Les cellules Natural Killer (NK) sont des effecteurs de l’immunité innée et constituent de véritables sentinelles dans l’immuno-surveillance contre les virus et les processus tumoraux. Pour échapper à la reconnaissance NK, les virus ainsi que les cellules tumorales utilisent de nombreux subterfuges. Au cours de ce travail, nous nous sommes intéressés à deux facteurs régulateurs de la fonction des cellules NK, la molécule PD-1 et la prostaglandine E2 (PGE2). Programmed death 1 (PD-1) est une molécule régulatrice exprimée sur les lymphocytes T et B activés. L’engagement de PD-1 par ses ligands inhibe leurs fonctions effectrices et prolifératives. Au cours de certaines infections virales chroniques ou de tumeurs, l’expression de PD-1 est associée à l'épuisement fonctionnel des lymphocytes T effecteurs. Le blocage de l’axe PD-1/PD-1 ligands restaure les fonctions effectrices des lymphocytes et représente ainsi une approche thérapeutique prometteuse. Nous avons mis en évidence de manière fortuite une expression inhabituelle du récepteur PD-1 sur les cellules NK au cours de certaines infections virales chroniques (HHV8, VIH ou VHC). L’expression de PD-1 sur les cellules NK caractérise une population récemment activée (CD69++, CD25 + et Nkp44 +), susceptible à l’apoptose (Annexin V+), exprimant une moindre quantité du récepteur de cytotoxicité naturelle NKp46. L’analyse fonctionnelle montre que les cellules NK PD-1+ ont des capacités de cytotoxicité (dégranulation CD107a) et de production de cytokines (IFNγ) réduites en comparaison avec leurs homologues PD-1-. De façon intéressante, l’IL-2 et l’IL-15 peuvent restaurer les fonctions effectrices des cellules NK PD-1+. Contrairement aux cellules T dont l’expression de PD-1 est induite par divers stimuli, seule la stimulation des récepteurs NKp46 et NKp30, en synergie avec l’action de l’IL-15 ou l’IL-2, induit in vitro de façon reproductible l’expression de PD-1 sur les cellules NK de témoins sains. Pour pouvoir disposer d’un modèle in vitro de cellules NK PD-1+, nous avons généré des cellules exprimant PD-1 de manière stable par transduction lentivirale de la lignée NKL. En comparaison avec les cellules transduites par le vecteur vide, les cellules NKL PD-1+ ont des capacités cytotoxiques réduites, confirmant nos résultats chez les patients. Nous avons aussi étudié les mécanismes par lesquels la PGE2, une autre molécule immuno-modularice, régule les fonctions des cellules NK. Nos résultats suggèrent que la PGE2 agit à travers ses récepteurs EP2 et EP4 pour inhiber l’expression de NKG2D et de l’IL-15Rγ induite par l’IL-15 sur les cellules NK. Ce travail doit nous permettre de mieux comprendre comment la PGE2 s’oppose aux effets activateurs de l’IL-15 sur les cellules NK, et représente un mécanisme de rétrocontrôle de l’inflammation. En conclusion, nos résultats montrent que l’expression de PD-1 sur les cellules NK représente un mécanisme supplémentaire d’échappement viral à la réponse immune. La suite de l’étude sur la PGE2 devrait nous permettre d’évaluer l’intérêt de l’utilisation d’antagonistes spécifiques dans l’immunothérapie anti-tumorale par l’IL-15. Le lien entre la PGE2 et l’expression de PD-1 sur les cellules NK est en cours d’investigation. / Natural Killer (NK) cells are effectors of the innate immune system, and play a crucial role in virus and cancer immunesurveillance. To escape NK-cell mediated elimination of infected or transformed cells, viruses and tumors have developed multiple strategies to interfere with NK-cell functions. In the present study, we investigated the role of two regulatory molecules, Programmed Death-1 (PD-1) and Prostaglandine E2 (PGE2), in controlling NK cell activation and effector functions. PD-1 is a key immune checkpoint receptor expressed by activated T and B lymphocytes. Upon interaction with its cognate ligands, PD-1 inhibits lymphocyte proliferation and functions. During cancer or chronic viral infections, PD-1 expression is associated with functional exhaustion of effector T cells. Blockade of PD-1 signaling restores T-cell functions, and represents a promising therapeutic tool. We fortuitously observed unusual expression of PD-1 on a subset of CD56dim NK cells in some patients with persistent viral infection (HHV8, HIV or HCV). We show that PD-1 expression on NK cells characterizes a subpopulation of recently activated cells (CD69+, CD25+, Nkp44+) that are sensitive to apoptosis (Annexin V+) and not senescent (CD57-). NKp46 expression was also markedly decreased on PD-1+ NK cells. In vitro functional experiments showed that PD-1+ NK cells had impaired cytotoxic capacity (CD107a degranulation) and reduced IFN-γ production compared to their PD-1- counterpart, suggesting that they might represent functionally exhausted NK cells. Interestingly, exogenous IL-2 and IL-15 could restore PD-1+ NK cell effector functions. While strong non-specific stimulation by PMA/ionomycin transiently induced PD-1 on control NK cells, only activation through NKp46 or NKp30 receptors in the presence of IL-15 could reproducibly induce stable PD-1 expression. To investigate the effect of PD-1 expression on NK cells in the absence of any confounding factor related to the underlying disease, we generated NK cells stably expressing PD-1 after lentiviral transduction. Compared to NK cells transduced with the control vector, PD-1+ cells showed a constitutively decreased CD107a degranulation, thus confirming our findings in NK cells from infected patients. In the second part of this study, we investigated the immunosuppressive role of PGE2 in the control of IL-15-mediated NK cell activation. Our results suggest that PGE2 acts through EP2 and EP4 receptors to inhibit IL-15 induced NKG2D and IL-15Rγ expression on NK cells. These findings allow a better comprehension of PGE2/IL-15 antagonism in the regulation of NK cell responses. In conclusion, our results indicate that PD-1 expression on NK cells could represent a supplementary mechanism of immune evasion strategy, and allow introducing the concept of exhausted NK cells, similar to exhausted PD-1+ T cells. Our results also demonstrate that PGE2 exerts a negative feedback on IL-15-mediated effects on NK cells. Blocking PGE2 or its receptors could be of interest in IL-15 tumor immunotherapy to potentiate IL-15-induced cytotoxic functions of NK cells.

Introduction. La toxoplasmose oculaire (TO) est la première cause d'uvéite postérieure. L'évolution de cette pathologie dépend d'une balance entre la régulation de la réponse immunitaire et la limitation de la prolifération parasitaire.Méthodes. Le but de nos travaux est de déterminer le spectre des cytokines dans l'humeur aqueuse de patients une To ou une autre inflammation intraoculaire (uvéite d'étiologies virales ou secondaires à des maladies inflammatoires systémiques et endophtalmie bactérienne). Pour mieux appréhender les mécanismes immunitaires mis en jeu lors d'une TO, des dosages de transcrits par RT-PCR et de protéines inflammatoires par immunoessaimultiplexe sont réalisés à partir de modèles murins de TO. Enfin, l'effet de l'injection intraoculaire d'anticorps (AC) anti-IL-17A sur l'inflammation intraoculaire et la prolifération parasitaire est étudié.Résultats. Les spectres de cytokines observés dans l'humeur aqueuse diffèrent nettement en fonction de la cause de l'inflammation. Plus particulièrement, IL-17A semble jouer un rôle primordial dans la pathogénicité de la TO humaine et murine. Chez la souris infectée, l'inflammation intraoculaire et le nombre de parasites intraoculaires sont diminués parl'administration d'AC anti-IL-17A. Les niveaux d'ARNm de T-bet et Foxp3, ainsi que la concentration en IFN-γ (marqueurs de l'immunité cellulaire de type Th1 et Treg), sont augmentés après l'injection d'AC anti-IL-17A.Discussion. Les AC anti-IL-17A modèrent la réponse inflammatoire intraoculaire et limitent la prolifération parasitaire en antagonisant les cellules Th17, probablement via l'induction des cellules Th1 et Treg, secrétant IL-10 et IL-27. Ces résultats préliminaires suggèrent une nouvelle approche thérapeutique in vivo lors d'une toxoplasmose oculaire.

Introduction. La toxoplasmose oculaire (TO) est la première cause d’uvéite postérieure. L’évolution de cette pathologie dépend d’une balance entre la régulation de la réponse immunitaire et la limitation de la prolifération parasitaire.Méthodes. Le but de nos travaux est de déterminer le spectre des cytokines dans l’humeur aqueuse de patients une To ou une autre inflammation intraoculaire (uvéite d’étiologies virales ou secondaires à des maladies inflammatoires systémiques et endophtalmie bactérienne). Pour mieux appréhender les mécanismes immunitaires mis en jeu lors d’une TO, des dosages de transcrits par RT-PCR et de protéines inflammatoires par immunoessaimultiplexe sont réalisés à partir de modèles murins de TO. Enfin, l’effet de l’injection intraoculaire d’anticorps (AC) anti-IL-17A sur l’inflammation intraoculaire et la prolifération parasitaire est étudié.Résultats. Les spectres de cytokines observés dans l’humeur aqueuse diffèrent nettement en fonction de la cause de l’inflammation. Plus particulièrement, IL-17A semble jouer un rôle primordial dans la pathogénicité de la TO humaine et murine. Chez la souris infectée, l’inflammation intraoculaire et le nombre de parasites intraoculaires sont diminués parl’administration d’AC anti-IL-17A. Les niveaux d’ARNm de T-bet et Foxp3, ainsi que la concentration en IFN-γ (marqueurs de l’immunité cellulaire de type Th1 et Treg), sont augmentés après l’injection d’AC anti-IL-17A.Discussion. Les AC anti-IL-17A modèrent la réponse inflammatoire intraoculaire et limitent la prolifération parasitaire en antagonisant les cellules Th17, probablement via l’induction des cellules Th1 et Treg, secrétant IL-10 et IL-27. Ces résultats préliminaires suggèrent une nouvelle approche thérapeutique in vivo lors d’une toxoplasmose oculaire. / Purpose. Toxoplasmosis is the most common cause of posterior uveitis in immunocompetent subjects. Taking into account the opposing needs of limiting parasite multiplication and minimizing tissue destruction, the immune imbalance implies especially Th17 and T regulatory (Treg) cells.Methods. In a prospective clinical study of acute intraocular inflammation including ocular toxoplasmosis, viral uveitis, systemic inflammatory disease related uveitis and bacterial endophthalmitis we evaluated the cytokine pattern in aqueous humors of affected patients. To further study the immunological mechanisms involved during ocular toxoplasmosis, weevaluated the intraocular inflammation, the parasite load and the immunological response characterized on mRNA and protein level in a mouse model. To evaluate the role of IL-17A, anti IL-17A monoclonal antibodies (mAbs) were administered concomitantly with the parasite.Results. Cytokines networks are different, depending on the cause of intraocular inflammation. In OT, we observed severe ocular inflammation and cytokine patterns comparable to human cases, including IL-17A production. Neutralizing IL-17A decreased intraocular inflammation and parasite load in mice. Detailed studies revealed upregulation of Treg and Th1 pathways. When IFN-γ was neutralized concomitantly, the initial parasite multiplication rate was partially restored.Conclusions. Local IL-17A production plays a central role in pathology of OT. The balance of Th17 and Th1 responses (especially IFN-γ) is crucial for the outcome of infection. These data open new in vivo therapeutic approaches by repressing inflammatory pathways using intravitreal injection of IL-17A mAbs.