CARVALHO, Fabrício Eulálio Leite. Chloroplast redox metabolism and npq regulation in arabidopsis and rice exposed to excessive light: new insights into psii photoprotection mechanisms. 2016. 171 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Aline Mendes (alinemendes.ufc@gmail.com) on 2016-08-22T20:11:28Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_felcarvalho.pdf: 30686669 bytes, checksum: 85dc625a7c251e2887eb83f7896091be (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-23T18:27:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_felcarvalho.pdf: 30686669 bytes, checksum: 85dc625a7c251e2887eb83f7896091be (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-23T18:27:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_felcarvalho.pdf: 30686669 bytes, checksum: 85dc625a7c251e2887eb83f7896091be (MD5) Previous issue date: 2016 / Plants are sessile organisms, which evolved from aquatic environment to land. This crucial change in habitat opened a new word of resources, but also generated numerous adaptive challenges. Among these defies, sustain photosynthesis under an excessive light environment consist in one of the most important adverse factors to be overcame by plants. Excessive light is defined as the light absorbed by plants, which exceeds their photosynthetic capacity. Under such conditions, the over-accumulation of oxygen reactive species (ROS) could lead to impairment on photosystem two reaction centers (RCII), generating photoinhibition and affecting negatively crop productivity. In this sense, the development of photoprotective mechanisms was essential for plants surviving. Among such mechanisms, non-photochemical quenching (NPQ) and antioxidative metabolism have been intensively studied. However, the real importance of such photoprotective mechanisms and the possible integrative processes which connect NPQ and redox metabolism still not totally understood. The present study addressed to comprehend the integrative mechanisms underlying NPQ and antioxidative processes in two different plants species: one classic plant model (Arabidopsis thaliana) and one important crop model (Oryza sativa). In order to reach such objectives, first was employed new fluorimetric-based methodologies related to photoinhibition quantification, involving photochemical quenching measured in the dark subsequently illumination (qPd) and the fraction of NPQ formed which was related to photoprotection (pNPQ). The use of this methodology was well succeed with A.Thaliana plants under an important physiological problem: light tolerance during plant ontogenesis. The importance of ROS accumulation during less tolerant developmental phases (juvenile and senescent) and chlorophyll concentrations were discussed. Subsequently, the mechanisms underlying pNPQ formation were investigated in the same model, which revealed the importance of combined adjustments in PsbS protein expression, delta pH formation and zeaxanthin/violaxanthin pigment contents for phototolerance during A. thaliana ontogenesis. The importance of total xanthophyll pool in pNPQ generation was evaluated. Finally, the current study attempted to employ the methodology involving qPd in a crop model (rice) knockdown for thylakoidal ascorbate peroxidase isoform (APX8 proteins; apx8 = transformed plants). The data revealed new importance for APX8, which were more sensitive to light, specially under moderate growth light (400 µmol m-2 s-1) compared with non-transformed (NT). Transformed apx8 plants accumulated less chlorophyll, over-accumulated H2O2 and presented impairment on thermal component of NPQ (qE) formation. Under high light intensities growth conditions (4 days), apx8 plants activated compensatory mechanisms which were probably effective as photoprotective mechanism. / Plantas são organismos sésseis e por sua natureza precisaram desenvolver diversos mecanismos ligados a maximização da utilização dos recursos primordiais disponíveis para sua sobrevivência nas mais diversas condições ambientais. Em condições ambientais ótimas de crescimento, a intensidade de energia absorvida a partir da luz incidente equivale a demanda energética exercida pela atividade metabólica circunstancial da planta. Entretanto, na quase totalidade dos casos, tais condições não existem na natureza. O excesso de luz é caracterizado por uma condição ambiental na qual o organismo vegetal é submetido a uma quantidade de energia luminosa mais alta do que a capacidade de utilização nas reações bioquímicas que compõem o metabolismo celular necessário para o crescimento normal do indivíduo. Sendo assim, o excesso de luz pode ser consequência de altas intensidades de luz incidente ou devido a restrições nas reações de consumo de poder redutor, especialmente assimilação de CO2. Portanto, plantas submetidas a estresse salino por exemplo, o qual está muitas vezes associado a uma restrição de natureza estomática, podem apresentar estresse de excesso de luz, mesmo sob intensidades moderadas de luz incidente. A energia excedente pode aumentar a probabilidade da ocorrência de reações colaterais tais como a formação das espécies reativas de oxigênio (EROS). Essas moléculas de alta reatividade podem gerar diversos efeitos negativos para o funcionamento celular, incluindo desnaturação de proteínas, peroxidarão lipídica de membranas e fotoinibição da atividade do fotossistema II (PSII). A ocorrência de fotoinibição é extremamente negativa para o crescimento e desenvolvimento vegetal, afetando a produção de alimentos global. Entretanto, pressões evolutivas causadas pela seleção natural conduziram ao aparecimento de diversos mecanismos de proteção fotooxidativa. Entre as respostas de fotoproteção acionadas em vegetais, duas merecem especial destaque: a dissipação de energia na forma de calor (componente qE do quenching não-fotoquímico - NPQ) e a modulação da expressão de genes ligados a rotas de síntese de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos. Em uma perspectiva sistêmica, entretanto, nenhuma dessas respostas ocorre de maneira isolada em uma célula vegetal. Contrariamente, esses mecanismos interagem de maneira contínua e interdependente, partilhando substratos e rotas de sinalização, e, deste modo, conduzindo à aclimatação da planta às condições de excesso de luz. O presente estudo de doutorado objetivou primariamente aprofundar os conhecimentos existentes acerca dos papéis do NPQ na fotoproteção de plantas. Com esse intuito, plantas modelo da espécie Arabidopsis thaliana foram utilizadas para entender as dinâmicas fotossintéticas em resposta ao excesso de luz. Uma metodologia pioneira para a detecção de fotoinibição, baseada em técnicas de fluorimetria da clorofila a relacionadas à quantificação do quenching fotoquímico medido no escuro, subsequente a um período de iluminação (qPd) foi utilizada. Essa metodologia permite a quantificação dos primeiros indícios de fechamento permanente dos centros de reação do PSII (RCII) e possibilita a quantificação da fração de NPQ que de fato contribui para a fotoproteção (pNPQ). Plantas de Arabidopsis de diferentes idades foram utilizadas, objetivando-se a aplicação da metodologia em um problema fisiológico relevante. Os resultados obtidos nesse estudo são apresentados no capítulo 2 do pressente trabalho e evidenciam que: a) plantas de Arabidopsis apresentam maior susceptibilidade a fotoinibição nas fases juvenil e senescente da ontogênese, b) a fotoproteção foi positivamente associada com a maior eficiência de formação do pNPQ e conteúdo total de clorofilas; c) a maior susceptibilidade a fotoinibição foi coincidiu com acúmulo de EROS nas fases juvenil e senescente e d) o uso da técnica baseada no qPd foi bem sucedido, evidenciando o potencial para futuras aplicações em outros contextos fisiológicos. Posteriormente, buscou-se um maior entendimento acerca dos mecanismos inerentes ao parâmetro pNPQ. Utilizou-se uma abordagem simplificada consistindo em apenas três fases ontogenéticas de plantas de Arabidopsis no intuito de investigar os processos de conhecido envolvimento com a formação do qE, ΔpH, relação violoxantina/zeaxantina e quantidade da proteína PsbS. Esses dados estão relacionados no capítulo 3 do presente trabalho e evidenciam que: a) plantas senescentes e juvenis apresentam menor quantidade de PsbS e formação de ΔpH respectivamente em comparação a plantas maduras, b) as plantas maduras apresentam maior quantidade de pigmentos xantofilas, o que em combinação com maiores níveis de clorofila reportados anteriormente podem explicar uma maior eficiência e potencial na formação de qE, o qual estaria intimamente ligado ao pNPQ. Finalmente, o presente trabalho de doutorado buscou a aplicação dos conhecimentos gerados acerca das novas técnicas de detecção da fotoinibição e pNPQ em uma planta modelo de interesse agronômico, arroz (Oryza sativa). Objetivando-se investigar a relação das EROS com os processos de fotoproteção associados ao pNPQ, plantas de arroz silenciadas por meio de RNAi para a expressão das APX de tilacóides (APX8) foram empregadas. Os resultados obtidos nesses estudos se encontram no capítulo 4 da presente tese e evidenciam que: a) em luz moderada, plantas silenciadas (apx8) apresentam maior susceptibilidade a fotoinibição associada a menor acúmulo de biomassa e menor produtividade, b) essas características das plantas apx8 provavelmente estiveram ligadas a menor eficiência de formação de pNPQ e qE, c) as diferenças relacionadas ao pNPQ provavelmente estiveram associadas com menor conteúdo de clorofilas e acúmulo de EROS nas plantas apx8, evidenciando novamente a importância desses fatores com a capacidade de fotoproteção em plantas e d) em condições de aclimatação ao excesso de luz, a ausência da APX8 é compensada por outras peroxidases, levando a redução nos níveis de EROS e provavelmente recuperação dos níveis de clorofila, que levam a uma recuperação do fenótipo evidenciado em luz moderada.Conclui-se com a presente tese que o uso das metodologias relacionadas a determinação do qPd para estudos de integridade dos RCII foi eficaz para duas espécies distintas, Arabidopsis thaliana e Oryza sativa. Adicionalmente, os resultados indicam que a eficiência de formação do pNPQ parece ser um fator determinante para a capacidade de fotoproteção, que por sua vez é dependente do conteúdo de pigmentos fotossintéticos, especialmente clorofila e carotenoides, assim como eficiência do metabolismo antioxidativo. Essas relações são primeiramente descritas no presente trabalho de doutorado e apresentam potencial de aplicação futura em estudos envolvendo obtenção de plantas mais tolerantes ao excesso de luz. Tais condições de excesso de luz são recorrentes em diversas regiões do mundo, mas especialmente importantes em regiões do semiárido do nordeste do Brasil, onde se encontram em combinação com outros fatores de estresse abiótico, tais como seca e alta salinidade do solo. Espera-se com essas descobertas, contribuir para o conhecimento científico da área de bioquímica vegetal e, posteriormente, possibilitar sua aplicação em âmbito do desenvolvimento agrícola regional.