Streptococcus thermophilus est une bactérie lactique utilisée dans l’industrie laitière pour la fabrication de yaourts et de divers fromages. S. thermophilus se développe en chaîne de cellules. Le mécanisme de la séparation des cellules n’est pas connu chez S. thermophilus. Un mutant de S. thermophilus présentant des chaînes de cellules extrêmement longues a été caractérisé. Le gène identifié est nommé cse pour cell separation. La particularité de cse est qu’il résulte d’un réassortiment de modules. En effet, l’analyse a montré que son extrémité 5’ est homologue à celle de sip de S. salivarius, tandis que son extrémité 3’ est homologue à celle de pcsB de S. thermophilus. Le gène cse spécifique de S. thermophilus code une protéine modulaire. A son extrémité N-terminale, Cse possède un peptide signal et un domaine de liaison à la paroi, LysM. Et à son extrémité C-terminale, Cse possède un domaine CHAP, présent dans les hydrolases du peptidoglycane. Dans cette étude, la localisation de Cse à la surface des cellules de S. thermophilus a été réalisée par microscopie électronique à transmission et immunofluorescence à l’aide d’anticorps dirigés contre cette protéine. Cse est localisée spécifiquement aux septa matures de S. thermophilus. De plus, l’activité de Cse a été démontré par zymogramme et présente une activité lytique qui est conférée par son domaine CHAP. L’analyse par RP-HPLC des muropeptides de la paroi de S. thermophilus après digestion avec le domaine CHAP a révélé que Cse est une hydrolase du peptidoglycane et plus précisément une endopeptidase. L’ensemble de ces résultats montre que Cse est l’enzyme majeure de la séparation cellulaire de S. thermophilus. / Streptococcus thermophilus is a lactic bacteria used a stater of fermentation in dairy factories for the production of yogurt and many cheeses. S. thermophilus grows as chains of ovoid cells. However, the genetic basis of S. thermophilus cell separation is still unknown. A S. thermophilus mutant displaying extremely long chains of cells was characterized and demonstrated to be impaired a gene that we named cse for cell separation. The originality of this gene is that cse creation resulted from domain shuffling. Indeed, the analysis has revealed that its 5’extremity has homology with that of sip from S. salivarius, while its 3’extremity shares homology with pcsB from S. thermophilus.The cse gene specific from S. thermophilus, encodes a modular protein. The N-terminal end of Cse contains a secretion signal and cell-wall binding LysM domain. Its C-terminal end includes a CHAP domain found in bacterial cell-wall hydrolases. In this study, the localization of Cse on S. thermophilus cell surface has been undertaken by immunogold electron and immunofluorescence microscopies using of antibodies raised against this protein. Immunolocalization shows that the presence of the Cse protein at mature septa. Moreover, the CHAP domain of Cse exhibits a lytic activity on the cell wall of S. thermophilus that has been demonstrated by zymogram. Additionally, RP-HPLC analysis of muropeptides released from S. thermophilus after digestion with the CHAP domain shows that Cse is a cell wall hydrolase that can function as an endopeptidase. Alltogether, these results suggest that Cse is a major cell wall hydrolase involved in daughter cell separation of S. thermophilus.

La transmission des virus grippaux de type A s’effectue via l’eau, l’air ou les surfaces. Elle implique donc toujours une étape dans l’environnement, durant laquelle les virus sont inactivés plus ou moins rapidement en fonction du sous-type ou de la souche virale analysés. Cependant, à ce jour, les facteurs moléculaires déterminant la stabilité des particules virales en dehors de l’hôte restent largement méconnus. Dans le but d’identifier ces déterminants, nous avons généré différentes combinaisons de réassortiments entre deux virus grippaux de sous-types H1N1 possédant un phénotype de stabilité différent. Les stabilités respectives de ces virus réassortants ont été évaluées dans un environnement-modèle, puis comparées entre elles. Pour cela, nous avons utilisé un système d’analyse en temps réel des cultures cellulaires, permettant de calculer, pour chacun des virus testés, une pente d’inactivation moyenne et, in fine, de mesurer l’influence respective de chacun des segments viraux sur le phénotype de stabilité des virus. D’après nos résultats, le phénotype de stabilité des virus grippaux est majoritairement déterminé par l’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA), qui sont les principales glycoprotéines de surface de ces virus. De plus, nous avons identifié des changements d’acides aminés dans la HA et dans la NA, qui ont pour effet une diminution ou une augmentation de la stabilité des particules virales dans l’environnement. Nous avons également montré qu’un virus avec un gène de la HA codons-optimisés, et donc porteur de mutations synonymes, suffit pour augmenter significativement la stabilité des particules virales dans l’environnement. La stabilité de la HA à pH acide, le taux d’expression de la HA dans les cellules infectées, et le nombre de sites de fixation aux ions calcium dans la NA sont modifiés par les mutations décrites dans cette étude, et sont donc des facteurs de stabilité des particules virales. De plus, une analyse en microscopie a permis de montrer que les virus inactivés dans l’environnement peuvent fixer leurs récepteurs cellulaires, mais sont incompétents pour induire l’étape de fusion dans l’endosome nécessaire à l’entrée des virus dans la cellule. Ces deux étapes du cycle viral sont dépendantes de la HA. Dans l’ensemble, nos résultats montrent l’importance de la HA et de la NA des virus grippaux dans la détermination du phénotype de stabilité des virus grippaux dans l’environnement. Par conséquent, la diversité connue des HA et NA dans la nature laisse supposer des variations fréquentes du phénotype de stabilité de ces virus. Leur étude pourrait permettre de mieux décrire l’écologie et l’épidémiologie de ces virus. L’analyse des données épidémiologiques et climatiques des épidémies de grippe saisonnière, sur 5 ans et dans 13 pays, a ainsi révélé une différence de distribution des virus H1N1 et H3N2, en fonction de la température hebdomadaire dans ces pays. La comparaison de la stabilité de ces virus sur des surfaces, à 4 °C et à 20 °C, suggère que la distribution des sous-types viraux au début des épidémies est en partie régulée par leur stabilité en fonction de la température / The transmission of Influenza A viruses (IAV), either airborne in mammals or oro-faecal in aquatic birds, submits viral particle to a wide range of environmental conditions. These environmental conditions modulate IAV survival outside the host, which is also dependent on the viral subtype or strains. To date, the molecular drivers of IAV environmental persistence remain to be identified. In order to identify IAV molecular drivers of the environmental persistence, we generated different reassortant viruses between two H1N1 viruses that do not have the same stability outside the host. To this purpose, we performed survival kinetic and compared the inactivation slope of generated reassortant viruses in our controlledenvironment, using a real time cell analysis system. Our results demonstrate that the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA) are the main viral segments driving IAV environmental persistence. In addition, mutations driving viral stability in the environment were identified in the HA and NA amino-acid sequences. We also demonstrated that synonymous mutations introduced in the HA, using a codon-optimization strategy, drive the environmental persistence of IAV. The HA stability at low pH, HA surface expression levels in infected cells and the number of calcium binding sites of the NA were alternately changed by the mutations described in our study, indicating that these are stability determinants of IAV survival outside the host. Then, the sequential events of viral entry were analysed with fluorescence microscopy assays, showing that viral particles being exposed for a long period in saline water at 35°C are still able to bind their cellular receptor whereas the HA-mediated fusion within the endosome is not possible anymore. These two steps of the viral cycle are mainly mediated by the HA protein. Altogether, these result highlight the importance of the HA and the NA proteins, driving the environmental persistence of IAV. Given the known diversity of these two proteins in nature, this arouses interest in studying IAV environmental persistence at a more global scale. Such study could improve our knowledge on IAV ecology and epidemiology. Epidemiologic and climatic data analyse of human seasonal influenza viruses during 5 years and from 13 countries revealed that H1N1 virus and H3N2 virus distribution differs according to the mean weekly temperature in these countries. We then compared the H1N1 virus and H3N2 virus persistence on stainless steel surface at 4 °C and 20 °C, and the preliminary results suggest that IAV seasonal subtypes distribution might be partly regulated by their stability according to the temperature

La grippe, infection respiratoire virale fréquente, est due aux virus Influenza. Leur génome est constitué par huit molécules d'ARN de polarité négative retrouvés sous la forme de complexe ribonucléique (RNPv). Au cours du cycle viral, il a été démontré que les régions terminales des segments de gène étaient cruciales pour l'incorporation sélective des huit RNPv à l'intérieur des particules virales. Par des techniques d'interaction in vitro et de tomographie électronique, nous avons montré que les segments de gène du virus H3N2 interagissaient entre eux par des interactions ARN/ARN impliquant leurs régions de packaging. Nos résultats suggèrent que la mise en place de ce réseau permettrait la formation d'un complexe supra macromoléculaire multi-segmenté permettant l'incorporation d'un jeu complet des huit RNPv dans les particules virales néosynthetisées. En raison de la nature segmentée du génome viral, des phénomènes de réassortiment génétique peuvent avoir lieu lors d'une co-infection. Afin de définir les mécanismes responsables de la restriction observée lors de ce phénomène, nous avons évalué le taux de réassortiment génétique in vitro entre le virus humain H3N2 et le virus aviaire H5N2. Nos résultats suggèrent que le mécanisme gouvernant l'incorporation sélective des segments de gènes, régulerait le réassortiment génétique. Nous avons montré que la modulation de l'interaction ARN/ARN entre les segments de gènes HA et M permet d'augmenter le taux d'incorporation du segment de gène HA H5 dans le fond génétique du virus humain, prérequis pour l'émergence de virus pandémique

A ce jour, les données génétiques et moléculaires se rapportant aux virus influenza de type A (VIs) présents dans la population porcine au Québec sont relativement rares. Pourtant, ces informations sont essentielles pour la compréhension de de l'évolution des VIs à grande échelle de 2011 à 2015. Afin de remédier à ce manque de données, différents échantillons (pulmonaires, salivaires et nasaux) ont été prélevés à partir de 24 foyers dans lesquelles les animaux présentaient des signes cliniques. Ensuite, les souches virales ont été isolées en culture cellulaire (MDCK) ou sur oeufs embryonnés. Les 8 segments génomiques des VIs de 18 souches virales ont par la suite été séquencés et analysés intégralement. La résistance aux drogues antivirales telles que l’oseltamivir (GS4071) carboxylate, le zanamivir (GS167) et l’amantadine hydrochloride a également été évaluée par des tests d'inhibition de la neuraminidase (INAs) ainsi que par un test de réduction sur plaque. Deux sous-types viraux H3N2 et H1N1 ont été identifiés dans la population porcine au Québec. Douze souches des VIs de sous-type trH3N2 ont été génétiquement liées au Cluster IV, avec au moins 6 profils de réassortiment différents. D'autre part, 6 souches virales ont été trouvées génétiquement liées au virus pandémique A(H1N1)pdm09 avec au moins trois profils de réassortiment génétique différents. Le sous-type trH3N2 des VIs est le plus répandu dans la population porcine au Québec (66,7%). La cartographie d'épitope de la protéine HA de sous-type H3 a présenté la plus forte variabilité avec 21 substitutions d’acides aminés sur 5 sites antigéniques A (5), B (8), C (5), D (1), et E (2). Toutefois, la protéine HA du sous-type H1 avait seulement 5 substitutions d'aa sur les 3 sites antigéniques Sb (1), Ca1 (2) et Ca2 (2). Un isolat H1N1 (1/6 = 16,7%) et 1 autre trH3N2 (1/12 = 8,3%) ont été trouvés comme étant résistants à l'oseltamivir. En revanche, 2 isolats du H1N1 (2/6 = 33,3%) et 2 autres du trH3N2 (2/12 = 16,7%) ont révélé être résistants au zanamivir. Dans l'ensemble, le taux de résistance aux INAs et à l’amantadine était compris entre 33,3% et 100%. La présence des VIs résistants aux drogues antivirales chez les porcs ainsi que l'émergence possible de nouvelles souches virales constituent des préoccupations majeures en la santé publique et animale justifiant ainsi la surveillance continue des VIs dans la population porcine au Québec. / Data about genomic variability of swine influenza A viruses (SIV) in Quebec herds are scarce. Yet, this information is important for understanding virus evolution in Quebec from until 2015. Different clinical samples were obtained from 24 outbreaks of swine flu in which animals were experiencing respiratory disease. Samples including lung tissues, saliva and nasal swabs were collected and virus isolation was attempted in MDCK cells and embryonated eggs. All eight gene segments of the 18 isolated SIV strains were sequenced and analysed. Antiviral drugs resistance against oseltamivir carboxylate (GS4071), zanamivir (GS167) and amantadine hydrochloride was evaluated by neuraminidase inhibition assays (NAIs) and plaque reduction assay. Two subtypes of SIV, H3N2 and H1N1, were identified in Quebec pig herds. Twelve SIV strains were genetically related to trH3N2 Cluster IV and at least 6 different reassortment profiles were identified. On the other hand, 6 Quebec SIV strains were found to be genetically related to the pandemic virus A(H1N1)pdm09 and from which three reassortment profiles were identified. Overall, the trH3N2 was the most prevalent subtype (66.7%) found in Quebec swine herds. The epitope mapping of HA indicated that the H3 subtype was the most variable with a possibility of 21 amino acids (aa) substitutions within the 5 antigenic sites A(5), B(8), C(5), D(1) and E(2). However, the HA protein of the H1 subtype had only 5 aa substitutions within 3 antigenic sites Sb(1), Ca1(2) and Ca2(2). One H1N1 (1/6 = 16.7%) and one trH3N2 (1/12 = 8.3%) were identified as strains resistant against oseltamivir. In contrast, two H1N1 (2/6 = 33.3%) and two trH3N2 (2/12 = 16.7%) strains were found to be resistant against zanamivir. Overall, the SIV resistance against antiviral neuraminidase inhibitor drugs was (33.3%). All strains were resistant against the M2 inhibitor antiviral drug, amantadine. The presence of antiviral drug resistance in Quebec swine herds and the possible emergence of new SIVs strains are public health concerns supporting the surveillance of SIVs.

Dans le contexte de la menace pandémique liée au virus influenza A(H5N1), un projet «GRIPPE AVIAIRE ET GRIPPE PANDÉMIQUE » a émergé au sein de LyonBioPôle avec comme objectif le développement d’outils de caractérisation des virus influenza pour la production de vaccins. Pour étudier le réassortiment génétique entre virus influenza, nous avons développé 3 systèmes de génétique inverse : virus humain A(H3N2) et aviaires A(H5N2) et A(H5N1) et produit des virus réassortants de composition déterminée. Leurs capacités réplicatives ont été évaluées par cinétiques de croissance virale sur MDCK avec quantification de la production virale par qRT-PCR temps réel. L’émergence du virus influenza A(H1N1)2009 pose deux questions sur l’acquisition par réassortiment génétique, d’une résistance à l’oseltamivir d’une part ou de facteurs de virulence d’autre part. Nous avons donc développé un protocole de co-infection virale de cellules MDCK pour étudier les constellations de gènes des réassortants entre différents virus: A(H1N1)2009-A(H1N1) H275Y et A(H1N1)2009-A(H5N1). Nous montrons par deux approches différentes, génétique inverse et co-infections virales, que le réassortiment génétique entre souches aviaires et humaines et surtout aviaires et porcines est possible, en privilégiant certaines constellations. Nous rapportons que le virus pandémique peut acquérir la NA H275Y des virus A(H1N1) Brisbane-like résistants à l’oseltamivir sans que ses capacités de réplication ne soient altérées. De même nous montrons que son réassortiment avec un virus hautement pathogène A(H5N1) est possible. Ces observations renforcent la nécessité de promouvoir la vaccination afin de limiter les risques de co-infection virale chez un même individu. / In the context of A(H5N1) pandemics threat, an « avian flu and flu pandemics » project was proposed by LyonBioPole to develop influenza viruses characterization tools for vaccine production. To study genetic reassortment between influenza viruses, 3 reverse genetic systems of A(H3N2) human virus and A(H5N2) and A(H5N1) avian viruses were developed and reassortant viruses were produced. Their replicative capacities were evaluated using growth kinetics on MDCK cells with viral production quantification by real-time qRT-PCR. The A(H1N1)2009 emergence raises two questions about the acquisition by genetic reassortment of oseltamivir resistance and/or pathogenicity determinants. A co-infection protocol on MDCK cells was developed to study gene constellations of reassortant viruses like A(H1N1)2009-A(H1N1) H275Y and A(H1N1)2009-A(H5N1). We report here that genetic reassortment is possible between avian, human and swine strains using reverse genetic and viral co-infection and that some specific constellations emerged. We also report, that pandemic A(H1N1)2009 can acquire the H275Y mutated NA from seasonal oseltamivir resistant A(H1N1) viruses without any modifications on replicative capacities. This genetic reassortment is also possible with A(H5N1) viruses. These observations strenght the importance of vaccination against all these influenza strains to reduce the risk of one-individual viral co-infection.

Dans le contexte de la menace pandémique liée au virus influenza A(H5N1), un projet "GRIPPE AVIAIRE ET GRIPPE PANDÉMIQUE " a émergé au sein de LyonBioPôle avec comme objectif le développement d'outils de caractérisation des virus influenza pour la production de vaccins. Pour étudier le réassortiment génétique entre virus influenza, nous avons développé 3 systèmes de génétique inverse : virus humain A(H3N2) et aviaires A(H5N2) et A(H5N1) et produit des virus réassortants de composition déterminée. Leurs capacités réplicatives ont été évaluées par cinétiques de croissance virale sur MDCK avec quantification de la production virale par qRT-PCR temps réel. L'émergence du virus influenza A(H1N1)2009 pose deux questions sur l'acquisition par réassortiment génétique, d'une résistance à l'oseltamivir d'une part ou de facteurs de virulence d'autre part. Nous avons donc développé un protocole de co-infection virale de cellules MDCK pour étudier les constellations de gènes des réassortants entre différents virus: A(H1N1)2009-A(H1N1) H275Y et A(H1N1)2009-A(H5N1). Nous montrons par deux approches différentes, génétique inverse et co-infections virales, que le réassortiment génétique entre souches aviaires et humaines et surtout aviaires et porcines est possible, en privilégiant certaines constellations. Nous rapportons que le virus pandémique peut acquérir la NA H275Y des virus A(H1N1) Brisbane-like résistants à l'oseltamivir sans que ses capacités de réplication ne soient altérées. De même nous montrons que son réassortiment avec un virus hautement pathogène A(H5N1) est possible. Ces observations renforcent la nécessité de promouvoir la vaccination afin de limiter les risques de co-infection virale chez un même individu.

La grippe, infection respiratoire virale fréquente, est due aux virus Influenza. Leur génome est constitué par huit molécules d’ARN de polarité négative retrouvés sous la forme de complexe ribonucléique (RNPv). Au cours du cycle viral, il a été démontré que les régions terminales des segments de gène étaient cruciales pour l’incorporation sélective des huit RNPv à l’intérieur des particules virales. Par des techniques d’interaction in vitro et de tomographie électronique, nous avons montré que les segments de gène du virus H3N2 interagissaient entre eux par des interactions ARN/ARN impliquant leurs régions de packaging. Nos résultats suggèrent que la mise en place de ce réseau permettrait la formation d’un complexe supra macromoléculaire multi-segmenté permettant l’incorporation d’un jeu complet des huit RNPv dans les particules virales néosynthetisées. En raison de la nature segmentée du génome viral, des phénomènes de réassortiment génétique peuvent avoir lieu lors d’une co-infection. Afin de définir les mécanismes responsables de la restriction observée lors de ce phénomène, nous avons évalué le taux de réassortiment génétique in vitro entre le virus humain H3N2 et le virus aviaire H5N2. Nos résultats suggèrent que le mécanisme gouvernant l’incorporation sélective des segments de gènes, régulerait le réassortiment génétique. Nous avons montré que la modulation de l’interaction ARN/ARN entre les segments de gènes HA et M permet d’augmenter le taux d’incorporation du segment de gène HA H5 dans le fond génétique du virus humain, prérequis pour l’émergence de virus pandémique / The Flu is a frequent viral infectious disease caused by the Influenza viruses. Their genomes are composed by eight negative single-stranded RNA organised as vRNPs. During the viral cycle, the terminal non-coding and coding regions of viral genome have been shown to be crucial for the selective incorporation of a complete set of the eight vRNPs into influenza viral particles. Band shift assay and electron tomography allowed us to show that all gene segments interact together by RNA/RNA interactions involving their packaging region. Our results suggest that the eight genomic vRNAs are selected and packaged as an organized supramolecular complex held together between identified packaging regions into neosynthesized virions. Due to genome segmented nature, genetic reassortment can occur during co-infection. In order to identify molecular mechanisms responsible for the observed restriction during the genetic reassortment, we have developed a new competitive reverse genetic strategy allowing us to evaluate the genetic reassortment between H3N2 and H5N2 viruses. Our results suggest that mechanism controlling the packaging should regulate genetic reassortment. We have shown that the modulation of RNA/RNA interaction between HA and M gene segment have allowed us to increase HA H5 gene segment incorporation rate into a viral human genetic background, prerequisite for pandemic virus emergency

Le génome des virus influenza de type A est composé de huit segments de gènes (ARNv) de polarité négative retrouvés sous la forme de complexes ribonucléiques (RNPv). L'incorporation sélective des huit RNPv dans les particules virales néosynthétisées se fait par un mécanisme moléculaire qui fait intervenir des signaux d'encapsidation dites « région de packaging ». Nous avons montré que les segments de gènes interagissaient entre eux via des interactions de type ARN/ARN permettant la formation d'un réseau d'interactions. Nous avons de plus montré que les régions de packaging décrites dans la littérature semblent héberger les régions impliquées dans la mise en place du réseau d'interactions. Cette étude a été réalisée pour le virus humain H3N2 et le virus aviaire H5N2. Le mécanisme d'incorporation sélective des segments de gènes semble également réguler le réassortiment génétique, processus génétique responsable de l'émergence de virus réassortants. Nous avons montré qu'une restriction génomique impliquant les régions de packaging semble être responsable du taux de réassortiment génétique faible observé in-vitro et in-vivo. La modulation du réseau d'interactions ARN/ARN semble être nécessaire pour l'incorporation de segments aviaire dans le fond génétique du virus humain. Pour finir, nous avons montré que la composition génomique des virus réassortants vaccinaux joue un rôle central dans la réplication virale et dans la production des antigènes vaccinaux. Par une stratégie de cryo-microscopie, nous avons montré que la protéine PB1 joue un rôle central dans l'optimisation de la production des antigènes de surface / The genome of the influenza A virus (IAV) comprises eight single-stranded negativesense RNA segments (vRNAs). All eight vRNAs are selectively packaged into each progeny virion via packaging signal sequences that are located at both ends of the vRNAs. How these signals ensure packaging of all eight vRNAs remains unclear. It was hypothesized that selective packaging might be driven by direct interactions between vRNAs. Combination of biochemical and reverse genetic approaches allowed us to identify short nucleotide regions on vRNAs interacting with each other in vitro. Here, we demonstrated the importance of these interactions in the packaging process of the human H3N2 and avian H5N2 viral genomes. Furthermore, our results suggest that the packaging process could regulate genetic reassortment. Indeed, we observed that the genetic reassortment between H3N2 and H5N2 viruses is restricted as the avian vRNA HA cannot be incorporated into the human genetic background. Our investigations indicated that (i) the packaging signals are crucial for genetic reassortment and (ii) the modulation of the vRNAs interaction network may be required for the incorporation of the avian HA gene into the human genetic background. Characterization of seed viruses showed that the genetic composition is important for both high growth ability and antigen production. Indeed, cryo-electronic microscopy observations of reassortant virus indicated that the PB1 gene can strongly influence the antigen glycoprotein spike density