Les pyrrolamides constituent une famille de produits naturels dotés de diverses activités biologiques et synthétisés par des actinobactéries. La congocidine et la distamycine, les molécules les plus connues de cette famille, sont capables de se lier à l'ADN de façon non covalente selon une certaine spécificité de séquence (succession de 4 paires de base A/T). Récemment, les gènes et la voie de biosynthèse de la congocidine ont été identifiés et caractérisés chez S. ambofaciens. Ceci a révélé un mécanisme original impliquant notamment de nouvelles enzymes et de nouvelles voies pour la biosynthèse des trois précurseurs nécessaires à l’assemblage de la congocidine. Nous avons entrepris d’étudier la régulation de la biosynthèse de la congocidine chez S. ambofaciens et d’isoler et de caractériser les groupes de gènes de biosynthèse de deux autres pyrrolamides, la distamycine et les pyrronamycines (produites respectivement par S distallicus et un streptomyces non caractérisé). L'objectif de cette étude est, dans un premier temps, d’améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués lors de la biosynthèse de ces molécules (comme le mécanisme d’incorporation des pyrroles) et, par la suite, de manipuler les gènes identifiés pour synthétiser de nouvelles molécules pyrrolamides hybrides. / Pyrrolamides constitute a family of natural products with various biological activities, synthesized by actinobacteria. Congocidine (also called netropsin) and distamycin are the best characterized pyrrolamides, largely studied due to their ability to bind into the minor groove of the DNA double helix in a sequence specific manner (succession of four A/T bases). Recently, the congocidine biosynthetic pathway has been characterized in Streptomyces ambofaciens. We showed that an iterative Non Ribosomal Peptide Synthetase with an unusual architecture assembles congocidine, using precursors with undocumented biosynthetic pathways. With the aim of developing a combinatorial biosynthesis approach for the development of new pyrrolamides, we undertook the study of the regulation of congocidine biosynthesis in S. ambofaciens and the isolation of the distamycin and pyrronamycins biosynthetic gene clusters. Characterization of these clusters will result in a more detailed understanding of pyrrolamide biosynthesis (e.g. mechanism of pyrrole polymerization), and provide new tools (enzymes) and building blocks (precursors) necessary for combinatorial biosynthesis.

Depuis plus de 80 ans, le métabolisme spécialisé nous fournit de nombreuses molécules utilisées en médecine, en particulier comme anti-infectieux. Aujourd’hui, avec l’augmentation mondiale de la résistance aux antimicrobiens, de nouveaux antibiotiques sont indispensables. Une des réponses à cette pénurie grave pourrait provenir de la biologie synthétique. Dans le domaine du métabolisme spécialisé, la biologie synthétique est utilisée en particulier pour la biosynthèse de métabolites non naturels. Parmi les métabolites spécialisés, les peptides non ribosomiques constituent une cible attrayante, car ils nous ont déjà fourni des molécules à haute valeur clinique (ex. les antibiotiques vancomycine et daptomycine). De plus, la plupart sont synthétisés par des enzymes multimodulaires appelées synthétases de peptides non ribosomiques (NRPS), et sont diversifiés davantage par des enzymes de décoration. Ainsi, ces voies de biosynthèse se prêtent particulièrement à la biosynthèse combinatoire, consistant à combiner des gènes de biosynthèse provenant de divers groupes de gènes ou, dans le cas des NRPS, à combiner des modules ou domaines pour créer de nouvelles enzymes. Cependant, si plusieurs études ont établi la faisabilité de telles approches, de nombreux obstacles subsistent avant que les approches combinatoires de biosynthèse soient totalement efficaces pour la synthèse de nouveaux métabolites. Les travaux présentés ici s’inscrivent dans le cadre d’un projet visant à comprendre les facteurs limitant les approches de biosynthèse combinatoire basées sur les NRPS, en utilisant une approche de biologie synthétique. Nous avons choisi de travailler avec les NRPS responsables de la biosynthèse des pyrrolamides. En effet, ces NRPS sont constitués uniquement de modules et de domaines autonomes, et donc particulièrement adaptés aux manipulations génétiques et biochimiques. La caractérisation du groupe de gènes de biosynthèse du pyrrolamide anthelvencine constitue la première partie de cette thèse et nous a fourni de nouveaux gènes pour notre étude. La deuxième partie a consisté à construire de vecteurs intégratifs modulaires, outils essentiels pour la construction et l’assemblage de cassettes génétiques. La dernière partie présente la reconstruction du groupe de gènes du pyrrolamide congocidine, basée sur la construction et l’assemblage de cassettes de gènes synthétiques. Dans l’ensemble, ces travaux ouvrent la voie à de futures expériences de biosynthèse combinatoire, expériences qui devraient contribuer à une meilleure compréhension du fonctionnement précis des NRPS. / For more than 80 years, specialized metabolism has provided us with many molecules used in medicine, especially as anti-infectives. Yet today, with the rise of antimicrobial resistance worldwide, new antibiotics are crucially needed. One of the answers to this serious shortage could arise from synthetic biology. In the field of specialized metabolism, synthetic biology is used in particular to biosynthesize unnatural metabolites. Among specialized metabolites, non-ribosomal peptides constitute an attractive target as they have already provided us with clinically valuable molecules (e.g. the vancomycin and daptomycin antibiotics). In addition, most are synthesized by multimodular enzymes called non-ribosomal peptide synthetases (NRPS) and further diversified by tailoring enzymes. Thus, such biosynthetic pathways are particularly amenable to combinatorial biosynthesis, which consists in combining biosynthetic genes coming from various gene clusters or, in the case of NRPSs, combining modules or domains to create a new enzyme. Yet, if several studies have established the feasibility of such approaches, many obstacles remain before combinatorial biosynthesis approaches are fully effective for the synthesis of new metabolites. The work presented here is part of a project aiming at understanding the limiting factors impeding NRPS-based combinatorial biosynthesis approaches, using a synthetic biology approach. We chose to work with the NRPSs involved in the biosynthesis of pyrrolamides. Indeed, these NRPS are solely constituted of stand-alone modules and domains, and thus, particularly amenable to genetic and biochemical manipulations. The characterization of the biosynthetic gene cluster of the pyrrolamide anthelvencin constitutes the first part of this thesis, and provided us with new genes for our study. The second part involved the construction of modular integrative vectors, essential tools for the construction and assembly of gene cassettes. The final part presents the successful refactoring of the congocidine pyrrolamide gene cluster, based on the construction and assembly of synthetic gene cassettes. Altogether, this work paves the way for future combinatorial biosynthesis experiments that should help deciphering the detailed functioning of NRPSs.