La transfusion sanguine est un traitement essentiel à la survie de millions de patients. Son principal risque immunologique est l’allo-immunisation post-transfusionnelle. Elle se traduit par la production d’allo-anticorps contre des antigènes de globules rouges (GR) conduisant à des hémolyses post-transfusionnelles. Les mécanismes à l’origine de la tolérance des GR ou de son inhibition lors de l’allo-immunisation sont mal connus. Ainsi, mes travaux de thèse, portant sur la compréhension de ces effets, se sont articulés en trois parties avec 1/ l’étude des conditions optimales aux réponses allo-immunes, 2/ l’étude des effets d’une stratégie thérapeutique utilisant un anticorps monoclonal et 3/ l’étude des effets immunomodulateurs, incluant la tolérance, médiée par des composants présents dans les concentrés de globules rouges (CGR).Afin d’étudier l’allo-immunisation, nous avons utilisé le modèle murin. Nous montrons qu’une variation du délai entre la transfusion et la stimulation du TLR3 impacte la réponse immune dans la rate. Une activation importante des lymphocytes T CD4+ (LT CD4+) allo-réactifs accompagnée d’une production accrue d’allo-anticorps ont été montrées à 7 jours de délai. Afin de limiter l’allo-immunisation, l’utilisation d’un anticorps anti-CD20 déplétant les lymphocytes B (LB) montre une altération des LB mais surtout des LT CD4+ impliqués dans le processus d’induction de l’allo-immunisation. Enfin, la modification du phénotype des cellules dendritiques CD11c+ de la rate des souris transfusées, observée hors contexte inflammatoire, suggère une maturation incomplète à l’origine d’une tolérance antigénique. Pour finir, l’analyse de différents composants présents dans les CGR confirme l’existence de microparticules (MPs) lymphocytaires. Ces MPs présentent des molécules inhibitrices et pourraient donc être impliquées dans la tolérance des antigènes transfusés.En conclusion, mes travaux montrent la coopération des DCs avec les LT CD4+ permettant celle des LT CD4+ avec les LB pour induire une réponse immune. Comme toute réponse humorale, nous confirmons que l’allo-immunisation fait intervenir des DCs, des LT CD4+ et des LB. Ces résultats ouvrent de nouvelles voies de recherche pour mieux caractériser l’allo-immunisation en particulier chez les patients drépanocytaires qui sont les plus touchés. / Red blood cell (RBC) transfusion is a life-saving treatment for millions of patients. However, its main immunological risk is RBC alloimmunization resulting in antibody production against RBC antigen. Alloimmunization can lead to severe complications threatening the life of the patient. The mechanisms explaining RBC alloimmunization are poorly understood. Therefore, my doctoral work aiming at understanding transfusion effects, was subdivided into three parts with 1/ the study of optimal conditions for alloimmune responses, 2/ the impact of a therapeutic strategy using a monoclonal antibody to inhibit alloimmunization and 3/ the study of immunomodulatory effects of transfusion, including tolerance, through components present in the RBC concentrates.We also used HOD murine model for the study of alloimmunization to show an impact of the delay between the TLR3 agonist injection and the transfusion on immune responses against RBCs. At 7 days of delay, we have demonstrated an important alloreactive CD4+ T-cell activation and a wider alloantibody production. Furthermore, B-cell depletion, using a monoclonal anti-CD20 antibody, revealed potential changes on LB implicated in alloimmunization induction and mostly on alloreactive CD4+ T cells. We finally observed a modification of splenic CD11c+ DC phenotype from transfused mice out of a TLR context. This suggest an incomplete maturation that could explain antigen-specific tolerance. The investigation of several components in RBC concentrates confirmed the presence of microparticules (MPs) issued from T lymphocytes. These MPs carry inhibitory markers and could thus inhibit DC activation to induce antigen-specific tolerance.Therefore, my doctoral work highlights the implication and the cooperation of DCs with CD4+ T cells to allow cellular cooperation between CD4+ T cells and B cells for immune response induction. As in any humoral response, we confirmed that RBC alloimmunization involves DCs, CD4+ T cells and B cells. In addition, these results are opening up new areas of investigation for a better characterization of alloimmunization in particular in the most affected patients, the SCD patients.

Le CD154 est une glycoprotéine transmembranaire de type II, appartenant à la famille des facteurs de nécrose tumorale (TNF) et s’exprime d’une façon transitoire à la surface des lymphocytes T activés et des plaquettes. Notre laboratoire a démontré que la forme membranaire devient soluble suite à un clivage enzymatique par les métalloprotéinases (ADAM-10 et ADAM-17). De plus, il a été montré que le CD154 soluble (sCD154) peut aussi être relâché du milieu intracellulaire sans qu’il soit exprimé à la surface cellulaire suite à un clivage enzymatique intracellulaire entre les résidus acide Glutamique 112 (E112) et Méthionine 113 (M113). Les deux formes du CD154, soluble et membranaire, possèdent une structure trimérique nécessaire pour son activité biologique. Son récepteur principal, le CD40, est une glycoprotéine de type I appartenant à la famille des récepteurs des TNFs. Il est exprimé constitutivement à la surface des cellules B, des cellules dendritiques, des macrophages, des basophiles, des plaquettes, ainsi qu’à la surface de certaines cellules non hématopoïétiques telles que les cellules endothéliales, les fibroblastes et les cellules du muscle lisse vasculaire. Outre le CD40, quatre autres récepteurs appartenant à la famille des intégrines, ont été identifiés: l’αIIbβ3, l’α5β1, l’αMβ2, l’αvβ3 et l’α4β1. Les études de notre laboratoire ont démontré que l’interaction du CD154 avec ses récepteurs induit une activation bidirectionnelle, cependant, on a observé que le clivage du CD154 de la membrane cellulaire reste une propriété privilège au CD40. Le travail illustré dans cette thèse consiste à étudier l’inhibition du clivage enzymatique du CD154 et son effet dans la régulation de la réponse immune. Les résultats générés ci-dessous montrent que le CD154 résistant au clivage est un stimulant plus important que sa forme clivable. En effet, la double mutation des résidus E112 et M113 du CD154 abolit sa libération spontanée du milieu intracellulaire ainsi que son clivage de la membrane médié par le CD40 sans affecter sa liaison à ce dernier. Ce mutant s'est avéré capable d'induire une réponse apoptotique plus importante des cellules B, des réponses prolifératives plus prononcées et déclenche la différenciation des cellules B humaines d’une manière plus significative que le CD154-WT. De plus, notre étude met en évidence le développement et la caractérisation d'un anticorps monoclonal (mAb), le Clone 8, capable d'inhiber la libération/le clivage du CD154 à partir des cellules et ainsi de le maintenir à la surface cellulaire et d'augmenter sa puissance en tant qu'activateur des réponses induites par le CD40. Le Clone 8 est capable de lier le CD154 murin et d’inhiber son clivage de la surface cellulaire de la même façon que celle étudiée dans les cellules humaines. Ces travaux vont permettre le passage de cet anticorps bloquant le clivage du CD154 au stade des essais cliniques afin de mettre en place un nouveau traitement efficace pour les maladies auto-immunes et le cancer. / CD154 is a type II transmembrane glycoprotein belonging to the tumor necrosis factor superfamily (TNF), that is transiently expressed on the surface of activated T cells and platelets. We have demonstrated that this membrane form becomes soluble following an enzymatic cleavage by metalloproteinases (ADAM-10 and ADAM-17). CD154 also exists in a soluble form originating from a direct release of an intracellular processing without being expressed on the cell surface. This fragment is the result of an intracellular enzymatic cleavage between the residues Glutamic acid at position 112 (E112) and Methionine at position 113 (M113). Both soluble and membrane-bound forms of CD154 occur as non-covalently-linked homotrimers a property conveying to CD154 its biological activity. Its main receptor, CD40, is a type I glycoprotein belonging to the TNF receptor family. It is constitutively expressed on the surface of immune and non-immune cells including B cells, dendritic cells, macrophages, basophils, endothelial cells, fibroblasts, and vascular smooth muscle cells. CD154 was also shown to bind other receptors: αIIbβ3, α5β1, αMβ2, αvβ3 and α4β1 integrin. We have shown that the interaction of CD154 with its receptors induces bidirectional activation, however, only CD40 was capable of inducing the cleavage of CD154 from T cell surface. Our results here consist in studying the inhibition of the enzymatic cleavage of CD154 and its effect in the regulation of the immune response. Our data show that the cleavage resistant CD154 is a more potent stimulant than its cleavable form. Indeed, the double mutation of residues E112 and M113 of CD154 abolishes its spontaneous release from the intracellular milieu as well as its cleavage from the membrane. This mutant was found to be able to induce a stronger apoptotic response from B cells, induce more pronounced proliferative responses and trigger human B cell differentiation in a more significant way than CD154-WT. In addition, our study highlights the development and characterization of a monoclonal antibody (mAb), Clone 8, capable of inhibiting the release/cleavage of CD154 from cells and thus maintain it on the cell surface and increase its potency as an activator of CD40-induced responses. Clone 8 binds murine CD154 and inhibit its cell surface cleavage in the same way that in human cells. This study will allow the passage of this antibody blocking the cleavage of CD154 to the stage of clinical trials to develop a novel tool to treat diseases in which CD154 is implicated.