La conversion des résidus U en pseudouridine (Y) est la modification la plus fréquente dans les ARN. Cette réaction est catalysée par des ARN:Y-synthases qui fonctionnent soit seules, soit au sein de particules snoRNP H/ACA composées de 4 protéines et d’un snoRNA. Celui-ci assure la reconnaissance de l’ARN cible par appariement de bases. Les pseudouridylations des ARNr eucaryotes sont catalysées par des snoRNP alors que les modifications des ARNt sont catalysées par des enzymes dépourvues de guide. Aucun snoRNA H/ACA n’est décrit chez les Bactéries. Trois équivalents des snoRNA H/ACA (sRNA H/ACA) avaient été découverts chez les Archaea lorsque j’ai débuté ma thèse, mais leur contribution aux modifications des ARNr n’avait pas été démontrée. Nous avons développé une approche bioinformatique permettant l’identification exhaustive de gènes de sRNA H/ACA et de leurs cibles. Nous avons ainsi identifié 7 sRNA H/ACA chez Pyrococcus abyssi et détecté 14 Y dans les ARNr. Nous avons réussi la reconstitution de particules H/ACA actives in vitro, ce qui nous a permis d’étudier leur mode d’assemblage et d’assigner 12 des Y détectées aux 7 sRNA. L’application à d’autres espèces d’archaea de l’approche bioinformatique développée nous a permis d’identifier environ 90 sRNA, nous avons ainsi pu étudier leur évolution. De plus, nous avons expérimentalement démontré pour la première fois qu’un sRNA H/ACA est impliqué dans la modification d’un ARNt. Enfin, nous avons montré que l’enzyme aCBF5 des sRNP H/ACA peut catalyser la pseudouridylation en position 55 des ARNt sans utilisation de sRNA et nous avons identifié des résidus de aCBF5 impliqués dans les activités guidée et/ou non guidée. / The conversion of U into Pseudouridine (Y) residue is the most prevalent RNA modification. This reaction is catalysed either by stand-alone RNA:Y-synthases or by H/ACA snoRNPs composed of 4 proteins and a snoRNA. In snoRNPs the recognition of the U residue is carried out by base-pair interactions between the snoRNA and the RNA target. SnoRNPs are involved in eukaryal rRNA modifications whereas stand-alone RNA:Y-synthase are involved in tRNA and bacterial rRNA modifications. Three counterparts of the H/ACA snoRNAs had been discovered in Archaea when I started my PhD work, but their contribution to rRNA modification was not demonstrated. We developed a computational approach to identify the H/ACA sRNA genes and their rRNA targets. Its application to the Pyrococcus abyssi genome revealed 7 candidate genes. We verified their expression and experimentally identified 14 Y in the P. abyssi rRNAs. We succeeded in the in vitro reconstitution of active H/ACA sRNPs and thereby studied the sRNP assembly mechanism, identified important H/ACA sRNA structural features and assigned 12 of the identified Y residues to the 7 sRNAs. The application of the computational approach to the other archaeal genomes revealed 90 sRNA genes. This repertoire shed new light on the function and the evolution of this ncRNA class. In addition, we experimentally demonstrated for the first time that a few H/ACA sRNAs are involved in tRNA modification. We also showed that the enzyme of the H/ACA sRNP (aCBF5) is involved in Y55 formation in all archaeal tRNAs without the use of an H/ACA sRNA. We compared the guided and non-guided CBF5 activities and identified aminoacids which are important for these activities.

La conversion des résidus U en pseudouridine (?) est la modification la plus fréquente dans les ARN. Cette réaction est catalysée par des ARN:?-synthases qui fonctionnent soit seules, soit au sein de particules snoRNP H/ACA composées de 4 protéines et d’un snoRNA. Nous avons démontré que l’ARN:?-synthase Pus7p de S. cerevisiae est capable d’agir sur les ARNt cytoplasmiques (position 13 dans 10 ARNt et position 35 dans le pré-ARNtTyr contenant un intron) (Behm-Ansmant et al., 2003). En parallèle, j’ai recherché les requis en séquence et en structure pour qu’un ARN soit substrat de Pus7p. J’ai également réalisé une étude préliminaire de l’importance des domaines additionnels de Pus7p par rapport à l’enzyme TruD d’E. coli. Comme les systèmes enzymatiques responsables de la formation de trois résidus ? du snRNA U2 de S. cerevisiae avaient été identifiés, nous avons pu débuter une étude de l’importance fonctionnelle de ces résidus pour la réaction d’épissage en utilisant l’approche globale par puces à ADN que l’équipe de J. Beggs (Edinburgh University) avait mise au point pour S. cerevisiae. Nous avons ainsi observé une baisse de l’efficacité d’épissage de certains ARN pré-messagers lorsque plusieurs gènes codant des U2 snRNA:?-synthases sont inactivés simultanément. L’ARN:?-synthase Pus7p est présente dans les 3 domaines du vivant et en particulier chez les archaea où l’activité de cette enzyme n’avait jamais été étudiée. Nous avons découvert l’existence de 2 systèmes enzymatiques différents pour la modification d’une même position d’un ARNt chez 2 espèces d’archaea thermophiles : une enzyme seule chez Pyrococcus abyssi contre un système de guide sRNP H/ACA chez Sulfolobus solfataricus dans lequel la protéine Pus7 est mutée au niveau d’acides aminés requis pour l’activité. Finalement, nous avons produit chacune de ces enzymes en grandes quantités et nous avons réalisé des tests de cristallisation. Des cristaux de Pus7 de P. abyssi ont été obtenus et une mesure complète de données de diffraction de rayons X a été réalisée au laboratoire à 2,5 Å de résolution. / thesis

L’isomère de l’uridine (U), la pseudouridine (?), est le nucléoside le plus fréquemment rencontré dans les ARN. La réaction de pseudouridylation dans les ARN est catalysée par des ARN:?-synthases qui, soit fonctionnent comme des enzymes protéiques, soit sont portées chez les eucaryotes et les archaea par des particules ribonucléoprotéiques (RNP). Chaque RNP est composée d’un RNA guide dit à boîtes H/ACA (sno/sca/sRNA chez les eucaryotes et sRNA chez les archaea) et d’un ensemble invariable de protéines : l’enzyme ARN:?-synthase Dyskérine/aCBF5 et les 3 protéines NOP10/aNOP10, GAR1/aGAR1 et NHP2/L7Ae. L’ARN guide assure la reconnaissance de l’ARN cible à modifier par appariement de bases. Les sRNA H/ACA identifiés chez l’archae Pyrococcus abyssi ont servi de modèles pour des études de structure-fonction basées sur i) la mesure de l’activité de sRNP H/ACA reconstituées avec les composants protéiques et nucléiques purifiés, ii) l’analyse de la structure 2D des ARN au sein des RNP par des sondes chimiques et enzymatiques et par dichroïsme circulaire, iii) les diverses structures 3D disponibles. Les déterminants moléculaires présents sur les ARN guides ont été précisés, ainsi que le rôle fonctionnel des différentes protéines, de leurs domaines structuraux et de résidus conservés. Nous montrons que l’association entre aNOP10 et L7Ae est cruciale pour l’activité des RNP. Nous avons identifié que aCBF5 pouvait catalyser la formation des résidus ?55 dans les ARNt et ?2603 dans l’ARN 23S sans l’intervention de sRNA. Nous avons étudié le rôle de résidus conservés de aNOP10 ainsi que du site actif et de la boucle ß7/ß10 de aCBF5 dans les activités guidée et non guidée de aCBF5. / Pseudouridine (?), uridine’s isomer, is the most abundant modified nucleoside found in structured RNAs. The reaction of pseudouridylation is either catalyzed by a limited number of standalone RNA:?-synthases, or in eukaryotes and archaea by multiple ribonucleoprotein particles (the so-called, box H/ACA sno/sca/sRNPs). Each RNP is composed of a specific box H/ACA RNA used as a guide to define the U residue for modification, and a common set of four proteins– the RNA:?-synthase Dyskerin/aCBF5, and the auxiliary proteins NOP10/aNOP10, GAR1/aGAR1, NHP2/L7Ae (respectively in human and archaea). Initially, 7 guide RNAs were identified in the archaeon P. abyssi, which were used as models for structure-function analyses. Activities of RNPs reconstituted with purified protein and RNA components were measured; RNA 2D structure within RNPs was investigated by chemical and enzymatic probing assays as well as by circular dichroism. By taking into consideration the various 3D structures recently resolved, we were able to pinpoint the RNA molecular determinants and to clarify the role played by each protein, their domains, and some of their conserved residues. Hence, interaction between aNOP10 and L7Ae was found to be crucial for RNP activity. Moreover, we show that the enzyme aCBF5 catalyzes pseudouridylation at the position 55 in tRNAs and the position 2603 in 23S rRNA without the use of any guide sRNA. The role of residues conserved in aNOP10, and in the active site and the ß7/ß10 loop of aCBF5 for the RNA and non-RNA guided activities were analyzed.

Les enzymes de réparation de l'ADN sont des facteurs essentiels pour assurer l'intégrité du génome. Ainsi, la compréhension de la dynamique de leurs mécanismes d'interaction est capitale. NucS est une nucléase récemment découverte chez l'archée Pyrococcus abyssi, qui interagit avec des structures branchées de l'ADN à simple brin libre, appelées flaps. Sa caractérisation biochimique a mis en évidence une affinité nanomolaire pour l'ADN simple brin, avec l'existence de deux sites de liaison (site I et II) ainsi qu'une activité bidirectionnelle caractérisée par la capacité à cliver les flaps 5' et 3'. Les mécanismes qui sont à l'origine de cette activité, notamment ses modalités de chargement, de localisation et de dissociation, restent toutefois peu connus. Afin de sonder la dynamique des interactions de NucS avec son substrat, nous avons mis en place un microscope à illumination en onde évanescente permettant la détection et le suivi des événements d'interaction individuels entre la protéine marquée avec un fluorophore et un substrat d'ADN attaché à la surface. Nous avons ensuite développé une nouvelle technique de colocalisation qui permet de positionner une protéine individuelle par rapport à son substrat avec une précision de 50 nm pour des durées arbitraires. Nous avons alors étudié la cinétique d'association et de dissociation des complexes NucS-ADN individuels afin de résoudre les mécanismes qui régulent l'activité de l'enzyme dans différentes conditions. Dans des conditions où le clivage est inhibé, nous avons montré que l'association était dépendante du site I, bidirectionnelle et symétrique pour les flaps 3' et 5' et que la dissociation était orientée avec une affinité supérieure pour les flap 5'. Nous avons également montré que la dissociation suivait une cinétique du premier ordre indépendante de la diffusion de NucS sur le flap. Ceci indique que, dans ces conditions non clivantes, NucS s'associe et/ou se dissocie à des positions arbitraires sur le flap. Par la suite, nous avons étudié la cinétique d'association et de dissociation du complexe NucS-ADN à 45 ◦ C en présence du cofacteur de la réparation PCNA. Nous avons démontré que PCNA augmente la vitesse d'association de NucS avec les substrats 3' et 5'. Ceci indique que PCNA agit comme une plateforme qui facilite la reconnaissance de la lésion, avec un chargement ciblé de NucS à la jonction. De plus, nous avons montré que PCNA déstabilise le complexe NucS-ADN, vraisemblablement en exerçant une force pour plier l'ADN afin d'amener l'extrémité du flap vers le site II. Dans le cas de flaps 5', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme en deux étapes, qui est indépendant de la longueur du flap. Ceci nous a permis de proposer un modèle où NucS se charge par son site I directement à la jonction, courbe le substrat pour capturer l'extrémité simple brin par le site II pour le cliver. Dans le cas d'un flap 3', nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme du premier ordre ce qui est probablement dû à la rapidité de la seconde étape dans le mécanisme proposé pour les flaps 5'. Nos résultats constituent ainsi une nouvelle contribution à la caractérisation intramoléculaire des interactions NucS-ADN. Les méthodes que nous avons développées constituent en outre un moyen original pour sonder la cinétique des interactions entre biomolécules et pourront être appliquées à de multiples systèmes.

La pseudouridylation, l'isomérisation du résidu urine (U) en pseudouridine ([PSI]) est la modification post-transcriptionnelle la plus fréquemment retrouvée dans les ARN. Elle est catalysée par une enzyme ARN:PSI-synthase. Chez les archées et les eucaryotes, cette activité est également portée par des particules ribonucléoprotéiques à boîtes H/ACA (RNP H/ACA). Chez les archées, le complexe comprend quatre protéines invariables dont l'ARN:PSI-synthase aCBF5 et trois protéines partenaires L7Ae, aNOP10 et aGAR1, ainsi qu'un ARN guide qui cible par appariement de bases la position de l'uridine à modifier de l'ARN substrat. Le rôle des partenaires a pu être identifié par des analyses structure-fonction basées sur des approches biochimiques, biophysiques et radiocristallographiques. Au cours de ce travail, nous avons démontré l'existence de disparités fonctionnelles entre les ARN guides d'un même organisme, et l'importance de l'interaction entre L7Ae et aNOP10 pour le positionnement correct de l'ARN substrat. Nous avons testé in vitro l'assemblage et l'activité de particules reconstituées en présence d'ARN guides non conventionnels. L'étude sur la dynamique de l'ARN substrat lors de la pseudouridylation a également été abordée et a permis de déterminer que aGAR1 n'était pas nécessaire pour le mécanisme de turnover de la particule, que la température jouait un rôle crucial pour cette activité, et que la nature du nucléotide cible ainsi que la longueur de l'ARN substrat étaient des éléments importants pour la sélection de cet ARN. Nous avons également mis au point une nouvelle technique basée sur le phénomène de FRET permettant de suivre l'association de l'ARN substrat à la RNP H/ACA / Pseudouridylation reaction that consists in the isomerization of uridines (U) into pseudouridines (PSI) is the most frequent post-transcriptional modification found in RNAs. It is catalyzed by enzymes with RNA:PSI-synthase activity. In Archaea and Eukarya, ribonucleoprotein particles, the so-called box H/ACA RNPs, possess such activity. In Archaea, the box H/ACA complex comprises four invariable proteins namely the RNA:PSI-synthase aCBF5 and three protein partners L7Ae, aNOP10 and aGAR1, and specific to each RNP, an RNA acting as a guide to secure by base pairing the RNA substrate and define the position to be modify. During these last years, several crystal structures of components of archaeal H/ACA RNP and fully assembled RNP have been resolved. Complementary biochemical and biophysical studies allowed detailed structure-function analyses to identify the role of the different components. During this work we identified functional differences between two RNA guides expressed in the same archaea, and demonstrated that the interaction between L7Ae and aNOP10 is important for a correct positioning of substrate RNA. We also tested in vitro the assembly and activity of RNP reconstituted on H/ACA-like guide RNAs. We investigated dynamics of substrate RNA during the pseudouridylation. We found that aGAR1 was not necessary for the turnover of the particle, that the temperature was crucial for such activity, and that the chemical structure of the targeted residue and length of the substrate RNA were important determinants for substrate selectivity. Finally, we have also developed a new technic based on FRET adapted to monitor binding of the susbtrate RNA to the box H/ACA RNP enzyme