Les arbovirus sont un groupe de virus transmis par des vecteurs arthropodes contaminant chaque année plusieurs centaines de millions de personnes à travers le monde. De nombreux facteurs environnementaux, comme les xénobiotiques peuvent influencer la propagation des infections virales, la susceptibilité de l'hôte et la sévérité de l'infection. Parmi eux, le cadmium, métal toxique est connu pour moduler la résistance de l'hôte lors des infections par les arbovirus. Ces travaux de thèse se sont portés sur l'étude de l'alphavirus Sindbis et du flavivirus Zika infectant des cellules épithéliales humaines. Les résultats de cette thèse ont permis de démontrer que les cellules A549 étaient permissives à la souche épidémique de 2013 du virus Zika. Le virus se réplique efficacement et induit une apoptose de type mitochondriale dans les cellules A549. La réponse immunitaire innée des cellules a été caractérisée et le rôle des interférons de type I a été mis en avant. Ces résultats peuvent contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes de pathogénicité de ce virus chez l'homme. Par la suite, les effets d'une exposition au cadmium lors des infections par les virus Sindbis et Zika ont été évalués. L'infection par le virus Zika n'a pas été modulée par l'exposition au cadmium in vitro. Mais de façon surprenante dans le cas de l'infection des cellules HEK 293, le cadmium a protégé les cellules des effets cytopathiques induits par le virus Sindbis. En présence de cadmium, l'apoptose induite par le virus a été inhibée et la réplication du virus Sindbis a été réduite. / Arboviruses are a group of viruses transmitted by arthropod vectors infecting hundreds of millions of people each year worldwide. Many environmental factors including xenobiotics can influence the spread, the susceptibility and the outcome of viral infections. Among them, cadmium, a toxic metal is known to affect the host resistance against arboviral infection. In this thesis, our work has been focused on studying the infection capability of the Sindbis alphavirus and the Zika flavivirus in human epithelial cells. The results demonstrated that A549 cells was permissive to the 2013 epidemic strain of Zika virus. The virus replicates efficiently leading to mitochondrial apoptosis. The innate immune response was characterized and the crucial role of type I interferon was highlighted. These results may contribute to a better understanding of Zika virus pathogenesis in humans. Thereafter, the effects of cadmium exposure on Sindbis virus and Zika virus infection was evaluated. Zika virus infection was not modulated by cadmium in vitro. Interestingly, cadmium protected the HEK 293 cells from the cytopathic effect induced by Sindbis virus. Cadmium exposure inhibited the apoptosis and reduced the viral replication.

La vaccination est considérée comme l’un des plus grandes découvertes de l’histoire des maladies infectieuses, ayant permis le déclin et l’éradication de plusieurs pathogènes. Cependant, nous ignorons encore tous les mécanismes impliqués dans la protection contre les pathogènes. Cette méconnaissance est la cause de notre incapacité à formuler des nouveaux vaccins contre le VIH, la tuberculose, le paludisme et les pathogènes émergents. Récemment, on note des efforts pour induire une réponse cellulaire efficace après une vaccination, qui joue un rôle crucial dans la clairance des pathogènes.Cette thèse s’appuie sur un modèle de vaccin vivant atténue issu du virus de la vaccine : le MVA (Modified Vaccinia Ankara) et sur le modèle de primate non-humain. Nous avons caractérisé la réponse cellulaire après une immunisation intradermique suivant un schéma en prime-boost homologue, avec un boost à 2, suivi d’un boost à 9 mois. Le MVA a induit une infiltration massive de Lymphocytes T CD8 au niveau du site d’injection, 7 jours après l’immunisation. La réponse cellulaire systémique était modérée et ne reflétait pas l’amplitude de la réponse locale. Les injections du prime et du boost ont orienté la réponse cellulaire de façon différente, ce qui a mené à une importante induction de cellules T CD4 et CD8, persistantes, spécifiques de l’antigène et polyfonctionnelles après l’injection du boost à 9 mois.Cette étude souligne la différence entre les réponses systémiques et locales, démontrant l’importance de se focaliser sur la réponse tissulaire. Elle a également mis en lumière l’impact du schéma d’immunisation sur la qualité de la réponse cellulaire. / Vaccination has been considered as one of the greatest discoveries in the history of infectious diseases by allowing pathogens decline or eradication. However, we still ignore all the mechanism that lead to protection and therefore, fail to elaborate new vaccines against HIV, tuberculosis, malaria and emergent pathogens. Recently, efforts have been made to elicit effective cellular response after vaccination, which is crucial for pathogen clearance.This thesis relied on live-attenuated vaccine model derived from the vaccinia virus: the MVA (Modified Vaccinia Ankara) and a non-human primate model. We characterized the cellular immune response triggered by a homologous prime-boost intradermal injection of MVA, with a 2 months and 9 months boost. The MVA induced a massive infiltration of CD8 T cells at the injection site 7 days post immunization. In comparison, the systemic cellular response was mild and did not reflect the magnitude of the local response. The prime and boost injections elicited distinct orientation of the systemic and local T cells, which led to an important induction of a persistent, antigen-specific and polyfunctional CD8 and CD4 T cell responses after the 9 months boost.This work emphasizes the difference between local and systemic response, demonstrating the importance of the focus on tissue immunity. It also highlights the impact of the immunization schedule on the quality of the cellular response.

La maladie à coronavirus (COVID-19) est une infection virale hautement contagieuse causée par le virus SRAS-CoV-2. La maladie s’est rapidement propagée entrainant une épidémie mondiale, causant la mort des personnes à risque. De nombreuses mesures sanitaires ont été prises durant ces deux dernières années, cependant la maladie n’est pas encore éradiquée. Considérant l’importance du système immunitaire dans le contrôle des maladies infectieuses et dans l’induction d’une mémoire immunitaire de longue durée, le SRAS-CoV-2 pourrait être une cible du système immunitaire, en particulier du système adaptatif représenté par les lymphocytes B et T. La réponse humorale induite chez les personnes convalescentes est largement perçue comme étant efficace pour combattre le virus. Par conséquent, toutes les plateformes de vaccination actuelles se sont basées sur la réponse humorale induite, particulièrement par la protéine SPIKE du virus. Compte tenu de la variabilité des réponses humorales ainsi que leur déclin rapide observé chez certains patients, et l’émergence de variants, il est nécessaire d’inclure d’autres stratégies permettant de renforcer la réponse immunitaire. Nous avons émis l’hypothèse qu’une réponse cellulaire pouvait être induite par les lymphocytes T contre les différentes protéines virales du SRAS-CoV-2. Dans cette étude nous avons détecté la réactivité des lymphocytes T contre les protéines virales (SPIKE, membrane, nucléocapside) par ELISPOT chez les patients convalescents. Nous avons ensuite identifié plus précisément les séquences riches en épitopes au niveau de la protéine membranaire et de la nucléocapside en préparant des délétants successifs (approche « mRNA PCR-based epitope chase technique” ou mPec). La validation de ces séquences a été confirmée par l’utilisation de banques de peptides dans des zones définies, se chevauchant de 12 acides aminés. En vue d’inclure ces régions dans une stratégie vaccinale future, une protéine de fusion MN contenant les séquences riches en épitopes a été créée et la réactivité des lymphocytes T contre la protéine MN a été évaluée de nouveau par ELISPOT. Nos données démontrent une réponse T dirigée principalement contre la nucléocapside et la protéine membranaire. Trois zones immunogènes sont identifiées au niveau de la nucléocapside et une zone au niveau de la membrane. La réactivité observée contre la protéine de fusion MN souligne le potentiel pouvoir immunogène des protéines (membrane et nucléocapside) et l’importance d’inclure ces protéines dans une stratégie vaccinale future afin de solliciter une réponse immunitaire cellulaire protectrice. / Coronavirus disease (COVID-19) is a highly contagious viral infection caused by the SARS-CoV-2 virus. The disease has spread rapidly resulting in a worldwide epidemic, causing death in those at risk. Numerous health measures have been taken over the past two years, but the disease has not yet been eradicated. Considering the importance of the immune system in the control of infectious diseases and in the induction of a long-lasting immune memory, SARS-CoV-2 could be a target of the immune system, in particular of the adaptive system represented by B and T lymphocytes. The humoral response induced in convalescent individuals is widely used as an effective therapy to combat the virus. Therefore, all current vaccination platforms have relied on the humoral response induced particularly by the virus' SPIKE protein. Given the variability of humoral responses and their rapid decline in some patients, and the emergence of variants, it is necessary to include other strategies to enhance the immune response. We hypothesized that a cellular response could be induced by T cells against the different viral proteins of SARS-CoV-2. In this study, we detected the reactivity of T cells against viral proteins (SPIKE, membrane, nucleocapsid) by ELISPOT in convalescent patients. We then identified more precisely the immunogenic sequences at the level of the membrane protein and the nucleocapsid by successive deletants using the mRNA PCR-based epitope chase technique (mPec). The validation of these sequences was confirmed by the use of small peptide libraries (overlapping by 12 amino acids), covering defined sequences rich in epitopes. In order to include these regions in a future vaccine strategy, a MN fusion protein containing the selected sequences was created and T cell reactivity against the MN protein was further confirmed by ELISPOT. Our data show a T-cell response primarily against the nucleocapsid and membrane protein. Three immunogenic zones were identified at the nucleocapsid level and one zone at the membrane level. The reactivity observed against the MN fusion protein cassette rich in epitopes, highlights the potential immunogenicity of the proteins (membrane and nucleocapsid) and the importance of including these proteins in a future vaccine strategy.

Les pili de type IV (PT4), certainement les organelles les plus répandues des bactéries à Gram-négatif, sont des machineries à multiples fonctions qui jouent un rôle crucial dans la pathogenèse de nombreux pathogènes humains, notamment notre modèle Neisseria meningitidis. L’assemblage des PT4 nécessite une machinerie complexe incluant au moins vingt protéines localisées dans la membrane interne, le périplasme et la membrane externe. Certaines de ces protéines ne sont pas nécessaires pour la biosynthèse des PT4, mais supportent les fonctions qui leur sont associées. Ces protéines, appelées pilines mineures, sont au nombre de trois. Par l’analyse phénotypique des mutants dans les gènes codant pour les pilines mineures, le rôle de chacune a pu être déterminée. Ainsi la piline mineure ComP est nécessaire pour la compétence pour la transformation d’ADN, PilV est requise pour la déformation de la membrane plasmique de la cellule hôte et PilX est essentielle pour l’adhésion des bactéries sur les cellules épithéliales et endothéliales, la formation d’agrégats bactériens et la déformation de la membrane plasmique de la cellule hôte. De nombreuses similarités avec la piline majoritaire laissent penser que les pilines mineures s’insèrent dans la fibre des PT4 pour exercer leurs fonctions, bien que ceci n’a jamais été démontré. Si on connait bien les fonctions des pilines mineures, leur mode d’action n’est toujours pas compris. L’objectif global de ce travail de thèse a été de comprendre comment une fibre protéique peut assurer une diversité de fonctions aussi importante. Pour y parvenir, l’étude du mode d’action des pilines mineures a été entreprise. Contrairement à ce qui prévalait dans le modèle dominant, les pilines mineures PilV et PilX exercent leur fonction à partir de l’espace périplasmique pour moduler la quantité de pili exprimés en surface. En effet, les mutants pilV et pilX présentent respectivement des défauts de piliation de l’ordre de 39% et de 63% par rapport à la souche sauvage. Ces défauts expliquent cependant les phénotypes des mutants. En effet, l’ensemble des fonctions dépendantes des PT4 nécessite une forte quantité de PT4, soit au moins 40% pour l’agrégation et l’adhésion et 70% pour le déclenchement de la réponse cellulaire. Ces résultats révèlent que les pilines mineures sont impliquées dans la biogenèse des PT4 plutôt que dans le support biochimique direct de leurs propriétés. Le défaut de piliation de ces mutants est restauré par l’absence de rétraction, indiquant que les pilines mineures PilV et PilX jouent un rôle dans la stabilité des PT4. Nous avons également montré que la piline mineure ComP est nécessaire pour la piliation et qu’elle présente une fonction redondante avec la piline mineure PilV. Afin de comprendre comment les pilines mineures PilV et PilX exercent leur rôle sur la quantité de pili exprimés en surface, nous avons réalisé une étude structure/fonction de ces deux protéines. Nous avons observé une absence de piliation, en bloquant les pilines PilV et PilX dans la membrane interne, indiquant une interaction directe avec la machinerie des PT4 probablement via la piline majeure PilE. Nous avons également montré qu’il existe une interaction entre les pilines mineures et PilE au niveau de la membrane interne et en amont de l’assemblage des pili. Ces résultats, obtenus par une technique de pontage disulfure, ont cependant besoin d’être confirmés par des contrôles supplémentaires. Par une stratégie de mutagenèse, nous avons enfin mis en évidence que la région D de PilV et les boucles α/β et β2/β3 de PilX sont nécessaires à leur fonctionnement. Ces travaux ont permis de montrer que la quantité de pili exprimés par la bactérie est un facteur déterminant pour définir les propriétés des PT4. Les pilines mineures agissent au niveau du périplasme pour promouvoir la biosynthèse des pili, ce qui met en avant le rôle direct de la piline majeure PilE dans les fonctions associées aux PT4. / Type IV Pili (TFP) are widespread filamentous organelles extending from the surface of many Gram-negative bacteria that mediate multiple functions and play a key role in the pathogenesis of several important human pathogens, including our model, Neisseria meningitidis. The assembly of TFP requires a complex machinery composed by at least twenty proteins that are localized in the inner membrane, the outer membrane and the periplasm. Three of these proteins, called minor pilins, are not required for the biosynthesis of the TFP, but support their functions. Based on the phenotypes associated with the mutants, their role on TFP functions has been determined. The minor pilin Comp is required for natural competence for DNA transformation, PilV is required for the deformation of the host cell plasma membrane and PilX is essential for the adhesion of bacteria to epithelial and endothelial cells, the bacterial aggregation and the deformation of the host cell plasma membrane. Many similarities with the major pilin PilE suggests that minor pilin are inserted into the fiber of TFP to exert their functions, although it has never been demonstrated. How these proteins carry out their functions mechanistically is not elucidated. The general objective of this thesis was to understand how a single fiber can provide such a variety of functions. To achieve this, the study of the mode of action of minor pilins was undertaken. Contrarily to what has been previously proposed, the PilV and PilX minor pilins seem to exert their functions from the periplasmic space to modulate the amount of surface exposed pili. Indeed, pilV and pilX strains show piliation defects of 39 % and 63 % respectively compared to the wild type. Besides, we have shown that TFP functions require a large amount of TFP, at least 40 % for the aggregation and adhesion and 70% to induce the reorganization of the plasma membrane. Thus these modest decreases in the amount of pili explain the phenotypes of these mutants. These results indicate that the minor pilins are involved in the biogenesis of TFP rather than in the direct support of their biochemical properties. Moreover, the piliation defect of these mutants is restored in the absence of retraction, indicating that the PilV and PilX minor pilins play a role in the stability of TFP. To understand how PilV and PilX minor pilins modulate surface exposed pili level, we performed a structure/ function analysis of these two proteins. Blocking the PilV and PilX minor pilins in the inner membrane abolishes piliation, indicating a direct interaction with the machinery of TFP, probably via the major pilin PilE. We have also shown that an interaction between the minor pilins and the major pilin occurs in the inner membrane and upstream of the pilus assembly. However, these results, obtained by biochemical techniques, need to be confirmed by additional controls. By a mutagenesis strategy, we finally demonstrated that the D region of PilV and the α/β and β2/β3 loops of PilX are necessary for their functions. This study has shown that a relatively modest decrease in the amount of pili displayed on the bacterial surface leads to a strong effect on the functions carried by TFP. Minor pilins act in the periplasm to promote the biosynthesis of pili, which highlights the direct role of the major pilin in the TFP-dependent functions.

Un dispositif micro-irradiation par ions isolés a été développé au CENBG pour des applications en radiobiologie à l'échelle cellulaire. Cette installation consiste en un aménagement de la ligne microfaisceau préexistante qui permet déjà d'obtenir un faisceau de protons ou de particules alpha entre 1 et 3 MeV, de faible intensité, et d'une résolution spatiale sous vide inférieure au micromètre. La majeure partie de ce travail a consisté à développer un étage d'irradiation adaptable sur la microsonde et permettant de délivrer les ions à l'air avec une précision absolue de quelques micromètres. Un programme permettant le contrôle de la totalité des instruments ainsi que des phases d'étalonnage et d'irradiation automatiques a également été mis au point. Des outils de simulation Monte Carlo, nécessaires à la caractérisation et à l'optimisation du dispositif et notamment en terme de résolution spatiale, ont été validés à l'échelle du micromètre par comparaison à des résultats expérimentaux. Les performances du dispositif, notamment en terme de contrôle du nombre d'ions, de résolution spatiale et de précision d'irradiation ont été testées sous faisceau. Les résultats obtenus permettent d'envisager les premières applications dans des études de radiobiologie. Dans un futur proche cet outil va permettre l'étude des réponses cellulaires aux faibles doses, allant jusqu'au cas extrême d'un ion pour une cellule. Il devrait permettre par ailleurs d'aborder des mécanismes cellulaires fondamentaux tels la signalisation, la communication intercellulaire ou encore la mort cellulaire programmée (apoptose).

En période néonatale, la muqueuse intestinale est immature et particulièrement perméable, notamment aux facteurs environnementaux comme les toxiques, les infections mais aussi les événements stressants. De la bonne maturation de la barrière intestinale va dépendre la mise en place de l'homéostasie intestinale et donc la tolérance vis-à-vis des antigènes luminaux. La survenu d’évènements stressants durant la petite enfance est associée au déclenchement et/ou l’entretien de pathologies gastro-intestinales fonctionnelles comme le Syndrome de l’Intestin Irritable (SII) mais aussi organiques comme les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI). De plus, ces pathologies malgré leurs différences dans la sévérité et les signes cliniques, partagent un certain nombre de caractéristiques physiopathologiques communes, comme la rupture de l’intégrité de la barrière intestinale associée à une rupture de tolérance vis-à-vis des antigènes luminaux et plus particulièrement contre le microbiote intestinal. L’objectif de ce travail a été d’évaluer les effets d’un Stress de Séparation Maternelle (SSM) sur l’homéostasie intestinale et la réponse immunitaire vis-à-vis du microbiote commensal chez la souris jeune adulte. Nos résultats ont mis en évidence un dimorphisme sexuel dans ce modèle. Chez les souris mâles jeunes adultes, le SSM diminue les fonctions de la barrière intestinale associé à une altération de la réponse humorale et cellulaire au niveau systémique vis-à-vis du microbiote commensal, ainsi qu’à un défaut des cellules présentatrices d’antigènes, conduisant à une inflammation de bas grade malgré un profil proinflammatoire des lymphocytes T. Chez les souris femelles jeunes adultes, le SSM altère la fonctionnalité des cellules de Paneth associée à surpopulation bactérienne intestinale, responsable de la sensibilité viscérale en réponse à une distension colorectale et une réponse humorale systémique dirigée contre le microbiote commensal. Nous avons mis en évidence une empreinte du SSM chez le jeune adulte, capable d'induire des modifications profondes de l’homéostasie intestinale ainsi que de la réponse immunitaire systémique contre le microbiote intestinal. Le SSM altère l'homéostasie intestinale et reproduit des caractéristiques communes aux pathologies digestives à savoir une rupture de barrière associée à une réponse immunitaire contre le microbiote sans symptômes majeurs. Ce travail a permis d'identifier la survenue d'événements stressants pendant la petite enfance comme un facteur environnemental important capable d'altérer l'homéostasie intestinale chez des individus sains et qui pourrait contribuer au déclenchement de pathologies intestinales chez des individus génétiquement prédisposés. / Perinatal period is characterized by an immature intestinal barrier particularly permeable to luminal antigens and as such highly vulnerable to environmental factors like toxins, infections or stressful events. The appropriate maturation of intestinal barrier leads to intestinal homeostasis and tolerance toward luminal contents. Early life stressful events are associated with the development and/or maintenance of functional gastrointestinal disorders like Irritable Bowel Syndrome (IBS) or organic one like Inflammatory Bowel Diseases (IBD). These pathologies are highly different in term of etiology and clinical severity however they share common features like alteration in intestinal barrier associated with an abnormal immune response toward luminal contents especially commensal microbiota. Our aim was to evaluate the consequences of maternal separation (MS) on intestinal homeostasis, host-microbiota relationship and the humoral and cellular response at adulthood. Due to sexual dimorphism in this model, the results are presented separately for male and female. In young adult male mice, MS decreases intestinal barrier functions associated with an alteration of systemic humoral and cellular response toward commensal microbiota. Moreover, a defect of antigen presenting cells in spleen leads to systemic low grade inflammation despite a pro-inflammatory profile of T cell. In young adult female mice, MS alters the functionality of Paneth cells associated with an intestinal bacterial overgrowth, leading to visceral sensitivity and systemic humoral response toward commensal microbiota. We highlighted that MS has long lasting adverse effects on intestinal homeostasis and systemic immune response toward commensal microbiota in young adult. MS impairs intestinal homeostasis in healthy individuals and might contribute to trigger intestinal pathologies in susceptible persons.