Eine einfache Form des Lernens ist die Bildung einer Assoziation zwischen zwei Reizen. Diese Form des Lernens wird nach dem russischen Physiologen I.P. Pawlow (1948-1936) in der Lerntheorie als klassisches Konditionieren bezeichnet. Das Shuttlebox-Training basiert auf der klassischen Konditionierung. Hierbei lernt das Individuum, Er¬eignisse aus der Umgebung vorherzusehen, eine Belohnung zu erhalten (Belohnungs¬lernen) oder, wie in dieser Arbeit zutreffend, eine Strafe zu vermeiden (aversives Ler¬nen). Diese Strafvermeidung selbst ist die eigentliche Belohnung und bestärkt das Ver¬halten positiv (Kim und Mitarb., 2006, PLoS Biol. 4: e233). Für die durchgeführten Ana¬lysen wurde der orbitale Präfrontalkortex gewählt, da er u.a. in emotionales Lernen, Vermeidungslernen und die Verarbeitung von Angst involviert ist, Umweltreize verar¬beitet und diese mit bereits vorhandenen Gedächtnisinhalten verknüpft (Barbas und Zikopoulos, 2007, Neuroscientist 13: 532). Trainiert man juvenile Ratten (P17-P21) (P = postnataler Tag) in der Shuttlebox, so sind sie unfähig, eine aktive Vermeidungsstrategie zu entwickeln, da die Lernaufgabe in der Shuttlebox sehr komplex ist und die lernrelevanten Hirnbezirke noch unreif sind (Gruss und Mitarb., 2010, Neurobiol. Learn. Mem. 94: 329). Wird das Training im adulten Alter (P80-P84) wiederholt, verbessert sich das Vermeidungslernen in der initialen Phase des adulten Trainings im Vergleich zum Vermeidungslernen bei adulten Tieren ohne juveni¬les Vortraining. Offensichtlich hat das juvenile Training eine „Spur“ im Gehirn der Tiere hinterlassen, die beim späteren adulten Training zu verbesserten Lernleistungen führt (Gruss und Mitarb., 2010, Neurobiol. Learn. Mem. 94: 329). Die Arbeitshypothese postuliert, dass die juvenile Trainingsprozedur zu strukturellen Veränderungen von Pyramidenzellen im orbitalen Präfrontalkortex (OFC) führt, die wäh¬rend der Hirnreifung erhalten bleiben und bei adultem Training ein effektiveres Lernen ermöglichen. Um diese Hypothese zu prüfen, wurden in der vorliegenden Arbeit die Spinezahl und -dichte sowie die Dendritenmorphologie der Pyramidenzellen der Schicht II/III des OFC von juvenilen und adulten Wistar-Ratten nach verschiedenen Shuttlebox-Trainingsphasen bestimmt. Für diese Untersuchungen fanden 110 weibliche Ratten Verwendung, davon gingen 50 Tiere in die morphologischen Analysen ein. Die Ver¬suchstiere waren in sechs verschiedene Gruppen unterteilt: n: juvenile nicht trainierte Tiere (P24), juvenile Kontrollgruppe, t: juvenile Tiere (P24), die vom P17-P21 trainiert wurden, nn: adulte Tiere ohne juveniles Vortraining (P 87), adulte Kontrollgruppe, nt: adulte Tiere (P 87), die adult vom P80-P84 trainiert wurden, tn: adulte Tiere (P 87), die juvenil vom P17-P21 trainiert wurden, tt: adulte Tiere (P 87), die juvenil vom P17-P21 und adult vom P80-P84 trainiert wur¬den. Zu Beginn eines Tests wurde auf der Kammerseite, auf der sich das Tier derzeit befand, für fünf Sekunden ein Tonsignal (2400 Hz, 80 dB) ausgesendet (konditionierter Stimu¬lus). Während dieses Zeitraums sollte das Tier die Kammerseite wechseln, es wurde dann kein elektrischer Reiz appliziert. Falls ein Wechsel der Kammerseite ausblieb, kam über die Gitterstäbe des Boxenbodens für maximal 15 Sekunden ein elektrischer Sti¬mulus hinzu (unkonditionierter Stimulus). Ziel des Trainings war ein Kammerwechsel des Tieres während des Tonsignals, vor Applikation des elektrischen Stimulus (Kondi¬tionierung). An fünf aufeinanderfolgenden Tagen bestand die tägliche Trainingseinheit aus 50 Tests. Am P24 bzw. P87 erfolgten die Dekapitation der Versuchstiere und die Präparation der Gehirne. Die Schnitte wurden mit der Golgi-Cox-Methode angefärbt (Ramon-Moliner, 1970, In: Contemporary research methods in neuroanatomy, Berlin: Springer). Die Py-ramidenzellen der Schicht II/III des orbitalen Präfrontalkortex wurden mit dem computer¬gestützten NeurolucidaTM-System (MicroBrightField Inc., Colchester, USA) dreidimen¬sional nachgezeichnet und die Spines (Orte der exzitatorischen Synapsen) markiert. Die Charakterisierung der Zellstruktur erfolgte über die Spinedichte, Spinezahl, Dendriten¬länge und Verzweigungsstruktur des Apikaldendriten und eines der Basaldendriten. Ins¬gesamt gingen 200 Zellen der verschiedenen Tiergruppen in die Analyse ein. Die Grup¬penzugehörigkeit der Tiere war codiert und während der Auswertung nicht bekannt. Fragestellungen und Ergebnisse: 1.) Wie verändert sich während der postnatalen Entwicklung die Zellstruktur der Pyrami¬denzellen der Schicht II/III des OFC (Vergleich der Gruppen „n“ und „nn“)? Während des normalen neuronalen Entwicklungsverlaufs (ohne jegliche Trainingserfah¬rung) zeigte sich, dass sowohl die Spinedichte als auch die Spinezahl mit zunehmen¬dem Alter der Versuchstiere abnahm. Dies ist vermutlich durch einen Selektionsprozess bedingt, bei dem selten genutzte Synapsen eliminiert werden, häufig genutzte Synapsen erhalten bleiben und ihre Übertragungsstärke erhöht wird. 2.) Führt juveniles Training der Ratten zu unmittelbaren Veränderungen der Zellstruktur der Pyramidenzellen der Schicht II/III des OFC (Synapsendichte, Synapsenzahl und Dendritenlänge) (Vergleich der Gruppen „n“ und „t“)? Für den Apikaldendriten waren keine morphologischen Veränderungen nachweisbar, der Basaldendrit zeigte in der trainierten Gruppe eine signifikant verringerte Spinedichte. 3.) Sind durch juveniles Training eventuell induzierte Veränderungen der Zellstruktur auch noch bei adulten Tieren nachweisbar (Vergleich der Gruppen „t“ und „tn“)? Durch juveniles Training kommt es bei den Jungtieren zu einer Stabilisierung relevanter synaptischer Verbindungen, die während der normalen Entwicklung nachgewiesene Sy¬napsenreduktion bleibt aus. Dieses im juvenilen Alter ausgebildete, noch nicht ausge¬reifte, neuronale Netzwerk optimiert das adulte Shuttlebox-Lernen. 4.) Führt ausschließlich adultes Training zu Veränderungen der Zellstruktur der Pyrami¬denzellen der Schicht II/III des OFC (Vergleich der Gruppen „nn“ und „nt“)? Der Verlust der Synapsen während der normalen Entwicklung ist reversibel. Durch adultes Training formieren sich die Synapsen neu, sowohl die Spinedichte als auch die Spinezahl steigen an und erreichen die Werte der juvenil trainierten Tiere. 5.) Werden durch juveniles Training eventuell induzierte Veränderungen der Zellstruktur der Pyramidenzellen der Schicht II/III des OFC durch eine zweite, adulte Trainings¬phase, verstärkt (Vergleich der Gruppen „tn“ und „tt“)? Eine adulte Trainingsphase, zusätzlich zum juvenilen Vortraining, führt zu keinen weite¬ren Veränderungen der Pyramidenzellstruktur. Die juvenil trainierten Tiere erreichen nach einem wiederholten adulten Training das Lernziel jedoch schneller als ausschlie߬lich adult trainierte Tiere. Als Ursache wird vermutet, dass die Synapsenneubildung bei den ausschließlich adult trainierten Tieren (Gruppe „nt“) Zeit in Anspruch nimmt. Bei den juvenil vortrainierten Tieren (Gruppe „tn“) sind diese Synapsen jedoch schon vorhanden und müssen durch das adulte Training (Gruppe „tt“) im Netzwerk nur noch aktiviert wer¬den. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein juveniles Shuttlebox-Training bei Ratten exzitatorische Synapsen an den Dendriten der Pyramidenzellen der Schichten II und III des OFC stabilisiert, obwohl die Tiere zu diesem Zeitpunkt noch keine Vermeidungs¬strategie entwickeln können. Diese im juvenilen Stadium stabilisierte Dendritenmorpho¬logie führt aber dazu, dass die Tiere im adulten Stadium die Vermeidungsaufgabe in der Shuttlebox schneller lernen können. Auf Grund der vielen am Shuttlebox-Lernen beteiligten Hirnregionen und ihrer unter-schiedlichen funktionellen Zusammenarbeit geben die Ergebnisse dieser Arbeit nur ei¬nen kleinen Einblick in lerninduzierte, strukturelle Veränderungen neuronaler Netzwerke. Für ein besseres Verständnis von Lern- und Gedächtnisvorgängen sind weiterführende Untersuchungen unumgänglich.

Eine einfache Form des Lernens ist die Bildung einer Assoziation zwischen zwei Reizen. Diese Form des Lernens wird nach dem russischen Physiologen I.P. Pawlow (1948-1936) in der Lerntheorie als klassisches Konditionieren bezeichnet. Das Shuttlebox-Training basiert auf der klassischen Konditionierung. Hierbei lernt das Individuum, Er¬eignisse aus der Umgebung vorherzusehen, eine Belohnung zu erhalten (Belohnungs¬lernen) oder, wie in dieser Arbeit zutreffend, eine Strafe zu vermeiden (aversives Ler¬nen). Diese Strafvermeidung selbst ist die eigentliche Belohnung und bestärkt das Ver¬halten positiv (Kim und Mitarb., 2006, PLoS Biol. 4: e233). Für die durchgeführten Ana¬lysen wurde der orbitale Präfrontalkortex gewählt, da er u.a. in emotionales Lernen, Vermeidungslernen und die Verarbeitung von Angst involviert ist, Umweltreize verar¬beitet und diese mit bereits vorhandenen Gedächtnisinhalten verknüpft (Barbas und Zikopoulos, 2007, Neuroscientist 13: 532). Trainiert man juvenile Ratten (P17-P21) (P = postnataler Tag) in der Shuttlebox, so sind sie unfähig, eine aktive Vermeidungsstrategie zu entwickeln, da die Lernaufgabe in der Shuttlebox sehr komplex ist und die lernrelevanten Hirnbezirke noch unreif sind (Gruss und Mitarb., 2010, Neurobiol. Learn. Mem. 94: 329). Wird das Training im adulten Alter (P80-P84) wiederholt, verbessert sich das Vermeidungslernen in der initialen Phase des adulten Trainings im Vergleich zum Vermeidungslernen bei adulten Tieren ohne juveni¬les Vortraining. Offensichtlich hat das juvenile Training eine „Spur“ im Gehirn der Tiere hinterlassen, die beim späteren adulten Training zu verbesserten Lernleistungen führt (Gruss und Mitarb., 2010, Neurobiol. Learn. Mem. 94: 329). Die Arbeitshypothese postuliert, dass die juvenile Trainingsprozedur zu strukturellen Veränderungen von Pyramidenzellen im orbitalen Präfrontalkortex (OFC) führt, die wäh¬rend der Hirnreifung erhalten bleiben und bei adultem Training ein effektiveres Lernen ermöglichen. Um diese Hypothese zu prüfen, wurden in der vorliegenden Arbeit die Spinezahl und -dichte sowie die Dendritenmorphologie der Pyramidenzellen der Schicht II/III des OFC von juvenilen und adulten Wistar-Ratten nach verschiedenen Shuttlebox-Trainingsphasen bestimmt. Für diese Untersuchungen fanden 110 weibliche Ratten Verwendung, davon gingen 50 Tiere in die morphologischen Analysen ein. Die Ver¬suchstiere waren in sechs verschiedene Gruppen unterteilt: n: juvenile nicht trainierte Tiere (P24), juvenile Kontrollgruppe, t: juvenile Tiere (P24), die vom P17-P21 trainiert wurden, nn: adulte Tiere ohne juveniles Vortraining (P 87), adulte Kontrollgruppe, nt: adulte Tiere (P 87), die adult vom P80-P84 trainiert wurden, tn: adulte Tiere (P 87), die juvenil vom P17-P21 trainiert wurden, tt: adulte Tiere (P 87), die juvenil vom P17-P21 und adult vom P80-P84 trainiert wur¬den. Zu Beginn eines Tests wurde auf der Kammerseite, auf der sich das Tier derzeit befand, für fünf Sekunden ein Tonsignal (2400 Hz, 80 dB) ausgesendet (konditionierter Stimu¬lus). Während dieses Zeitraums sollte das Tier die Kammerseite wechseln, es wurde dann kein elektrischer Reiz appliziert. Falls ein Wechsel der Kammerseite ausblieb, kam über die Gitterstäbe des Boxenbodens für maximal 15 Sekunden ein elektrischer Sti¬mulus hinzu (unkonditionierter Stimulus). Ziel des Trainings war ein Kammerwechsel des Tieres während des Tonsignals, vor Applikation des elektrischen Stimulus (Kondi¬tionierung). An fünf aufeinanderfolgenden Tagen bestand die tägliche Trainingseinheit aus 50 Tests. Am P24 bzw. P87 erfolgten die Dekapitation der Versuchstiere und die Präparation der Gehirne. Die Schnitte wurden mit der Golgi-Cox-Methode angefärbt (Ramon-Moliner, 1970, In: Contemporary research methods in neuroanatomy, Berlin: Springer). Die Py-ramidenzellen der Schicht II/III des orbitalen Präfrontalkortex wurden mit dem computer¬gestützten NeurolucidaTM-System (MicroBrightField Inc., Colchester, USA) dreidimen¬sional nachgezeichnet und die Spines (Orte der exzitatorischen Synapsen) markiert. Die Charakterisierung der Zellstruktur erfolgte über die Spinedichte, Spinezahl, Dendriten¬länge und Verzweigungsstruktur des Apikaldendriten und eines der Basaldendriten. Ins¬gesamt gingen 200 Zellen der verschiedenen Tiergruppen in die Analyse ein. Die Grup¬penzugehörigkeit der Tiere war codiert und während der Auswertung nicht bekannt. Fragestellungen und Ergebnisse: 1.) Wie verändert sich während der postnatalen Entwicklung die Zellstruktur der Pyrami¬denzellen der Schicht II/III des OFC (Vergleich der Gruppen „n“ und „nn“)? Während des normalen neuronalen Entwicklungsverlaufs (ohne jegliche Trainingserfah¬rung) zeigte sich, dass sowohl die Spinedichte als auch die Spinezahl mit zunehmen¬dem Alter der Versuchstiere abnahm. Dies ist vermutlich durch einen Selektionsprozess bedingt, bei dem selten genutzte Synapsen eliminiert werden, häufig genutzte Synapsen erhalten bleiben und ihre Übertragungsstärke erhöht wird. 2.) Führt juveniles Training der Ratten zu unmittelbaren Veränderungen der Zellstruktur der Pyramidenzellen der Schicht II/III des OFC (Synapsendichte, Synapsenzahl und Dendritenlänge) (Vergleich der Gruppen „n“ und „t“)? Für den Apikaldendriten waren keine morphologischen Veränderungen nachweisbar, der Basaldendrit zeigte in der trainierten Gruppe eine signifikant verringerte Spinedichte. 3.) Sind durch juveniles Training eventuell induzierte Veränderungen der Zellstruktur auch noch bei adulten Tieren nachweisbar (Vergleich der Gruppen „t“ und „tn“)? Durch juveniles Training kommt es bei den Jungtieren zu einer Stabilisierung relevanter synaptischer Verbindungen, die während der normalen Entwicklung nachgewiesene Sy¬napsenreduktion bleibt aus. Dieses im juvenilen Alter ausgebildete, noch nicht ausge¬reifte, neuronale Netzwerk optimiert das adulte Shuttlebox-Lernen. 4.) Führt ausschließlich adultes Training zu Veränderungen der Zellstruktur der Pyrami¬denzellen der Schicht II/III des OFC (Vergleich der Gruppen „nn“ und „nt“)? Der Verlust der Synapsen während der normalen Entwicklung ist reversibel. Durch adultes Training formieren sich die Synapsen neu, sowohl die Spinedichte als auch die Spinezahl steigen an und erreichen die Werte der juvenil trainierten Tiere. 5.) Werden durch juveniles Training eventuell induzierte Veränderungen der Zellstruktur der Pyramidenzellen der Schicht II/III des OFC durch eine zweite, adulte Trainings¬phase, verstärkt (Vergleich der Gruppen „tn“ und „tt“)? Eine adulte Trainingsphase, zusätzlich zum juvenilen Vortraining, führt zu keinen weite¬ren Veränderungen der Pyramidenzellstruktur. Die juvenil trainierten Tiere erreichen nach einem wiederholten adulten Training das Lernziel jedoch schneller als ausschlie߬lich adult trainierte Tiere. Als Ursache wird vermutet, dass die Synapsenneubildung bei den ausschließlich adult trainierten Tieren (Gruppe „nt“) Zeit in Anspruch nimmt. Bei den juvenil vortrainierten Tieren (Gruppe „tn“) sind diese Synapsen jedoch schon vorhanden und müssen durch das adulte Training (Gruppe „tt“) im Netzwerk nur noch aktiviert wer¬den. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein juveniles Shuttlebox-Training bei Ratten exzitatorische Synapsen an den Dendriten der Pyramidenzellen der Schichten II und III des OFC stabilisiert, obwohl die Tiere zu diesem Zeitpunkt noch keine Vermeidungs¬strategie entwickeln können. Diese im juvenilen Stadium stabilisierte Dendritenmorpho¬logie führt aber dazu, dass die Tiere im adulten Stadium die Vermeidungsaufgabe in der Shuttlebox schneller lernen können. Auf Grund der vielen am Shuttlebox-Lernen beteiligten Hirnregionen und ihrer unter-schiedlichen funktionellen Zusammenarbeit geben die Ergebnisse dieser Arbeit nur ei¬nen kleinen Einblick in lerninduzierte, strukturelle Veränderungen neuronaler Netzwerke. Für ein besseres Verständnis von Lern- und Gedächtnisvorgängen sind weiterführende Untersuchungen unumgänglich.

Tau ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, das die Polymerisation von Tubulin fördert und die Mikrotubuli stabilisiert. Folglich wird angenommen, dass Tau essentiell für die neuronale Morphogenese ist, vor allem für die Axonenausbildung und -aufrechterhaltung. Mittels tangentieller Nissl-gefärbter Schnitte von Mäusegehirnen konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Tau-knockout Mäuse die regelhafte thalamokortikale Barthaar-projektion („Barrel“ Konfiguration) entwickeln. Der Einfluss von Tau auf die Entstehung von Dendriten wurde anhand von Golgi-gefärbten Präparaten untersucht. Die Sholl-Analyse der gefärbten CA1-Pyramidenzellen zeigte, dass die Komplexität apikaler Dendriten durch das Fehlen von Tau reduziert wurde, während die Basaldendriten unbeeinflusst blieben. Das Tau-Protein scheint demzufolge unwesentlich für die Entstehung von axonalen Verbindungen im embryonalen Gehirn zu sein, ist aber beteiligt an der Steuerung des dendritischen Verzweigungsmusters. Ferner wurde beobachtet, dass sowohl die adulte Neurogenese, als auch die Mikrotubuli-Stabilität in den Apikal- und Basaldendriten und die Synapsen von dem Fehlen des Tau-Proteins unbeeinflusst blieben. In primären Zellkulturen aus dem Kleinhirn von Tau-knockout und Tau-wildtyp Mäusen konnten zwischen den zwei Genotypen keine signifikanten Unterschiede in der Länge oder im Verzweigungsmuster der Dendriten und der Axone von Körnerzellen beobachtet werden. Die Untersuchung der Effekte einzelner Tau-Isoformen auf die Morphologie von N2A-Zellen zeigte, dass es Unterschiede sowohl zwischen Tau-defizienten und Tau-positiven Zellen, als auch zwischen Zellen mit den verschiedenen Tau-Isoformen gibt. Das Tau-Protein übt demnach in vivo einen wichtigen Einfluss auf die Morphologie der Nervenzellen und besonders der Dendriten aus, welcher in vitro weiter analysiert wurde.

Lokale Pyramidenzellen sind die Hauptneurone des Hippocampus und können durch ihre Position und die Morphologie ihrer Dendriten als CA1 und CA3 Pyramidenzellen identifiziert werden. Die Dendriten der exzitatorischen Pyramidenzellen sind mit postsynaptischen Vorwölbungen, den so genannten Spines, bedeckt, welche in einem spezifischen Verteilungsmuster angeordnet sind. Neurotoxine wie das C3 Toxin von Clostridium botulinum sind funktionelle Substanzen, die die neuronale Morphologie verändern und die neuronale Funktion beeinflussen können. In dieser Studie wurden die morphologischen Veränderungen von intrazellulär mit Biocytin gefüllten CA1 Pyramidenzellen qualitativ und quantitativ analysiert. Die hippocampalen Schnittkulturen, in denen sich bekanntermaßen Pyramidenzellen ähnlich entwickeln wie in vivo, wurden dazu herangezogen, die Effekte der C3bot Toxin-Applikation auf die Verzweigung der Dendriten sowie Anzahl und Dichte der dendritischen Spines zu untersuchen. Drei Gruppen von Zellen wurden verglichen: Erstens Neurone, die in serumhaltigem Medium inkubiert worden waren, zweitens Nervenzellen, die in einem Medium ohne Serum inkubiert worden waren und drittens Zellen, die unter Serumentzug dem C3bot Toxin ausgesetzt worden waren. Die Inkubation dauerte 14 Tage, während die Dauer der Toxinexposition zwischen vier und sechs Stunden betrug. Mit Hilfe eines Computers wurden zweidimensionale Nachbildungen der biocytin-markierten CA1 Pyramidenzellen erstellt, und die Gesamtlänge der Dendriten, die Anzahl der dendritischen Verzweigungspunkte und die Gesamtzahl und Dichte der dendritischen Spines gemessen und statistisch ausgewertet. Signifikante Unterschiede wurden zwischen der mit C3 Toxin behandelten Gruppe und der serumhaltig inkubierten Kontrollgruppe beobachtet. Diese signifikanten morphologischen Veränderungen traten selektiv an den Apikaldendriten der toxinbehandelten CA1 Pyramidenzellen auf. Aus der Behandlung resultierte eine Reduktion der Anzahl apikaler Verzweigungspunkte, der Anzahl der apikalen Spines, der Gesamtzahl (basal und apikal addiert) der Spines sowie der Gesamtspinedichte. Im Gegensatz dazu ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen der toxinbehandelten Gruppe und der ohne Serum inkubierten Kontrollgruppe, obwohl der Serumentzug im Vergleich zur serumhaltig inkubierten Kontrollgruppe die Entwicklung der Zellen beeinflusste. Auf Grundlage der beobachteten Veränderungen können wir schließen, dass die Behandlung mit C3 bot einen starken Einfluss selektiv auf die Morphologie der Apikaldendriten ausübt. Der Mechanismus, der dieser selektiven Empfindlichkeit der Apikaldendriten gegenüber dem C3 bot Toxin zugrunde liegt, wird Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.

Tau ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, das die Polymerisation von Tubulin fördert und die Mikrotubuli stabilisiert. Folglich wird angenommen, dass Tau essentiell für die neuronale Morphogenese ist, vor allem für die Axonenausbildung und -aufrechterhaltung. Mittels tangentieller Nissl-gefärbter Schnitte von Mäusegehirnen konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Tau-knockout Mäuse die regelhafte thalamokortikale Barthaar-projektion („Barrel“ Konfiguration) entwickeln. Der Einfluss von Tau auf die Entstehung von Dendriten wurde anhand von Golgi-gefärbten Präparaten untersucht. Die Sholl-Analyse der gefärbten CA1-Pyramidenzellen zeigte, dass die Komplexität apikaler Dendriten durch das Fehlen von Tau reduziert wurde, während die Basaldendriten unbeeinflusst blieben. Das Tau-Protein scheint demzufolge unwesentlich für die Entstehung von axonalen Verbindungen im embryonalen Gehirn zu sein, ist aber beteiligt an der Steuerung des dendritischen Verzweigungsmusters. Ferner wurde beobachtet, dass sowohl die adulte Neurogenese, als auch die Mikrotubuli-Stabilität in den Apikal- und Basaldendriten und die Synapsen von dem Fehlen des Tau-Proteins unbeeinflusst blieben. In primären Zellkulturen aus dem Kleinhirn von Tau-knockout und Tau-wildtyp Mäusen konnten zwischen den zwei Genotypen keine signifikanten Unterschiede in der Länge oder im Verzweigungsmuster der Dendriten und der Axone von Körnerzellen beobachtet werden. Die Untersuchung der Effekte einzelner Tau-Isoformen auf die Morphologie von N2A-Zellen zeigte, dass es Unterschiede sowohl zwischen Tau-defizienten und Tau-positiven Zellen, als auch zwischen Zellen mit den verschiedenen Tau-Isoformen gibt. Das Tau-Protein übt demnach in vivo einen wichtigen Einfluss auf die Morphologie der Nervenzellen und besonders der Dendriten aus, welcher in vitro weiter analysiert wurde.:Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Das Mikrotubuli-assoziierte Protein Tau 1 1.2 Bedeutung des Tau-Proteins beim Menschen: Tauopathien 3 1.3 Bedeutung des Tau-Proteins beim Menschen: Mikrodeletion des MAPT-Lokus 4 1.4 Ergebnisse aus bisherigen Studien mit Tau-knockout Tieren 6 1.5 Aufgabenstellung 7 2 Material und Methoden 9 2.1 Material 9 2.1.1 Versuchstiere 9 2.1.2 Chemikalien 9 2.1.3 Häufig verwendete Lösungen 10 2.1.4 Geräte 10 2.2 Histologie 11 2.2.1 Fixierung 11 2.2.2 Golgi-Einzelschnittimprägnierung 11 2.2.3 Gefrierschnitte 11 2.2.4 Nissl-Färbung 12 2.2.5 Immunhistochemische Markierungen 13 2.3 Morphometrie 15 2.3.1 Sholl-Analyse 15 2.3.2 Volumenbestimmung 16 2.3.3 Zellzahl (Neurogenese) 17 2.3.4 Synapsenzahl 17 2.4 Proteinbiochemie 19 2.4.1 Proben 19 2.4.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 19 2.4.3 Western Blot 20 2.4.4 Immundetektion am Western Blot 21 2.5 Transfektion von Nervenzellen in primärer Zellkultur 25 2.5.1 Primäre Zellkultur 25 2.5.2 Transfektion von primären Zellkulturen 25 2.5.3 Morphometrische Analyse von Körnerzellen des Kleinhirns 26 2.6 Klonierung von Tau-Protein-Isoformen 27 2.6.1 Klonierungsstrategie zur Herstellung eines pIRES-DsRed-Tau Vektors 27 2.6.2 Agarose-Gelelektrophorese 30 2.6.3 Gelextraktion der verschiedenen Tau-Isoform-Sequenzen 30 2.6.4 Herstellung chemisch kompetenter E.coli Zellen 31 2.6.5 Chemische Transformation kompetenter E. coli Zellen 32 2.6.6 Animpfen 32 2.6.7 Plasmid-DNA Purifikation aus 15ml Medium („Miniprep”) 32 2.6.8 Schneiden mit Restriktionsendonukleasen 33 2.6.9 Plasmidpräparation aus 100 ml Medium („Midiprep“) 33 2.6.10 Transfektion von N2A-Zellen mit pIRESRed-Tau 34 2.6.11 Rekonstruktion der transfizierten N2A-Zellen 35 2.7 Statistische Auswertung 36 3 Ergebnisse 37 3.1 Thalamokorticale Projektionen 37 3.2 Komplexität der Dendriten von CA1-Pyramidenzellen 37 3.3 Adulte Neurogenese im Hippocampus 41 3.4 Volumen des Hippocampus 43 3.5 Glia 45 3.6 Synapsen 46 3.7 Stabilität der Mikrotubuli 48 3.8 Mikrotubuli-assoziierte Proteine 50 3.9 Entwicklung in vitro 52 3.9.1 Primärkulturen 52 3.9.2 N2A-Zellkultur 54 4 Diskussion 58 4.1 Diskussion der Methoden 58 4.1.1 Herstellung von Tau-knockout Mäusen 58 4.1.2 Golgi-Einzelschnittimprägnierung und die dreidimensionale Zellrekonstruktion 59 4.1.3 Neurogenese 60 4.1.4 Volumenbestimmung von Hippocampus und Gyrus dentatus 61 4.1.5 Synaptische Marker 61 4.1.6 Western Blot 62 4.1.7 Transfektion von primären Zellkulturen 62 4.1.8 Transfektion von N2A-Zellen mit humanen Tau-Isoformen 63 4.2 Vergleich mit bekannten Daten aus der Forschungsliteratur 64 4.2.1 Axonogenese 64 4.2.2 Dendritogenese 64 4.2.3 Mikrotubuli-assoziierte Proteine und Mikrotubuli-Stabilität 67 4.2.4 Neurogenese 67 4.2.5 Synaptogenese 68 4.2.6 Rolle der einzelnen Isoformen 68 4.3 Bedeutung für die Medizin 71 4.4 Fazit 72 5 Zusammenfassung 73 6 Literaturverzeichnis 76 Posterpräsentationen 88 Danksagung 89 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 90 Lebenslauf 91

Lokale Pyramidenzellen sind die Hauptneurone des Hippocampus und können durch ihre Position und die Morphologie ihrer Dendriten als CA1 und CA3 Pyramidenzellen identifiziert werden. Die Dendriten der exzitatorischen Pyramidenzellen sind mit postsynaptischen Vorwölbungen, den so genannten Spines, bedeckt, welche in einem spezifischen Verteilungsmuster angeordnet sind. Neurotoxine wie das C3 Toxin von Clostridium botulinum sind funktionelle Substanzen, die die neuronale Morphologie verändern und die neuronale Funktion beeinflussen können. In dieser Studie wurden die morphologischen Veränderungen von intrazellulär mit Biocytin gefüllten CA1 Pyramidenzellen qualitativ und quantitativ analysiert. Die hippocampalen Schnittkulturen, in denen sich bekanntermaßen Pyramidenzellen ähnlich entwickeln wie in vivo, wurden dazu herangezogen, die Effekte der C3bot Toxin-Applikation auf die Verzweigung der Dendriten sowie Anzahl und Dichte der dendritischen Spines zu untersuchen. Drei Gruppen von Zellen wurden verglichen: Erstens Neurone, die in serumhaltigem Medium inkubiert worden waren, zweitens Nervenzellen, die in einem Medium ohne Serum inkubiert worden waren und drittens Zellen, die unter Serumentzug dem C3bot Toxin ausgesetzt worden waren. Die Inkubation dauerte 14 Tage, während die Dauer der Toxinexposition zwischen vier und sechs Stunden betrug. Mit Hilfe eines Computers wurden zweidimensionale Nachbildungen der biocytin-markierten CA1 Pyramidenzellen erstellt, und die Gesamtlänge der Dendriten, die Anzahl der dendritischen Verzweigungspunkte und die Gesamtzahl und Dichte der dendritischen Spines gemessen und statistisch ausgewertet. Signifikante Unterschiede wurden zwischen der mit C3 Toxin behandelten Gruppe und der serumhaltig inkubierten Kontrollgruppe beobachtet. Diese signifikanten morphologischen Veränderungen traten selektiv an den Apikaldendriten der toxinbehandelten CA1 Pyramidenzellen auf. Aus der Behandlung resultierte eine Reduktion der Anzahl apikaler Verzweigungspunkte, der Anzahl der apikalen Spines, der Gesamtzahl (basal und apikal addiert) der Spines sowie der Gesamtspinedichte. Im Gegensatz dazu ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen der toxinbehandelten Gruppe und der ohne Serum inkubierten Kontrollgruppe, obwohl der Serumentzug im Vergleich zur serumhaltig inkubierten Kontrollgruppe die Entwicklung der Zellen beeinflusste. Auf Grundlage der beobachteten Veränderungen können wir schließen, dass die Behandlung mit C3 bot einen starken Einfluss selektiv auf die Morphologie der Apikaldendriten ausübt. Der Mechanismus, der dieser selektiven Empfindlichkeit der Apikaldendriten gegenüber dem C3 bot Toxin zugrunde liegt, wird Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.