Le trafic intracellulaire est un processus fondamental qui maintient l'homéostasie cellulaire. Les RAB GTPases sont des régulateurs clés du trafic intracellulaire. RAB6 est la RAB résidente la plus abondante du Golgi. RAB6 est un régulateur clé de l'homéostasie Golgienne. Mon projet de thèse s'est intéressé à l'étude de la fonction de RAB6 dans la sécrétion post-Golgienne. Des études précédentes ont montré que la déplétion de RAB6 inhibe l'arrivée à la membrane plasmique de différents cargos : dans des cellules HeLa, NPY et VSV-G, et TNFα dans les macrophages. Nous avons donc émis l'hypothèse que RAB6 pourrait être un régulateur général de la sécrétion post-Golgienne. A l'aide de cellules MEFs RAB6 KO, nous avons d'abord montré que la sécrétion de toutes les protéines nouvellement synthétisées est inhibée. Pour comprendre les mécanismes entraînant cet effet, nous avons étudié le rôle de RAB6 dans le transport post-Golgien de trois types différents de cargos : GPI-APs (PLAP et CD59), collagen X, une protéine soluble, et une protéine transmembranaire TNFα. Afin de synchroniser le transport de cargos, nous avons utilisé le système RUSH. Ainsi, nous avons montré que RAB6 est présent sur les vésicules post-Golgiennes contenant les 3 types de cargos et que la déplétion de RAB6 affecte leur sécrétion. Les effecteurs de RAB6 sont aussi impliqués: Myosine II dans leur fission du Golgi, KIF5B dans leur transport vers la périphérie cellulaire, ELKS dans leur arrimage à la membrane plasmique. Finalement, nous avons pu montrer que les 3 cargos sont présents dans les mêmes vésicules post-Golgiennes avec RAB6. Ces résultats montrent que RAB6 régule la sécrétion de différents cargos. / Intracellular trafficking is a fundamental process which ensures cell homeostasis. RAB GTPases are key regulators of intracellular trafficking. RAB6 is the most abundant Golgi resident RAB and is a key regulator of Golgi homeostasis. My Ph.D project focused on understanding the function of RAB6 in post-Golgi secretion.Previous reports have shown that RAB6 depletion impairs the arrival at the plasma membrane of different cargoes: in HeLa cells, NPY and VSV-G and TNFα in macrophages. We thus hypothesized that RAB6 could be a general regulator of post-Golgi transport steps. Using MEF cells from RAB6 KO mice, we first showed that the secretion of all newly synthesized proteins is affected. To decipher the mechanisms leading to this inhibition, we have then investigated the role of RAB6 in the post-Golgi transport of three different classes of proteins, GPI-anchored proteins (such as Placental Alkaline phosphatase or PLAP and CD59), collagen X, a soluble protein, and the transmembrane protein TNFα. In order to synchronize transport of newly-synthetized cargoes along the secretory pathway, we used the RUSH system. Here, we show that RAB6 is present on post Golgi vesicles containing the three types of cargo and that RAB6 depletion affects their secretion to the plasma membrane. RAB6 effectors are also implicated: Myosin II for their fission from the Golgi, KIF5B for their transport to the cell periphery, ELKS/RAB2IP2 for their docking with the plasma membrane. Finally, we could show that these three cargoes are present in the same post-Golgi transport carriers with RAB6. Altogether, these results show that RAB6 regulates the secretion of a wide number of cargo proteins.

Une réponse immunitaire efficace contre un large spectre de pathogènes ou contre des cellules tumorales nécessite l’activation des lymphocytes T CD4+. L’engagement du récepteur T par un peptide antigénique apprêté sur les produits de classe-II du complexe majeur d’histocompatibilité (peptide-CMH, pCMH) portés par une cellules présentatrices d’antigène (CPAg), conduit à de nombreux remaniements du lymphocyte T. Il s’établit notamment à l’interface entre le lymphocyte T et la CPAg, une structure spécialisée qui est la synapse immunologique (ou synapse immune). La synapse est le siège d’événements de signalisation intenses où diverses molécules de signalisation nécessaires l’amplification et la diversification du signal provenant du TCR sont recrutées. Ces évènements de signalisation sont régulés par l’adaptateur transmembranaire LAT (« Linker for Activation of T cells ») qui est présent à la membrane plasmique ainsi que dans des compartiments intracellulaires. La fraction intracellulaire de LAT est recrutée à la synapse immune et il est proposé que ces compartiments vésiculaires participent à la signalisation lymphocytaire T. L’objectif de ce travail de thèse a été de déterminer les voies de trafic intracellulaire nécessaires au recrutement de la fraction intracellulaire de LAT à la synapse immunologique et de comprendre le rôle de ce transport dans l’activation et la réponse lymphocytaire T. Par des approches d’extinction de l’expression de différentes molécules de transport intracellulaires dans les cellules T Jurkat ou des lymphocytes T CD4+ primaires humains ou par l’utilisation de souris Knock-Out (KO), nous avons mis en évidence plusieurs voies de transport impliquées dans le transport de LAT. Nous avons ainsi mis en évidence que le recrutement de LAT à la synapse immunologique nécessite une voie de sécrétion dépendante de la protéine SNARE vésiculaire VAMP7. L’analyse plus avant du transport de LAT a par ailleurs permis de montrer que LAT est présente dans des compartiments de recyclage alors que VAMP7 est principalement localisée dans l’appareil de Golgi. L’étude de la petite GTPase Rab6 et de la protéine t-SNARE syntaxine-16 qui sont impliquées dans des voies de transport rétrograde entre les endosomes de recyclage et l’appareil de Golgi, a permis de dévoiler que cette voie de transport est requise dans le recrutement de LAT à la synapse immunologique, ainsi qu’à la réponse lymphocytaire T in vitro, ex vivo et in vivo. Enfin, le rôle de la protéine de transport intraflagellaire IFT20, qui a déjà été mis en cause dans le transport du TCR, a été analysé chez la souris et a également montré des défauts de recrutement de LAT à la synapse et dans l’activation lymphocytaire T ex vivo et in vivo. Nos résultats mettent ainsi en évidence que la régulation du transport intracellulaire dans les lymphocytes T joue un rôle crucial dans l’activation lymphocytaire T. Nous proposons ainsi un modèle dans lequel LAT est constitutivement internalisé depuis la membrane plasmique et poursuit une voie de recyclage dépendante de l’appareil de Golgi qui contient la machinerie de sécrétion associé à VAMP7. Cette voie de transport intracellulaire, conditionnerait la resécrétion polarisée de LAT à la synapse immunologique dans les conditions d’activation et une réponse lymphocytaire T robuste. / The immune response against a broad spectrum of pathogens or against tumor cells requires the CD4 + T lymphocytes activation. The triggering of T Cell Receptor (TCR) by peptide-MHC through antigen-presenting cells (APC) leads to numerous T-cell remodeling and the establishment of a specialized structure at the interface between the T lymphocyte and the APC: the immunological synapse. The synapse is the site of intense signaling events where various signaling molecules are recruited in order to amplify and diversify the signal initiated by the TCR. These signaling events are regulated by the transmembrane adapter LAT ("Linker for activation of T cells") which is present at the plasma membrane as well as in intracellular compartments. The intracellular fraction of LAT is recruited at the immune synapse and it is proposed that these vesicular compartments participate in T lymphocyte signaling. The objective of this thesis work was to determine the intracellular trafficking pathways required for the recruitment of the intracellular pool of LAT to the immunological synapse and understand the role of this transport in T cell activation and response. By silencing the expression of different intracellular transport molecules in Jurkat T cells or primary human CD4 + T lymphocytes, or by using Knock-Out (KO) mice, we have highlighted several trafficking pathways involved in the transport of LAT to the immune synapse. We have demonstrated that the recruitment of LAT to TCR activation sites requires a secretion pathway dependent on the vesicular SNARE protein VAMP7. Further analysis of the transport of LAT showed that LAT is present in recycling compartments whereas VAMP7 is mainly located in the Golgi apparatus. The study of the small GTPase Rab6 and the t-SNARE syntaxin-16 protein that are involved in the retrograde transport pathways between the recycling endosomes and the Golgi apparatus, demonstrated that this route of transport is required for the recruitment of LAT to the immunological synapse and for T lymphocyte response in vitro, ex vivo and in vivo as well. Finally, the role of intraflagellar transport protein IFT20, which has already been implicated in the transport of TCR, was analyzed in mice and also showed defects in LAT recruitment to synapse and T lymphocyte activation ex vivo and in vivo. Our results thus show that the regulation of intracellular transport plays a crucial role in T lymphocyte activation. We thus propose a model in which LAT is constitutively internalized from the plasma membrane and pursues a Golgi-dependent recycling pathway that contains the secretion machinery associated with VAMP7. This intracellular transport pathway would thus allow the polarized LAT re-secretion to the immunological synapse under activation conditions and a robust T lymphocyte response.