En aquesta tesi doctoral, s’ha desenvolupat metodologia analítica per a la purificació, separació i caracterització de prió cel•lular (PrPC) i superòxid dismutasa (SOD-1), dues proteïnes relacionades amb les Encefalopaties Espongiformes Transmissibles (TSEs) i l’Esclerosi Lateral Amiotròfica (ALS), respectivament. Les TSEs es caracteritzen per l’acumulació de la forma patològica del PrPC (PrPSc) al cervell dels animals afectats, mentre que a l’ALS s’observa la formació d’agregats de SOD-1. Avui dia, encara es desconeixen els factors que inicien i regulen les interaccions que condueixen a la formació d’agregats proteics en moltes malalties neurodegeneratives. Alguns autors suggereixen mecanismes basats en els canvis estructurals que s’observen entre la proteïna nativa i la patològica, que estan relacionats amb la conformació, la seqüència d’aminoàcids, els metalls o les modificacions post-transduccionals. En proteïnes oligomèriques com la SOD-1, també s’ha considerat la dissociació dels oligòmers fins a monòmers abans de l’agregació. És doncs necessari millorar el coneixement de l’estructura d’aquestes proteïnes i aprofundir en els mecanismes que governen l’agregació. En aquest treball es proposa una estratègia de purificació per recuperar de manera eficient PrPC de cervell boví emprant mètodes de purificació convencionals no immuniquímics i western blot (WB) per detectar la presència PrPC en les diferents etapes. Tot seguit s’estudia exhaustivament la separació i caracterització de la SOD-1 mitjançant electroforesi capil•lar acoblada a l’espectrometria de masses amb analitzadors de trampa iònica i de temps de vol (CE-IT-MS i CE-TOF-MS), espectrometria de masses amb font d’ionització per desorció amb làser assistida per una matriu i analitzador de temps de vol (MALDI-TOF-MS) i espectrometria de masses de mobilitat iònica amb font d’ionització per nano-electrosprai (n-ESI-IM-MS). Els estudis amb SOD-1 purificada a partir de mostres de sang d’individus sans i pacients amb ALS han permès obtenir algunes conclusions preliminars interessants sobre els canvis estructurals en la proteïna associats a la malaltia. / In this thesis, we developed an analytical method for the purification, separation and characterization of cellular prion (PrPC) and superoxide dismutase (SOD-1), two proteins related to Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs) and the Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), respectively. The TSEs are characterized by the accumulation of the pathological form of PrPC (PrPSc) in the brain of affected animals, whereas in ALS it is observed the formation of aggregates of SOD-1. Today, factors that initiate and regulate the interactions that lead to the formation of protein aggregates in many neurodegenerative diseases are still unknown. Some authors suggest mechanisms based on the structural changes observed between the native and the pathology protein which cold be related with the conformation, the amino acid sequence, metals or post-translational modifications. In oligomeric proteins such as SOD-1, the dissociation of oligomers to monomers before aggregation it is also considered. So, it is crucial to increase the knowledge of the structure of these proteins and the mechanisms that govern its aggregation for understanding the disease development. This paper proposes a strategy for having an efficient recovery in the purification of bovine brain PrPC using conventional purification methods that not involves immunochemical procedures. The presence of PrPC was checked at different stages by western blot (WB). Then, the separation and characterization of the SOD-1 by capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry with ion trap and time of flight analyzers (CE-IT-MS and CE-TOF-MS), matrix-assisted laser desorption/ionization with a time of flight mass analyzer (MALDI-TOF-MS) and ion mobility mass spectrometry with power nano-electrospray ionization source (n-ESI-IM-MS) was studied. The comparison of purified SOD-1 from blood samples of healthy individuals and patients with ALS have yielded some preliminary interesting conclusions about structural changes in the protein associated with cold be related with the disease.

Tesi realitzada al Departament de Química Ambiental de l'IDAEA – CSIC / En esta Tesis se han realizado diversos estudios relacionados con la presencia de dioxinas y bifenilos policlorados en el ámbito de la gestión de residuos y la problemática ambiental que de ello se deriva. Para poder llevar a cabo las tareas incluidas en los diferentes proyectos ha sido preciso incidir en algunos aspectos relacionados directamente con la metodología analítica empleada en la determinación de estas sustancias. A modo de resumen, se ha actualizado la metodología analítica de PCDD/Fs y dl- PCBs utilizada anteriormente en nuestro laboratorio, con el objetivo de disponer de un procedimiento que nos permitiera analizar ambas familias de compuestos en fracciones separadas y en el caso de los dl-PCBs en un único análisis instrumental. Asimismo, ha sido posible realizar un estudio de validación de esta metodología analítica y determinar la incertidumbre de los resultados obtenidos en muestras ambientales objeto de estudio. Esta metodología analítica ha permitido caracterizar fangos procedentes de plantas de tratamiento de aguas residuales para su eventual aplicación en suelos agrícolas, de acuerdo a directrices y criterios sujetos a un marco regulatorio europeo, habiéndose observado que en la mayoría de los casos se cumplían los requisitos en cuanto a presencia de dioxinas y furanos. Se han determinado los niveles de estos contaminantes en muestras de suelo de una zona de gran impacto industrial (Campo de Gibraltar), como parte de un estudio multidisciplinario llevado a cabo en esta zona, que ha permitido descartar la influencia de las PCDD/Fs en la elevada incidencia de enfermedades cancerígenas diagnosticada entre los habitantes residentes dentro del área de influencia. Por último, se ha realizado un programa de vigilancia ambiental en Cataluña que nos ha permitido conocer los niveles de PCDD/Fs en muestras de aire ambiente, observándose un descenso promedio del 70% entre los años 1997 y 2004. Como aspecto novedoso cabe señalar la introducción de manera exitosa de un captador de aire ambiente direccional para el estudio de estos contaminantes en la atmósfera. / In this thesis various studies have been conducted about the presence of dioxins and PCBs in the field of waste management and environment. In the same way, some aspects related to the analytical methodology for the determination of PCDD/Fs and dl-PCBs in environmental samples have been studied. In summary, the analytical methodology of PCDD/Fs and dl-PCBs previously used in our laboratory has been updated, in order to have a procedure to analyze both families of compounds in separated fractions and dl-PCBs in a unique instrumental analysis. Also, it has been possible to validate the analytical method and determine its uncertainty in environmental samples. PCDD/F have been analyzed in sludges from wastewater treatment plants prone to be used as fertilizers in agricultural soils, noting that in most cases the PCDD/F concentrations determined in these samples met the requirements stated in the European regulatory framework. On the other hand, the levels of these contaminants in soil samples from an area with a high industrial impact (Campo de Gibraltar), have been determined as part of a multidisciplinary study carried out in this zone, which has made it possible to rule out the influence of the PCDD/Fs in the high incidence of cancer diseases diagnosed among the resident inhabitants within the area of influence. Finally, an environmental monitoring program has been carried out in Catalonia to determine the levels of PCDD/Fs in ambient air samples, observing an average decline of 70% between 1997 and 2004. To conclude, a novel directional ambient air sampler has been successfully evaluated for the determination of PCDD/Fs and dl-PCBs in the atmosphere.

El objetivo principal de la Tesis ha sido profundizar en el conocimiento de la complejación de metales por ligandos de S y Se. Se ha dedicado una atención especial a las fitoquelatinas (PCn), que son la base de la fitorremediación, por su capacidad de complejar los metales pesados. Se ha intentado conocer los complejos formados, mediante experimentos realizados con diferentes técnicas analíticas. En una primera fase, el trabajo se centra en el uso de la polarografia de impulsos diferencial (DPP) asistida con el método quimiométrico de Resolución Multivariante de Curvas por Mínimos Cuadrados Alternados (MCR-ALS) para resolver las mezclas de péptidos presentes en plantas (fitoquelatinas y sus fragmentos) y Cd2+. Los resultados obtenidos se han comparado con los obtenidos por la espectrometría de masas (ESI-MS). El siguiente objetivo fue estudiar la fitoquelatina PC5, en presencia de los iones Cd2+ y Pb2+. El mayor tamaño de este péptido, respecto a otras PCn estudiadas anteriormente, podria implicar a priori modelos de complejación competitiva más complejos. Por ello, se planteó un estudio sistemático basado en una combinación del análisis quimiométrico (mediante MCR-ALS y los nuevos algoritmos pHfit y GPA) de las medidas por DPP y Dicroísmo Circular (CD), y ESI-MS. El tercer objetivo fue estudiar la selenocistina (SeCyst), en diversas situaciones de complejación competitiva. El comportamiento electrónico de SeCyst sola o en presencia de un ion metálico (Bi3+, Cd2+, Co2+, Cu2+ , Cr3+ , Ni2+ , Pb2+ y Zn2+) fue estudiado por DPP en un amplio intervalo de pH. Se han realizado también estudios por Valoración Isotérmica Calorimétrica (ITC) a pH fisiológico (7.4) que además, permitieron obtener parámetros termodinámicos y constante de complejación. En un estudio más detallado, se seleccionó el Cd2+ como modelo para comportamiento de SeCyst en la presencia de un metal no esencial, en cambio, se eligió el Zn2+ para el caso de un elemento esencial. Además, se estudiaran mezclas de SeCyst y el glutatión (GSH) en presencia de Cd2+ a pH fisiológico. Un último objetivo consistió en evaluar la posible utilización de electrodos modificados para la detección de tioles. En una estancia en la Universidad de Oxford, se llevaron a cabo estudios de modificación de dos tipos de electrodos de carbono: el de carbono vitrificado (GCE) y el de grafito pirolítico “edge plane pyrolytic graphite” (EPPG), inmovilizando en sus superficies un centro metálico redox (derivados del Ferroceno, Fc). Finalmente, se estudió su respuesta catalítica en presencia de Cys. / The main goal of the Thesis has been to deepen the knowledge about metal complexation by ligands containing S and Se. A special attention has been paid to phytochelatins (PCn), which are on the basis of phytoremediation due to their ability to complex heavy metals. The formed complexes have been studied by means of different analytical techniques. In a first step, the work is focused on the use of Differential Pulse Polarography (DPP), assisted by Multivariate Curve Resolution by Alternating Least Squares (MCR-ALS), in order to resolve the mixtures of peptides present in plants (phytochelatins and their fragments) and Cd2+. The obtained results have been compared with those by mass spectrometry (ESI-MS). The next goal has been the study of the phytochelatin PC5 in the presence of Cd2+ and Pb2+. The bigger size of this PCn as compared to other previously studied could imply a priori more complicated models of competitive complexation. Then, a systematic study was devised based on the combination of chemometric analysis (by means of MCR-ALS and the new algorithms pHfit and GPA) of the data obtained by DPP and circular dichroism, and ESI-MS. A third goal has been the study of selenocystine (SeCyst) in different situations of competitive complexation. The electrochemical behaviour of SeCyst alone or in the presence of a metal ion (Bi3+, Cd2+, Co2+, Cu2+, Cr3+, Ni2+, Pb2+ and Zn2+) has been studied by DPP in a wide pH range. Studies by isothermal titration calorimetry (ITC) have also been made, which have provided thermodynamic parameters and complexation constants. In a more detailed study, Cd2+ and Zn2+ ions have been selected as models of non-essential and essential metal, respectively, in order to study their behaviour in the presence of SeCyst. Mixtures of SeCyst and glutathione have been also studied in the presence of Cd2+ at physiological pH. The last goal has been to evaluate the possible use of modified electrodes for the detection of thiols. During a stay in the University of Oxford, several studies were carried out on the modification of two kinds of carbon electrode: glassy carbon (GCE) and edge plane pyrolitic graphite (EPPG). The modification consisted on the immobilisation of a metallic redox center (a ferrocene derivative) onto the surface. Then, the catalytic responses in the presence of Cys have been studied.

La progresiva destrucción de la capa de ozono unida a los largos periodos de exposición solar, principalmente en actividades de ocio, ha contribuido a una mayor incidencia de las enfermedades causadas por la radiación solar, principalmente el cáncer de piel. Hoy en día, los compuestos orgánicos que actúan de pantalla frente a la radiación solar ultravioleta (filtros solares, UV-F) se utilizan cada vez con más frecuencia y en mayor cantidad dada la concienciación actual que existe con respecto a los efectos perjudiciales de la radiación solar. Aunque tradicionalmente se han usado en productos bronceadores con este fin, actualmente se están añadiendo a otros productos cosméticos para evitar que componentes sensibles a la radiación solar se descompongan, así como en otros productos como detergentes líquidos, plásticos, papel, pinturas, textiles, etc. Los UV-F acceden al medio acuático por vía directa, a través de actividades acuáticas (baño, natación) y principalmente por vía indirecta a través de las estaciones de tratamiento de aguas residuales urbanas (EDARs), después de haber sido transferidos del cuerpo a la vestimenta, por la excreción después de su absorción dérmica, y a través de las aguas residuales industriales. Dada la elevada proporción de estos aditivos que se utiliza en las formulaciones y su frecuente uso, la cantidad de UV-F que se descarga en el medio ambiente es importante. Actualmente, uno de los mayores retos en el estudio ambiental de los UV-F es disponer de métodos de análisis lo suficientemente sensibles para poder evaluar la presencia de tales compuestos, sus metabolitos y otros productos de transformación en el sistema agua/sedimento/biota, en conexión con su grado de eliminación en los tratamientos de aguas residuales. Esta Tesis Doctoral aporta herramientas y conocimiento para ampliar la información disponible sobre el impacto ambiental de los filtros solares orgánicos (presencia, destino y degradación). En esta memoria de Tesis se describe el desarrollo de nuevas metodologías analíticas basadas en la cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para el análisis de UV-F y sus principales productos de transformación, compuestos hasta el momento escasamente investigados. Se incluye el desarrollo y validación de un método analítico completamente automatizado, basado en la extracción en fase sólida (SPE) on-line acoplada a LC-MS/MS, para el análisis de aguas, así como otras metodologías basadas en la extracción con líquidos presurizados (PLE) y posterior análisis mediante LC-MS/MS para diferentes matrices ambientales sólidas como lodos de EDAR, sedimentos o peces. Estas metodologías se han aplicado en diferentes estudios para investigar la presencia y distribución de UV-F en muestras reales de aguas naturales, aguas residuales, sedimentos y lodos de EDAR. También se aportan nuevos datos sobre la bioacumulación de estos compuestos; se han analizado diferentes especies de peces de diversas cuencas hidrográficas de régimen mediterráneo así como también muestras de mamíferos marinos (delfines) de la costa de Brasil. Teniendo en cuenta que se ha comprobado que los procesos biológicos convencionales que se aplican en las EDARs no son efectivos para la eliminación de los UV-F, se han estudiado nuevos tratamientos, eficientes y respetuosos con el medio ambiente, para su degradación en fase líquida y sólida. Concretamente se ha investigado la biodegradación mediante el hongo Trametes versicolor, obteniendo resultados muy satisfactorios. También, se ha estudiado la degradación de estos compuestos mediante procesos de oxidación avanzada, en concreto, la ozonización y su combinación con peróxido de hidrógeno obteniendo una gran eficacia en sus eliminaciones. En todos los estudios de degradación se hizo especial hincapié en la identificación de los productos de transformación formados en los procesos mediante la aplicación de la espectrometría de masas de alta resolución. / UV filters (UV-F), have become very popular chemicals since they were shown to have a protective role against photoaging, photocarcinogenesis and photoimmunosupression promoted by UV sun radiation. UV-F are increasingly used in personal care products such as sunscreen products, beauty creams, lipsticks, hair sprays, shampoos, etc. Despite they are traditionally used in cosmetics last years they have been also widely added in formulations of other products to protect the components, for instance in paints, textiles, paper, plastics, etc. UV-F are recent emerging environmental pollutants for which there is currently a lack of knowledge about their occurrence, fate and effects on the ecosystems. UV-F enter the environment through two principal sources: direct inputs from recreational activities and indirect wastewater input. The presence of these compounds in the aquatic ecosystem raises environmental concern since most of them are known to display endocrine disruption activity. This Thesis focuses on the development of analytical methodology for the determination of organic UV-F in water, sediment, sewage sludge and biota based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The developed tools allowed the detection of these compounds in complex environmental matrices and contributed to have a broader view on the presence and distribution of these compounds in the aquatic ecosystem. These methods were successfully applied to investigate the occurrence of selected UV filters in groundwater, river water, wastewater, sediment, sewage sludge, fish and marine mammals (dolphins). Moreover, this Thesis focuses on the research of new processes, sustainable and environmentally friendly, for the degradation of UV-F in wastewater and sewage sludge. Specifically, photodegradation, fungal biodegradation and advanced oxidation processes (ozonation and peroxone oxidation) were investigated. The identification of new transformation products formed during these treatments using non-target analysis based on high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (HPLC-HRMS) has been other main aim of this research.

Los retardantes de llama son compuestos químicos que tienen como función disminuir la flamabilidad de gran cantidad de productos de consumo habitual. El grupo más importante lo constituyen los retardantes de llama bromados (BFRs), los cuales son utilizados en plásticos, textiles y productos electrónicos. Los BFRs incluyen los siguientes compuestos: polibromodifeniléteres (PBDEs), hexabromociclododecano (HBCD) y tetrabromobisfenol A (TBBPA). El uso de HBCD ha ido en aumento en los últimos años, pues se utiliza como substituyente de otras formulaciones de BFRs, principalmente PBDEs que han sido prohibidos en Europa: penta, octa y deca-BDE. El HBCD se utiliza principalmente como retardante de llama en espumas de poliestireno, textiles y equipamiento electrónico domestico. En esta tesis se han estudiado los BFRs anteriormente señalados, además de otros retardantes de llama, tanto del tipo bromado como clorado, entre los cuales destaca el declorane plus. Inicialmente optimizamos metodologías de análisis utilizando la cromatografía de líquidos acoplada a la espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). El primer método desarrollado fue para el análisis de los diastereoisómeros de HBCD, en el cual, simultáneamente, se analiza también otro retardante de llama, el TBBPA, así como sus compuestos relacionados. Otro método que desarrollamos permite la detección de enantiómeros del HBCD y el cálculo de las respectivas fracciones enantioméricas (EF) en muestras ambientales. Este método se basa en el uso de una columna quiral, la cual permite una buena separación de los distintos enantiómeros del HBCD ((±) α, (±) β y (±) γ) en menos de 15 minutos. Es importante señalar que también hemos realizado el análisis de otros retardantes de llama emergentes utilizando la cromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas por baja resolución (GC-LRMS) y por alta resolución (GC-HRMS), estas metodologías habían sido optimizadas previamente en nuestro laboratorio. Luego de la optimización de las metodologías analíticas, hemos determinado la presencia de retardantes de llamas en las distintas muestras. Por ejemplo, realizamos un estudio de acumulación-depuración de HBCD en pez zebra el que indica que la depuración de los isómeros β y γ es más rápida que la del isómero α. Este hecho podría justificar en parte la diferente distribución isomérica entre muestras ambientales y biota. También analizamos muestras de leche materna de madres de La Coruña, donde se encontraron valores importantes de HBCD, generalmente del isómero γ-HBCD. Además realizamos la determinación enantiomérica observándose un comportamiento enantiómero específico. El declorane plus lo analizamos en huevos de halcón peregrino de España y Canadá, en las muestras de Norteamérica observamos una mayor concentración debido a que este retardante de llama se ha producido por más de 40 años en las cercanías de los Grandes Lagos canadienses. En estas muestras también encontramos HBCD y PBDEs, además de otros compuestos emergentes. Así hemos observado que el HBCD está presente en muestras biológicas y humanas, demostrando su biodisponibilidad que puede ser isómero y enantiómero específica. También nos hemos enfrentado a la necesidad de contar con estudios toxicológicos del HBCD por isómeros y enantiómeros. Paralelamente al desarrollo de esta tesis se han llevado a cabo otros estudios sobre el HBCD, los que han permitido proponer al HBCD como candidato a ser incluido como sustancia prioritaria por la Convención de Estocolmo. Respecto al declorane plus hemos observado que tiene un comportamiento similar a HBCD y PBDEs, siendo biodisponible y bioacumulable en huevos de halcón peregrino. Finalmente, creemos que es necesario realizar estudios toxicológicos de los isómeros syn- y anti- del declorane plus, que hasta el momento no se han llevado a cabo. / In recent years chemical pollution research has focused on the study of pollutants that pose a risk to human and/or environmental health due to their toxicity, high persistence in environment and bioaccumulatioin properties. One issue with these substances, including the halogenated flame retardants (HFRs) is that they are continually introduced into the environment from industrial production, use in various consumer products, and releases during recycling and/or disposal. In recent decades, studies on HFRs, particularly on polybrominatedbiphenyl ethers (PBDEs), have increased worldwide, mainly due to their persistence and presence in various matrices. Currently, two of the PBDEs technical products (PentaPBDE and OctaBDE) are being eliminated or have been banned in North America and Europe, while DecaBDE has been banned in Europe. In U.S. DecaBDE production, import and sale will be discontinued in late 2013. After consumption and production decline of PBDEs, other flame retardants are used increasingly to replace them. The Environmental Forum of the Bromine Science (BSEF) of 2001 indicated that the use of HFRs was led by tetrabromobisphenol A (TBBPA) (59%), and that hexabromocyclododecane (HBCD) also showed an increase in use worldwide. Therefore, it is important to develop evaluation studies of environmental risk for these substances. This requires detailed information about their presence, fate and transformation in the environment, in order to evaluate the possible exposure of humans and other organisms to these compounds. To achieve this information, the first essential step is to have reliable analytical methods sensitive enough to determine environmental levels. At the beginning of my thesis “Analysis of emerging halogenated flame retardants and its impact on the environment and humans” in 2006, research groups involved in the issue of HFRs started with the optimization of methods for analysis of hexabromocyclododecane (HBCD) in environmental matrices. Once the scientific community has provided sufficient data on presence, fate, behavior and toxicity of these compounds, we can evaluate whether it is advisable to continue using these HFRs or if, on the contrary, these new emerging HFRs are also detrimental enough to environmental and/or human health that they should also be banned, as were their PBDEs predecessors.

La cromatografia de líquids d'alta eficàcia (HPLC) és la tècnica de separació més àmpliament utilitzada, degut a la seva sensibilitat, exactitud de les determinacions quantitatives i aplicabilitat a anàlits no volàtils o termolàbils d'interès científic i industrial. L'electroforesi capil·lar juga un paper fonamental en bioquímica. Aquesta tècnica permet obtenir anàlisis ràpides amb una elevada resolució i un baix consum de reactius auxiliars, fet que minimitza la generació de residus. L'objectiu principal d'aquesta tesi doctoral en relació a la cromatografia de líquids ha residit en l'establiment d'un model que expliqui la variació del pH en fases mòbils hidroorgàniques en funció de la fracció del solvent orgànic. El pH de la fase mòbil condiciona el grau d'ionització dels anàlits amb propietats àcid/base, i en funció d'aquesta ionització es produeixen variacions significatives en la retenció cromatogràfica dels anàlits, que poden afectar notablement la selectivitat. Aquest model s'ha desenvolupat pels dos solvents orgànics més usats en HPLC, acetonitril i metanol, i pels sistemes amortidors més comuns (amoni/amoníac, àcid acètic/acetat, àcid fosfòric/dihidrogenfosfat/hidrogenfosfat i àcid cítric/dihidrogencitrat/hidrogencitrat/ citrat) a les concentracions de treball més habituals (de 0.001 a 0.1 mol·L-1), fins a un 60% en volum de modificador orgànic per l'acetonitril i un 80% pel metanol. Un cop desenvolupat i avaluat el model, el segon objectiu ha consistit en la interpretació i l'estimació dels temps de retenció cromatogràfics d'anàlits amb propietats àcid/base, en termes de la variació dels seus valors de pKa i del pH de les fases mòbils hidroorgàniques en funció del contingut del solvent orgànic. En relació a l'electroforesi capil·lar zonal (CZE) el primer objectiu ha consistit en la caracterització del nitrometà com a solvent orgànic d'ús en electroforesi capil·lar no aquosa (NACE), en estudiar la viabilitat de la detecció conductimètrica i ultraviolada, la dependència de la mobilitat dels ions en funció de la força iònica del medi, l'establiment d'una escala adequada de pH i fenòmens d'associació. El segon objectiu ha residit en la resolució d'un problema analític concret, la separació d'un fàrmac antidepressiu atípic poc soluble en aigua de dos dels seus metabòlits principals, usant electroforesi capil·lar amb solvents no aquosos, concretament metanol i acetonitril. / "Organic solvents in capillary electrophoresis and liquid chromatography"TEXT:The use of methanol- and acetonitrile- aqueous buffer mobile phases in RP-HPLC is a common election when performing chromatographic separations of ionisable analytes. The addition of organic solvent to the aqueous buffer to prepare such a mobile phase changes the buffer capacity and the pH of the solution. In this thesis work, the variation of these buffer properties is studied for acetic acid-acetate, phosphoric acid-dihydrogenphosphate-hydrogenphosphate, citric acid-dihydrogencitrate-hydrogencitrate-citrate, and ammonium-ammonia buffers. It is well established that the pH change of the buffers depends on the initial concentration and aqueous pH of the buffer, on the percentage of organic solvent added, and on the particular buffer used. The proposed equations allow the pH estimation of methanol- and acetonitrile-water buffered mobile phases up to 80% and 60%, respectively, in volume of organic modifier from initial aqueous buffer pH and buffer concentration (before adding the organic modifier) between 0.001 and 0.01 mol L−1. From both the estimated pH values of the mobile phase and the estimated pKa of the ionisable analytes, it is possible to predict the degree of ionisation of the analytes and therefore, the interpretation of acid-base analytes behaviour in a particular hydroorganic buffered mobile phase.Nitromethane has several properties that make it an interesting solvent for capillary electrophoresis especially for lipophilic analytes that are not sufficiently soluble in water. In the present thesis we investigated the change of electrophoretically relevant analyte properties (mobilities and pKa values) in nitromethane in dependence on the most important experimental conditions determined by the background electrolyte: the ionic strength and the pH.Sertindole, an atypical antipsychotic drug, was separated by capillary electrophoresis from its two main metabolites norsertindole and dehydrosertindole. The low solubility of the analytes in water was overcome by the use of methanol and acetonitrile as solvents for the background electrolyte.

Anteriores estudios sobre ácidos 3-aril-2-mercaptopropenoicos han mostrado una gran capacidad de reacción frente a los iones metálicos, dando lugar a la formación de precipitados con los iones de los grupos primera y segunda de la marcha analítica clásica, y complejos solubles coloreados con los metales de transición. La sensibilidad y selectividad de algunas de estas reacciones se ha aplicado a la determinación espectrofotométrica de iones metálicos como níquel(II), titanio(IV) o manganeso(II). Aunque el tipo de reacciones a que dan lugar son muy similares a las de los mercaptoácidos saturados, como tioglicólico o mercaptoacético, las reacciones que dan los ácidos 3-aril-2-mercaptopropenoicos son mucho más sensibles debido a la presencia de un doble enlace conjugado entre la agrupación ácido carboxílica-tiol y el sustituyente aromático.Por otra parte, se ha comprobado la importancia de este tipo de compuestos en sistemas biológicos por su capacidad de complejación con los iones metálicos, siendo potentes inhibidores de ciertas metaloenzimas dependientes de cobre(ll) y zinc(II), y mostrando actividad antibacteriana.Los datos disponibles sobre complejación de iones metálicos por los ácidos 3-aril-2-mercaptopropenoicos han mostrado una alta afinidad por los iones Ni(ll)y Zn(II), formando complejos muy estables de composición 1:1:0 y 2:1:0 (ligando:metal:protón). Estos complejos son más estables que los correspondientes formados por los ácidos 3-aril-2-mercaptopropanoicos, debido a la mayor conjugación que permite su estructura.Con el objeto de profundizar en el conocimiento de este tipo de sustancias como reactivos analíticos y su comportamiento frente a los iones metálicos, se han estudiado en esta memoria los ácidos 3-(1-Naftil)- y 3-(2-Naftil)-2-mercaptopropenoicos (31N2MP y 32N2MP, respectivamente), en los que el sustituyente aromático es de anillos condensados, para obtener una mayor deslocalización en el sistema de electrones "pi" de la molécula. Se han estudiado los dos naftil-derivados para comprobar si las diferencias en cuanto a efectos resonantes de la molécula también da lugar a diferente comportamiento frente a los iones metálicos. Los estudios llevados a cabo han consistido en su síntesis, determinación de sus características químicas, reaccionabilidad y equilibrios de formación de algunos de sus complejos solubles. / "STUDY OF 3-NAPHTHYL-2-MERCAPTOPROPENOIC ACIDS AS COMPLEXING AGENTS OF METAL IONS"TEXT:The ligands, 3-(1-naphthyl)-2-mercaptopropenoic and 3-(2-naphthyl)-2-mercaptopropenoic acids (31N2MP and 32N2MP, respectively) have been syntesized and their purity was determined by potentiometric and iodometric titrations. The spectral characteristics in the I.R., N.M.R. and U.V. -vis. have been studied. The dissociation constants of carboxyl and mercapto groups have been determined spectrophotometrically in aqueous medium at 25° C and I =0.1 M in sodium perchlorate by the SQUAD program.The reactions with metal ions have been studied the most sensitive being with Cu(II), Pd(II), Mo(VI), Fe(II-III), Ni(II), Mn(II) and Ti(IV).Part of this research work has been dedicated to development of several computer programs for study of complex formation equilibria by pH titrations, for use with a HP 3421 A data logger and a HP 9816 S desk computer:- Program AUTO, for automatic control of potentiometrlc titrations.- MINIGLASS is a menu-driven program for the refinement of stability constants from pH titration data and adjustement of parameters defining the titration curve. The program is written in PASCAL, and contains procedures for blank titrations, acidity constants and metal-ligand stability constants. The program has been tested for the determination of the formation constants of the Ni(II)-glycine-H system. The results obtained agree well with the literature values.- Program DISTR, used to draw species distribution as function of PH of solutions.The automatic titration system and the computer programs have been applied to the determination of protonation and complex formation equilibria between zinc and nickel ions and 3-naphthyl-2-nlercaptopropenoic acids, in 50 % waterethanol solutions containing 1.0 M NaClO(4) as constant ionic medium at 25° C using glass electrode potentiometry. Protonation constants of ligands and formation constants for the complexes Ni(31N2MP), Ni(31N2MP)(2), Zn(31N2MP) Zn(31N2MP)(2), Ni(32N2MP), Ni(32N2MP)(2,) Zn(32N2MP), Zn(32N2MP)(2) and Zn(32N2MP)(2) are given.The complex formation equilibria between nickel, palladium and cobalt with 31n2MP have been studied in aqueous solutions, by UV-vis. spectrophotometry, at 25° C and I =0.1 M in sodium perchlorate with the use of the program SQUAD. The formation constants for the complexes Ni(31 N2MP), Ni(31N2MP)(2), Pd(31N2MP), Pd(31 N2MP)(2), Co(31N2MP), Co(31 N2MP)(2) and Co(31 N2MP)(3) are reported.

Los estudios incluidos en esta tesis doctoral tienen como objetivo profundizar en el conocimiento de los mecanismos de distribución global de contaminantes orgánicos persistentes (COPs) mediante el estudio de procesos y factores ambientales que determinan su transporte atmosférico y posterior deposición en las zonas de alta montaña de Europa. Se estudiaron diversas familias de COPs en muestras de nieve acumulada durante todo un invierno en un gradiente altitudinal en las Montañas Tatra (Europa del Este). Los contaminantes incluidos en el estudio comprenden compuestos organoclorados cuya producción y uso está prohibido (PCBs, HCHs, HCB), los incluidos recientemente en las listas del Convenio de Estocolmo (PBDEs, endosulfanos), así como otro grupo de contaminantes ampliamente distribuidos en el medio ambiente como los PAHs. Por otro lado, se midieron los flujos de deposición atmosférica de PBDEs durante más de 24 meses en cuatro zonas de alta montaña de Europa: al sur (Lago Redon, Pirineos) y noroeste (Lochnagar, Escocia), en el centro (Gossenköllesee, Alpes) y este (Skalnate Pleso, Tatras). Se calcularon las retrotrayectorias con el modelo meteorológico HYSPLIT en los puntos de muestreo durante el período de estudio para obtener una descripción detallada del origen de la contaminación transportada por vía atmosférica en cada zona. Previo al análisis de PBDEs en las muestras de nieve o de deposición atmosférica se desarrolló y optimizó una metodología analítica e instrumental con límites de detección suficientemente bajos para permitir su determinación en las muestras recogidas. Se obtuvo un método de extracción en fase sólida (SPE) rápido, simple y cuantitativo para el análisis de PBDEs en muestras acuosas, además de un método instrumental por GC-MS en modo NICI que permitió la determinación de PBDEs de 3 a 10 átomos de bromo a nivel de femtogramos en una única inyección. Los resultados obtenidos del análisis de COPs en la columna total de nieve acumulada durante todo un invierno en las Tatras mostraron la presencia de todos los compuestos estudiados en todas las muestras y altitudes, poniendo de manifiesto la distribución global de los mismos. Entre los resultados obtenidos destaca la identificación y cuantificación de los PBDEs, en particular el BDE 209, lo que pone de manifiesto su capacidad de transporte atmosférico hasta las zonas montañosas remotas a pesar de su baja volatilidad y carácter hidrofóbico. En el caso de los PBDEs menos bromados, éste constituye el primer estudio que describe una dependencia de sus concentraciones en nieve con la altitud, o lo que es lo mismo, en función inversamente proporcional a la temperatura. Ello es coherente con el efecto de acumulación preferencial en zonas frías del planeta observado para otras familias de COPs. BDE 209 y el endosulfan sulfato no mostraron una dependencia con la temperatura sino con la cantidad de partículas presentes en la nieve, lo cual indica que el transporte a larga distancia de estos compuestos está asociado a los aerosoles atmosféricos. Los resultados obtenidos en las muestras de deposición atmosférica mostraron una composición de PBDEs en las cuatro zonas de estudio coherente con la de las mezclas comerciales utilizadas en Europa, pentaBDE y decaBDE. BDE 209 fue el congénere más abundante en seguido por BDE 47, BDE 99, BDE 100 y BDE 183. Además, se observaron procesos de degradación fotolítica que modifican la composición relativa de los congéneres con respecto a la encontrada en las mezclas comerciales en zonas situadas a mayor altitud y durante los periodos más cálidos, relacionado con el mayor grado de insolación en estas condiciones. El estudio de las retro-trayectorias en estas zonas durante el periodo de muestreo indicó un aumento de los flujos de deposición de PBDEs en las zonas de muestreo más occidentales (Redon y Lochnagar) asociado a las masas de aire provenientes del Atlántico Norte (USA, Canadá). En el Lago Redon, se observaron flujos de deposición más altos y correlaciones mejores cuando las masas de aire provenían de Norteamérica sin pasar por el Reino Unido, indicando que este aumento de las concentraciones de PBDEs no estaba relacionado con las fuentes europeas regionales. En esta tesis se ha demostrado, por primera vez, que existe un transporte a larga distancia de PBDEs desde América del Norte hacia Europa. Este mecanismo de transporte es coherente con el mayor grado de uso de estos compuestos en USA y Canadá en relación con Europa y con la dirección predominante de los vientos contra-alisios. / This thesis presents a further insight of the global distribution mechanisms of POPs (Persistent Organic Pollutants) studying the environmental factors and process that affects the atmospheric transport of POPs and the deposition in the remote high mountains areas of Europe. Organochlorine compounds and polycyclic aromatic hydrocarbons were examined in seasonal snowpacks taken along an altitudinal gradient in Tatra Mountains (East Europe). The compounds included in the study reported encompass both legacy and currently used pollutants of diverse physical-chemical properties and origins, providing representative cases for description of the environmental processes involved in the observed accumulation patters. Moreover, PBDEs fluxes and composition in bulk atmospheric deposition were determined in four European high altitude mountain areas over a period of two years (2004-2006): Lake Redon (Pyrenees), Gossenköllesee (Alps), Lochnagar (Scotland) and Skalnate (Tatras). Potential source regions for each site have been evaluated using the HYSPLIT model. All the pollutants analyzed in the snowpack samples were found at all altitudes, pointing to their global distribution. The presence of PBDEs, particularly BDE 209, in the snowpack samples is especially relevant, as it reflects the air transport capacity of this low volatile, very hydrophobic pollutant to remote mountain regions. The most abundant compounds at all altitudes were PAHs. PCBs and BDE 209 were the dominant organohalogen pollutants. The concentrations of several compounds correlated positively and statistically significant (i.e., negatively with temperature), which is consistent with cold-trapping effects. To the best of our knowledge, this is the first report of statistically significant altitudinal correlations of PBDEs in snow that involve higher concentrations and deposition fluxes at higher elevation. The PBDEs distributions in atmospheric deposition samples at all sites were dominated by BDE209. BDE47 and BDE99 were the major low-brominated congeners, followed by BDE100 and BDE183. This composition is consistent with predominant inputs from commercial mixtures decaBDE and pentaBDE. Photolytic degradation during transport decreased the relative abundance of BDE209 and modified the emitted pentaBDE technical mixtures by depletion of the relative composition of BDE99 and, to a lower extent, BDE47. The transformations were more intense in the sites located above 2000 m, Redon and Gossenköllesee, during warm periods. Significant correlations between PBDE composition and percent of North Atlantic backwards trajectories in the collected samples of the westernmost sites, Lochnagar and Redon, suggested an impact of transcontinental transfer of these pollutants from North American sources into Europe.

Aquesta Tesi es titula Determinació de constants d’acidesa de substàncies d’interès biològic per electroforesi capil·lar. La Dissertació es focalitza llavors en l’estudi de la determinació de la constant d’acidesa de fàrmacs utilitzant aquesta tècnica d’electroseparació, l’electroforesi capil·lar. La constant d’acidesa o pKa és una propietat fisicoquímica útil en el descobriment i desenvolupament de fàrmacs, on el coneixement de l’estat de ionització d’un grup funcional és sovint essencial per a comprendre les propietats farmacocinètiques i farmacodinàmiques de nous fàrmacs potencials. Gràcies a l’ús d’un patró intern (IS), es va desenvolupar una nova metodologia per a la determinació d’aquestes constants per electroforesi capil·lar (CE), el mètode IS-CE. No obstant això, aquest mètode només es va desenvolupar per a substàncies simples monopròtiques. Així doncs, l’objectiu principal d’aquesta Tesi és establir el mètode IS-CE com a mètode d’alt rendiment per a la determinació de constants d’acidesa de compostos bioactius, així com també dissenyar un prototip específic per aquest mètode per tal d’implementar-lo per a l’anàlisi rutinari de fàrmacs potencials en laboratoris d’anàlisis fisicoquímiques. Aquesta fita ha estat perseguida al llarg d’aquesta Dissertació, cobrint durant el seu desenvolupament cada necessitat que presentava el mètode. Per començar, en aquesta Tesi s’estableix el pKa d’un llistat de patrons interns àcids i bàsics de diferent estructura que cobreixi tot l’interval de pH útil en electroforesi capil·lar i s’amplia l’aplicabilitat del mètode a compostos amb diverses constants d’acidesa. Posteriorment s’optimitzen els paràmetres instrumentals per tal de convertir l’IS-CE en un mètode high throughput IS-CE. Després s’avalua la capacitat del mètode per a la determinació de compostos de baixa solubilitat en aigua i s’amplia per a la determinació de constants d’acidesa de compostos de molt baixa solubilitat utilitzant mescles metanol-aigua. Arribat aquest punt es dissenya una instrumentació específica adaptable al mètode IS-CE, tot simplificant i agilitzant el procés per a la determinació del pKa. En conjunt, aquest treball d’investigació científica ha permès el desenvolupament consolidat d’un mètode ràpid, robust, precís i acurat per a la determinació de constants d’acidesa de compostos bioactius. Així mateix, també ha permès dissenyar un nou prototip per a la implementació d’aquest mètode a l’anàlisi rutinari de fàrmacs potencials en laboratoris de mesures fisicoquímiques i de drug discovery and development. / The Dissertation is then focused on the study of the acidity constant determination of drugs using this electroseparation technique, capillary electrophoresis. The acidity constant or pKa is a useful physicochemical property in drug discovery and development, where the knowledge of the ionization state of a functional group is often essential to understand the pharmacodynamic and pharmacokinetic properties of new potential drugs. In the past, a new method to determine acidity constants by capillary electrophoresis (CE) was developed by the use of an internal standard (IS), the IS-CE method. However, this method was only developed for simple monoprotic compounds. Thus, the main objective of this Thesis is to establish the IS-CE method as a high throughput method for the determination of acidity constants of bioactive compounds as well as to design a specific prototype for this method in order to implement it for the routine analysis of potential drugs in physicochemical analysis laboratories. This goal has been pursued throughout this Dissertation in order to meet the need during the development of this method. First of all, this Thesis establishes the pKa of a list of acidic and basic internal standards with different structures that covers the entire pH-range useful in capillary electrophoresis, and expands the applicability of this method to compounds with several acidity constants. Afterwards, instrumental parameters and experimental conditions are optimized in order to transform the IS-CE method into a high throughput method. Subsequently, the method is evaluated for sparingly soluble compounds in water and extended for the determination of acidity constants of highly insoluble compounds using methanol-water mixtures. At this point a specific instrumentation is designed and adapted to the IS-CE method, simplifying and accelerating the pKa determination process. Overall, the conducted scientific research has allowed the development of a consolidated fast, robust, precise and accurate method for the determination of acidity constants of bioactive compounds. Likewise, a new prototype has been designed for the implementation of this method to the analysis of potential drugs in routine laboratory of physicochemical measurements and drug discovery and development.

In this doctoral thesis the interaction of emergent organic pollutants, such as alkylphenolic and perfluorinated compounds (APCs and PFCs, respectively) with sewage sludge and soil samples was studied. These two families of organic compounds were selected because of their ubiquitous presence and persistence in environmental matrices and to know mechanisms responsible for their interaction. With respect to the behaviour of APCs in sewage sludges, concretely octylphenol (OP), nonylphenol (NP) and nonylphenol-mono-ethoxylate (NP1EO), the application of a leaching test to fresh sludge samples and to samples dried at 40 °C showed that leaching yields of APCs decreased after the drying treatment (from 1.3-35% for fresh sludge samples to 0.8-3.4% for dried samples). This was attributed to differences in the characteristics of sludge organic matter in fresh and dried sludge samples. Thus, in the fresh sludge samples, APCs were mainly associated with the particulate matter in solution, showing high leaching yields. In contrast, drying treatment provoked the transformation of organic compounds into simpler molecules, thus leading to a decrease in the particulate matter in solution, thus favouring the association of APCs with the organic matter of the solid phase, and decreasing the leaching yield. Therefore, sewage sludge drying is recommended before their potential addition to agricultural soils. For studying the sorption behavior of NP and NP1EO in soils, sorption and desorption tests were applied to several soils with different characteristics such as pH, organic carbon (OC) and dissolved organic carbon. Sorption and desorption isotherms of NP and NP1EO were linear within the concentration range studied, and the solid-liquid distribution coefficients (Kd) derived from the isotherms correlated with the OC of soils, suggesting that soil organic matter governed the sorption of NP and NP1EO through a hydrophobic interaction with the alkyl chain of APCs. Exception to this pattern was the sorption of NP1EO in those soils with the highest DOC/OC ratio, which were better described by the Freundlich equation (N>1), due to the competition between the organic matter in solution and that in the solid phase for NP1EO sorption at low initial concentrations. Moreover, Kd values were usually higher for NP than for NP1EO, according with the higher hydrophobicity of NP. Desorption yields of NP and NP1EO were lower than 5 %, thus indicating that the sorption of APCs in soils was considerably irreversible. Sorption behaviour of PFCs, concretely perfluorooctane sulfonate (PFOS), perfluorooctanoic acid (PFOA), perfluorobutane sulfonate (PFBS), in sewage sludge and soil samples led to similar conclusions to those obtained for APCs. Sorption and desorption isotherms showed a linear pattern in the two environmental matrices, with satisfactory correlations between Kd and the organic matter content of the sample, suggesting a hydrophobic interaction between the pefluorinated carbon chain and the organic matter of sewage sludges and soils, predominantly Van der Waals forces. Potential additional role of Ca/Mg ion bridges to overcome the electrostatic repulsions of deprotonated PFCs with negatively charged surface sites of sludges at the sample pH was also suggested. Sorption affinity of the PFCs for the sludge and soil samples increased with the hydrophobicity of the compound, that is, in the sequence: PFBS < PFOA < PFOS. In contrast, PFOS showed the highest irreversibility in the two environmental matrices, whereas PFOA and PFBS were desorbed in higher rates. This suggested that the physicochemical properties of the compound, such as solubility and octanol-water partitioning coefficient, together with the organic matter content of sewage sludges and soils controlled the sorption behaviour of PFCs. / En esta tesis doctoral se ha estudiado la interacción de contaminantes orgánicos persistentes, tales como compuestos alquilfenólicos (APCs) y perfluorados (PFCs) con lodos de depuradora y suelos. Por lo que se refiere a la lixiviación de APCs en muestras de lodo, concretamente de octilfenol (OP), nonilfenol (NP) y nonilfenol-mono-etoxilado (NP1EO), ésta disminuyó después de un tratamiento de secado a 40 °C. Este comportamiento se atribuyó al hecho que, en el lodo fresco, los APCs se encontraban mayoritariamente asociados a la materia orgánica particulada en solución, mientras que el secado condujo a una transformación de la materia orgánica en moléculas más sencillas, provocando que los APCs quedaran mayoritariamente retenidos en la fase sólida del lodo, disminuyendo su lixiviación. En relación con la interacción de APCs en suelos, se evaluó la sorción y desorción de NP y NP1EO en suelos con distintos contenidos del carbono orgánico (OC). La sorción y desorción de estos compuestos fue lineal para el intervalo de concentraciones estudiado y los coeficientes de distribución sólido-líquido (Kd) obtenidos mostraron una buena correlación con el OC, lo que sugirió una interacción hidrófobica entre la cadena alquilo del APC y la materia orgánica de los suelos. La desorción de NP y NP1EO fue inferior a 5% para todas las combinaciones APC-suelo, demostrando una sorción significativamente irreversible de estos compuestos. Los estudios de sorción de PFCs, concretamente de sulfonato de perfluoroctano (PFOS), ácido perfluorooctanoico (PFOA) y sulfonato de perfluorobutano (PFBS), en lodos y suelos llevaron a conclusiones similares a las obtenidas con APCs. Las isotermas de sorción de PFCs también mostraron un comportamiento lineal en ambas matrices ambientales con una buena correlación entre Kd y OC, lo que sugirió una interacción hidrofóbica entre la cadena perfluorada y la materia orgánica. Se observó que la afinidad de sorción de PFCs en lodos y suelos aumentó con la hidrofobicidad del compuesto (PFBS < PFOA < PFOS), mientras que la desorción disminuyó, siendo el PFOS el más irreversiblemente sorbido, lo que permitió concluir que la hidrofobicidad del compuesto gobierna su sorción en lodos y suelos.