutant strain could no longer sense DNA damage since it continued in the cell cycle after photoactivated 8-methoxypsoralen treatment. When analyzing the response to DNA damage of yeast mutants lacking the yeast PCNA-like component Pso9p/Mec3p in combination with defective subunits of three replicative DNA polymerases (Pols α, δ and ε), we found an additive interaction between PSO9/MEC3 and POL32, which codifies the third subunit of DNA polymerase δ. The hypersensitivity of pol32Δ to photoactivated 8-MOP revealed by these genetic analyses strongly suggested the hitherto unknown participation of a replicative polymerase in the repair of interstrand cross-links. This assumption was confirmed since we also found the pol32Δ mutant extremely deficient in joining non-cohesive DNA ends, particularly in cases of mismatched 5’ overhangs, suggesting a role for DNA polymerase δ in non-homologous end-joining (NHEJ). The collection of data presented in this work reasserts the relevance of sensor proteins as Pso9p/Mec3p in initiating the signaling of structural abnormalities in DNA. Moreover, it amplifies the network of interstrand cross-links responsive proteins, showing that a particular protein, as seen for Pol32p, may have additional tasks as a safety mechanism in ensuring genomic stability.
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Funções da proteína Pso9/Mec3 no controle do ciclo celular e reparação de DNA em Saccharomyces cerevisiaeCardone, Jacqueline Moraes January 2006 (has links)
A manutenção da estabilidade do material hereditário das células requer fidelidade na replicação do DNA, precisão na segregação dos cromossomos e a capacidade de evitar mutações herdáveis, causadas por injúrias espontâneas e induzidas no genoma. Para enfrentar estes desafios, as células possuem processos evolutivamente conservados, incluindo reparação do DNA e mecanismos de checkpoint. Falhas no cumprimento destes mecanismos podem resultar em morte celular, no acúmulo de mutações herdáveis e na indução de instabilidade genômica, a qual é uma característica predominante de células tumorais. Em Saccharomyces cerevisiae, a visão mais recente dos estágios iniciais da resposta de checkpoint indica que dois complexos de proteínas, Mec1-Ddc2 e Rad17- Mec3-Ddc1, são recrutados à região de lesão no DNA. Rad17p, Mec3p, e Ddc1p (os homólogos humanos são Rad1, Hus1, e Rad9, respectivamente) formam um complexo heterotrimérico estruturalmente relacionado ao antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), o fator de processividade das DNA polimerases δ e ε. Recentemente, identificamos um alelo mutante de MEC3 – pso9-1 – o qual é fortemente sensível a vários agentes indutores de danos no DNA e apresenta baixa mutabilidade induzida. Para prosseguir nas investigações dos efeitos da proteína mutante Pso9-1, a seqüência completa do alelo mutante foi determinada. A comparação das seqüências obtidas com a seqüência tipo-selvagem depositada nos bancos de dados revelou a deleção de um único nucleotídeo, na posição 802 (802delA), a qual leva a uma forma truncada de Pso9p. O alelo mutante pso9-1[802delA] codifica, um polipeptídeo de 276 aminoácidos, no qual os últimos nove aminoácidos estão fora da fase leitura apropriada e seu domínio carboxi-terminal, drasticamente diminuído. Esta mutação afetou as propriedades de ligação de Pso9-1p, impedindo as interações com seus parceiros de complexo Rad17p e Ddc1p. Ensaios adicionais de interação empregando construções de mec3 que não continham os últimos 25 e 75 aminoácidos do domínio carboxiterminal também não foram capazes de manter interações estáveis. Além disso, a linhagem mutante pso9-1 perdeu a capacidade de detectar danos no DNA, uma vez que dava continuidade no ciclo-celular, após tratamento com 8-metoxipsoraleno fotoativado. Uma vez analisada a reposta a danos no DNA de mutantes deficientes no componente de PCNA-like, Pso9p/Mec3p, em combinação à inativação de subunidades de DNA polimerases replicativas (Pols α, δ and ε), foi encontrada uma interação aditiva entre PSO9/MEC3 e POL32, o qual codifica a terceira subunidade da DNA polimerase δ. A hipersensibilidade de pol32Δ a 8-MOP fotoativado, revelada por estas análises genéticas, sugeriu fortemente a participação ainda não descrita de uma polimerase replicativa na reparação de pontes intercadeias. Esta hipótese foi confirmada, já que o mutante pol32Δ também se mostrou extremamente deficiente em ligar extremidades de DNA não-coesivas, particularmente em casos de extremidades protuberantes 5’, sugerindo um papel para a DNA polimerase δ em recombinação não-homóloga (NHEJ). A coleção de dados apresentada neste trabalho reafirma a importância de proteínas como Pso9p/Mec3p que iniciam a sinalização de anormalidades no DNA. Além disso, amplia a rede de proteínas que responde a danos do tipo pontes intercadeias, mostrando que uma proteína em particular, como visto para Pol32p, pode ter tarefas adicionais como mecanismo de segurança, a fim de garantir a estabilidade genômica. / Maintenance of stability of hereditary material of cells requires fidelity in DNA replication, precision in chromosome segregation, and the ability to avoid heritable mutations caused by spontaneous and induced genomic insults. To cope with these challenges cells have evolved evolutionarily conserved processes, including DNA repair and checkpoint mechanisms. Failure to enforce these mechanisms can result in cell death or in accumulation of heritable mutations and the induction of genome instability, which is a predominant characteristic of cancer cells. In Saccharomyces cerevisiae, it is the current understanding of the initial stages of the checkpoint response that two protein complexes, Mec1-Ddc2 and Rad17-Mec3- Ddc1, are recruited to sites near a DNA lesion. Rad17p, Mec3p, and Ddc1p (the human homologues are Rad1, Hus1, and Rad9, respectively) form a heterotrimeric complex structurally related to the proliferating cell nuclear antigen (PCNA), the processivity factor of DNA polymerases δ and ε. We have recently identified a yeast mutant allele of MEC3 – pso9-1 – which is strongly sensitive to DNA damaging agents and confers low induced mutability. To further investigate the effects of the Pso9-1 mutant protein, the complete sequence of the mutant allele was determined. The comparison of obtained sequences with the databank-deposited wild-type MEC3 sequence revealed a single deletion of nucleotide position 802 (802delA) that leads to a truncated Pso9p. The 802delA frameshift mutant allele thus encodes a 276 amino acid polypeptide in which the last nine amino acids are out of proper reading frame and that has its carboxyl terminus dramatically shortened. This mutation affected the binding properties of Pso9-1p, abolishing its interactions with both Rad17p and Ddc1p. Further interaction assays employing mec3 constructions lacking the last 25 and 75 amino acid carboxyl termini were also not able to maintain stable interactions. Moreover, the pso9-1 mutant strain could no longer sense DNA damage since it continued in the cell cycle after photoactivated 8-methoxypsoralen treatment. When analyzing the response to DNA damage of yeast mutants lacking the yeast PCNA-like component Pso9p/Mec3p in combination with defective subunits of three replicative DNA polymerases (Pols α, δ and ε), we found an additive interaction between PSO9/MEC3 and POL32, which codifies the third subunit of DNA polymerase δ. The hypersensitivity of pol32Δ to photoactivated 8-MOP revealed by these genetic analyses strongly suggested the hitherto unknown participation of a replicative polymerase in the repair of interstrand cross-links. This assumption was confirmed since we also found the pol32Δ mutant extremely deficient in joining non-cohesive DNA ends, particularly in cases of mismatched 5’ overhangs, suggesting a role for DNA polymerase δ in non-homologous end-joining (NHEJ). The collection of data presented in this work reasserts the relevance of sensor proteins as Pso9p/Mec3p in initiating the signaling of structural abnormalities in DNA. Moreover, it amplifies the network of interstrand cross-links responsive proteins, showing that a particular protein, as seen for Pol32p, may have additional tasks as a safety mechanism in ensuring genomic stability.
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Funções da proteína Pso9/Mec3 no controle do ciclo celular e reparação de DNA em Saccharomyces cerevisiaeCardone, Jacqueline Moraes January 2006 (has links)
A manutenção da estabilidade do material hereditário das células requer fidelidade na replicação do DNA, precisão na segregação dos cromossomos e a capacidade de evitar mutações herdáveis, causadas por injúrias espontâneas e induzidas no genoma. Para enfrentar estes desafios, as células possuem processos evolutivamente conservados, incluindo reparação do DNA e mecanismos de checkpoint. Falhas no cumprimento destes mecanismos podem resultar em morte celular, no acúmulo de mutações herdáveis e na indução de instabilidade genômica, a qual é uma característica predominante de células tumorais. Em Saccharomyces cerevisiae, a visão mais recente dos estágios iniciais da resposta de checkpoint indica que dois complexos de proteínas, Mec1-Ddc2 e Rad17- Mec3-Ddc1, são recrutados à região de lesão no DNA. Rad17p, Mec3p, e Ddc1p (os homólogos humanos são Rad1, Hus1, e Rad9, respectivamente) formam um complexo heterotrimérico estruturalmente relacionado ao antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), o fator de processividade das DNA polimerases δ e ε. Recentemente, identificamos um alelo mutante de MEC3 – pso9-1 – o qual é fortemente sensível a vários agentes indutores de danos no DNA e apresenta baixa mutabilidade induzida. Para prosseguir nas investigações dos efeitos da proteína mutante Pso9-1, a seqüência completa do alelo mutante foi determinada. A comparação das seqüências obtidas com a seqüência tipo-selvagem depositada nos bancos de dados revelou a deleção de um único nucleotídeo, na posição 802 (802delA), a qual leva a uma forma truncada de Pso9p. O alelo mutante pso9-1[802delA] codifica, um polipeptídeo de 276 aminoácidos, no qual os últimos nove aminoácidos estão fora da fase leitura apropriada e seu domínio carboxi-terminal, drasticamente diminuído. Esta mutação afetou as propriedades de ligação de Pso9-1p, impedindo as interações com seus parceiros de complexo Rad17p e Ddc1p. Ensaios adicionais de interação empregando construções de mec3 que não continham os últimos 25 e 75 aminoácidos do domínio carboxiterminal também não foram capazes de manter interações estáveis. Além disso, a linhagem mutante pso9-1 perdeu a capacidade de detectar danos no DNA, uma vez que dava continuidade no ciclo-celular, após tratamento com 8-metoxipsoraleno fotoativado. Uma vez analisada a reposta a danos no DNA de mutantes deficientes no componente de PCNA-like, Pso9p/Mec3p, em combinação à inativação de subunidades de DNA polimerases replicativas (Pols α, δ and ε), foi encontrada uma interação aditiva entre PSO9/MEC3 e POL32, o qual codifica a terceira subunidade da DNA polimerase δ. A hipersensibilidade de pol32Δ a 8-MOP fotoativado, revelada por estas análises genéticas, sugeriu fortemente a participação ainda não descrita de uma polimerase replicativa na reparação de pontes intercadeias. Esta hipótese foi confirmada, já que o mutante pol32Δ também se mostrou extremamente deficiente em ligar extremidades de DNA não-coesivas, particularmente em casos de extremidades protuberantes 5’, sugerindo um papel para a DNA polimerase δ em recombinação não-homóloga (NHEJ). A coleção de dados apresentada neste trabalho reafirma a importância de proteínas como Pso9p/Mec3p que iniciam a sinalização de anormalidades no DNA. Além disso, amplia a rede de proteínas que responde a danos do tipo pontes intercadeias, mostrando que uma proteína em particular, como visto para Pol32p, pode ter tarefas adicionais como mecanismo de segurança, a fim de garantir a estabilidade genômica. / Maintenance of stability of hereditary material of cells requires fidelity in DNA replication, precision in chromosome segregation, and the ability to avoid heritable mutations caused by spontaneous and induced genomic insults. To cope with these challenges cells have evolved evolutionarily conserved processes, including DNA repair and checkpoint mechanisms. Failure to enforce these mechanisms can result in cell death or in accumulation of heritable mutations and the induction of genome instability, which is a predominant characteristic of cancer cells. In Saccharomyces cerevisiae, it is the current understanding of the initial stages of the checkpoint response that two protein complexes, Mec1-Ddc2 and Rad17-Mec3- Ddc1, are recruited to sites near a DNA lesion. Rad17p, Mec3p, and Ddc1p (the human homologues are Rad1, Hus1, and Rad9, respectively) form a heterotrimeric complex structurally related to the proliferating cell nuclear antigen (PCNA), the processivity factor of DNA polymerases δ and ε. We have recently identified a yeast mutant allele of MEC3 – pso9-1 – which is strongly sensitive to DNA damaging agents and confers low induced mutability. To further investigate the effects of the Pso9-1 mutant protein, the complete sequence of the mutant allele was determined. The comparison of obtained sequences with the databank-deposited wild-type MEC3 sequence revealed a single deletion of nucleotide position 802 (802delA) that leads to a truncated Pso9p. The 802delA frameshift mutant allele thus encodes a 276 amino acid polypeptide in which the last nine amino acids are out of proper reading frame and that has its carboxyl terminus dramatically shortened. This mutation affected the binding properties of Pso9-1p, abolishing its interactions with both Rad17p and Ddc1p. Further interaction assays employing mec3 constructions lacking the last 25 and 75 amino acid carboxyl termini were also not able to maintain stable interactions. Moreover, the pso9-1 mutant strain could no longer sense DNA damage since it continued in the cell cycle after photoactivated 8-methoxypsoralen treatment. When analyzing the response to DNA damage of yeast mutants lacking the yeast PCNA-like component Pso9p/Mec3p in combination with defective subunits of three replicative DNA polymerases (Pols α, δ and ε), we found an additive interaction between PSO9/MEC3 and POL32, which codifies the third subunit of DNA polymerase δ. The hypersensitivity of pol32Δ to photoactivated 8-MOP revealed by these genetic analyses strongly suggested the hitherto unknown participation of a replicative polymerase in the repair of interstrand cross-links. This assumption was confirmed since we also found the pol32Δ mutant extremely deficient in joining non-cohesive DNA ends, particularly in cases of mismatched 5’ overhangs, suggesting a role for DNA polymerase δ in non-homologous end-joining (NHEJ). The collection of data presented in this work reasserts the relevance of sensor proteins as Pso9p/Mec3p in initiating the signaling of structural abnormalities in DNA. Moreover, it amplifies the network of interstrand cross-links responsive proteins, showing that a particular protein, as seen for Pol32p, may have additional tasks as a safety mechanism in ensuring genomic stability.
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