Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Jaqueline Oliveira (jaqueoliveiram@gmail.com) on 2008-12-11T19:02:46Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_JulianaAmorimAraujo.pdf: 3037793 bytes, checksum: a7399845548557e765e50c02f6d3d986 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-20T15:27:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_JulianaAmorimAraujo.pdf: 3037793 bytes, checksum: a7399845548557e765e50c02f6d3d986 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-20T15:27:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_JulianaAmorimAraujo.pdf: 3037793 bytes, checksum: a7399845548557e765e50c02f6d3d986 (MD5) / A coagulação enzimática do leite para fabricação de queijo envolve a quebra de uma ligação peptídica da caseína por uma protease aspártica. Tradicionalmente, esta clivagem é feita em escala industrial pela ação da quimosina bovina que combina uma forte atividade de coagulação do leite com uma baixa atividade proteolítica. No presente estudo, é relatada a expressão, purificação e caracterização de quimosina recombinante bovina na levedura metilotrófica Pichia pastoris. Para alcançar altos níveis de produção, o cDNA do fragmento codante da pró-quimosina B bovina foi desenhado e sintetizado in vitro otimizando o codon usage para a expressão em P. pastoris. O gene sintético (CHYMb) foi clonado em vetores de expressão contendo os promotores PGK1 (expressão constitutiva) e AOX1 (expressão induzida) seguindo-se integração no genoma da levedura. Os clones transformantes com maior produção enzimática de cada sistema (P1 e A3, respectivamente) foram analisados em culturas simultâneas para comparação da produção enzimática. Maiores níveis de atividade de quimosina foram observados no clone sob o comando do promotor PGK1, que apresentou alta produção durante toda a cultura. Uma otimização na produção enzimática foi desenvolvida através de planejamentos fatoriais. A influência da densidade celular inicial, metanol e concentração da fonte de nitrogênio foram avaliados para aumentar a produção do clone A3. A interação dos fatores densidade celular inicial e concentração de metanol foi determinada como sendo o parâmetro mais importante, dobrando a produção. A influência de diferentes concentrações da fonte de nitrogênio e carbono, previamente selecionados (farelo de soja e açúcar invertido), foi também analisada para aumentar a produção enzimática no clone P1. Foi demonstrado por análise estatística que maiores concentrações de cada fator aumentam a produção. O perfil de atividade enzimática foi avaliada em fermentador com as condições determinadas nas otimizações. A atividade encontrada nos dois casos (A3 e P1) foi superior àquelas encontradas na fermentação em frascos. A quimosina recombinante foi posteriormente purificada apenas por uma etapa de cromatografia de exclusão molecular. Foi demonstrada a presença de enzima já processada no sobrenadante da cultura e uma fração de proteínas glicosiladas. A especificidade pela caseína foi demonstrada ser semelhante à quimosina comercial recombinante produzida por Aspergillus niger (Chr. Hansen). A alta produção de quimosina recombinante com alta especificidade em P. pastoris faz esse sistema de expressão atrativo para produção industrial desta enzima. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Enzymatic milk coagulation for cheese manufacturing involves the cleavage of the scissile bond in casein by an aspartic protease. Bovine chymosin B is commonly used at the industrial level for milk coagulation because it combines a strong clotting activity with a low general proteolytic activity. In the present study, we report the expression, purification and characterization of recombinant chymosin B expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. To achieve high levels of production, the cDNA fragment coding for prochymosin was designed and synthesized based on codon usage optimization for expression in P. pastoris. The synthetic gene (CHYMb) was cloned into expression vectors based on the PGK1 promoter (constitutive expression) and AOX1 promoter (inducible expression). The resulted constructs were integrated in the yeast genome. Transformant clones producing high levels of enzyme activity from each system (P1 and A3, respectively) were analyzed in a simultaneous culture for comparison of enzymatic production. High levels of chymosin activity were observed in the clone controlled by the PGK1 promoter which showed high production levels throughout the culture. Optimization for enzymatic production was developed through factorial design. The influence of the initial cellular density, methanol and nitrogen source concentration were accessed for enzymatic production from clone A3. The interaction of the initial cellular density and methanol concentration was responsible for doubling enzyme production. The influence of different concentrations of nitrogen and carbon sources (soy extract and inverted sugar, respectively) was also observed to increase enzymatic production in clone P1. Statistic analysis demonstrated that higher concentrations of each factor increased enzyme production. The profile of enzymatic activity was evaluated in fermentors under the conditions determined during optimizations. In this case, the activities observed in clones A3 and P1 were superior to those found when theses clones were grown in shake flasks. The recombinant chymosin was purified by a single molecular exclusion chromatographic step. Purified enzyme derived from supernatant fraction was shown to be present in its processed form and a fraction of glycosylated protein was also detected. The specificity for casein was shown to be similar to that from commercial recombinant chymosin produced by Aspergillus niger (Chr. Hansen). The high production and high specificity of recombinant chymosin derived from P. pastoris renders this expression system as an attractive alternative for large scale industrial production of this enzyme.

LEITE, Hugo de Brito. Aplicação de peptidases laticíferas para produção de queijo coalho vegetariano. 2016. 84 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Aline Mendes (alinemendes.ufc@gmail.com) on 2016-08-22T20:42:34Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_hbleite.pdf: 2941503 bytes, checksum: b83be07efbcbd2c1388a3e3876a5a22a (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-23T18:27:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_hbleite.pdf: 2941503 bytes, checksum: b83be07efbcbd2c1388a3e3876a5a22a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-23T18:27:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_hbleite.pdf: 2941503 bytes, checksum: b83be07efbcbd2c1388a3e3876a5a22a (MD5) Previous issue date: 2016 / Peptidases are enzymes capable of performing cleavage of peptide bonds of other proteins and peptides. These enzymes exhibit a broad spectrum of applications because they are used from the food industry to the leather and skin processing and drug formulation. Peptidases also have been used in the dairy industry for the cheese production. The coagulation of milk caseins is the main step in the production of the cheese curds. Rennet or renin are consist of chymosin and when added to the milk they cause the first step of forming cheese, the coagulation. Due to restrictions of food intake using animal rennet because of eating habits (vegetarianism) or religious reasons (Judaism and Islamism) the search for coagulating enzymes alternatives to rennet has intensified. The present work aimed to evaluate the caseinolytic and coagulant activities of the milk of five different latex protein extracts for the production of cheese. The latex fractions obtained were dissolved in Tris-HCl 50 mM pH 6.5 buffer and submitted to total proteolytic activity assays with different activators, milk coagulation, total casein hydrolysis, and of κ-casein over time by SDS-PAGE on 15% polyacrylamide gels, establishing a protocol for cheese curd production and detecting peptidases after the production of cheese. Only the fractions of C. procera, C. grandiflora, and C. papaya showed proteolytic activity and milk coagulation activity. These peptidases were activated by DTT and L-cysteine. The milk coagulation time by latex peptidases is dose dependent with 60 µg being the optimum amount to coagulate 2 mL of milk. C. procera and C. grandiflora showed specific activity of milk coagulation close to the commercial rennet of animal origin. High concentrations of NaCl and CaCl2 did not affect the proteolytic activity and coagulation of milk. However, the pre-incubation of these samples at 75º C for 10 minutes completely eliminated their activities. Both proteolytic fractions proved to be capable of hydrolyzing κ-casein and producing peptides of 16 KDa similarly the commercial rennet. The cheeses generated by the latex peptidases had nice flavor, firm texture, scent and yield similar to cheeses produced with commercial chymosin. Also, no proteolytic activity was detected after the production of cheese. This way, the peptidases from C. procera and C. grandiflora can be used as an alternative to chymosin in the production of cheese curds. / Peptidases são enzimas capazes de realizar a clivagem de ligações peptídicas de outras proteínas e peptídeos. Essas enzimas apresentam um amplo espectro de aplicações, pois são utilizadas desde a indústria alimentícia até mesmo no processamento de couro e pele e formulações de medicamentos. Peptidases também têm sido utilizadas na indústria de laticínios para a produção de queijos. A coagulação das caseínas do leite é a principal etapa na produção de queijos do tipo coalho. O coalho ou renina é composto por quimosina e quando adicionado ao leite produz a primeira etapa de formação do queijo, a coagulação. Devido a restrições de consumo de alimentos que utilizem o coalho animal por razões de hábitos alimentares (vegetarianismo) ou por razões religiosas (judaísmo e islamismo) a busca por enzimas coagulantes alternativas à quimosina tem intensificado. O presente trabalho objetivou avaliar as atividades caseinolítica e coagulante do leite de cinco diferentes extratos de proteínas laticíferas para a produção de queijo. As frações laticíferas obtidas foram dissolvidas em tampão Tris-HCl 50 mM pH 6,5 e submetidas aos seguintes ensaios: atividade proteolítica total, atividade proteolítica com diferentes ativadores, atividade de coagulação do leite, avaliação da hidrólise da caseína total por SDS-PAGE e avaliação da κ-caseína ao longo do tempo através de SDS-PAGE em géis de poliacrilamida 15%, estabelecimento de um protocolo de produção do queijo tipo coalho e detecção de peptidases após a produção do queijo. Somente as frações de C. procera, C. grandiflora e C. papaya exibiram atividade proteolítica e atividade coagulação do leite, estas peptidases foram ativadas por DTT e L-cisteína. O tempo de coagulação do leite pelas peptidases laticíferas foi dose-dependente, sendo 60 µg a quantidade ideal para coagular 2 mL de leite. C. procera e C. grandiflora apresentaram atividade específica de coagulação do leite idênticas ao coalho comercial de origem animal. Altas concentrações de NaCl e CaCl2 não afetaram a atividade proteolítica e de coagulação do leite. Entretanto, a pré-incubação dessas amostras a 75º C por 10 minutos eliminou completamente suas atividades. Ambas as frações proteolítica demonstraram-se capazes de hidrolisar a κ-caseína e produzir peptídeos de 16 KDa de maneira idêntica ao coalho comercial. Os queijos gerados com as peptidases laticíferas apresentaram sabor agradável, textura firme, aroma e rendimento similares aos queijos produzidos com a quimosina comercial. Também não foi detectada atividade proteolítica após a produção do queijo. Dessa forma, as peptidases de C. procera e C. grandiflora podem ser utilizadas como alternativa a quimosina na produção de queijo coalho.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-05-05T16:35:32Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1038301 bytes, checksum: b2305d33db5ec37351a9a84b9b891ab7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-05T16:35:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1038301 bytes, checksum: b2305d33db5ec37351a9a84b9b891ab7 (MD5) Previous issue date: 2015-07-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sistemas aquosos bifásicos (SABs) são reconhecidos como eficientes na extração e purificação de diferentes compostos. Entretanto, as forças motrizes que dirigem a distribuição de diferentes solutos nos SABs ainda são pouco estabelecidas, principalmente porque existem poucos trabalhos focados em estudar os parâmetros termodinâmicos de partição de diferentes solutos. Isso impede a obtenção de conhecimentos científicos necessários para a modulação das propriedades fisico- químicas dos SABs afim de otimizar sua aplicação para a extração e purificação. Para abordar esta problemática, foram formados novos SABs com sais orgânicos (citrato de sódio, tartarato de sódio e succinato de sódio) ambientalmente seguros e poli(oxido de etileno), PEO, com massa molares 10000 e/ou 35000 g mol -1 nas temperaturas de 283,15, 298,15 e 313,15 K (capítulo 2). Além disso, um conjunto de SABs reportados na literatura e obtidos neste trabalho foi utilizado para avaliar o comportamento de partição da enzima quimosina (capítulo 3), avaliando a variação da energia livre de Gibbs de transferência ( transferência ), a variação da entalpia de ) e a variação da entropia de transferência ( ). Os resultados do segundo capítulo mostram que o processo de segregação de fase para todos os SABs obtidos foi endotérmico e entropicamente dirigido. A região bifásica do diagrama de fases aumentou na ordem citrato > tartarato > succinato, tornando-se maior com o incremento da massa molar do PEO. No capitulo 3 foi descoberto que a transferência da quimosina da fase inferior para a fase superior dos SABs avaliados foi entalpicamente dirigida com e A transferência da quimo- sina é um processo entalpica-entropicamente compensado com valores do potencial termodinâmico de partição compreendidos entre, . Também foi observado que o processo de partição da enzima é dependente da linha de amarração, natureza do cátion e do ânion, balanço hidrofóbico/hidrofílico e a massa molar da macromolécula. / Aqueous two-phase systems (ATPSs) are recognized as efficient for the extraction and puritication of different compounds. However, the motriz power that governs the distribution of different solutes in ATPSs are few understood, mainly because are few researches focused on the study of the partition thermodynamic of different solutes in these systems. This makes difficult to obtain the scientific knowledge necessary to the physic-chemistry properties modulation of ATPSs for optimizer their application for extraction and purification of solutes. In this sense, new ATPSs formed by organic salts (sodium citrate, sodium tartrate and sodium succinate) environmentally safe and poly (ethylene oxide), PEO, with molar mass 10,000 or 35,000 g mol -1 at 283.15, 298.15 and 313.15 K were formed (chapter 2). In addition, several ATPSs reported in the literature and obtained here were used for evaluate the behavior of enzyme chymosin (chapter 3). The transfer free energy change ( transfer enthalpy change ) and transfer entropy change ( ), ) were obtained. The second chapter results showed that the segregation process of phase for all ATPSs obtained was endothermic and entropic driven. The biphasic region on the phase diagrams increased follow: citrate > tartrate > succinate and increased as PEO mass molar increase. In the chapter 3, it was discovered that chymosin transfer from the bottom to top phase in the ATPS studies was enthalpically driven with and . The chymosin transfer process is enthalpy-entropy compensate with the partition thermodynamic potential values, between . It was also observed that the enzyme partition process depend of tie line, the cation/anion nature, hydrophobic/hydrophilic balance and macromolecule molar mass.