Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in dt. Sprache.

Würzburg, Univ., Diss., 2009.

The proteins of the RAF family (A-RAF, B-RAF, and C-RAF) are serine/threonine-kinases that play important roles in development, mature cell regulation and cancer. Although it is widely held that their localization on membranes is an important aspect of their function, there are few data addressing this aspect of their mode of action. Here, we report that each member of the RAF family exhibits a specific distribution at the level of cellular membranes, and that C-RAF is the only isoform that directly targets mitochondria. We find that the RAF kinases exhibit intrinsic differences in terms of mitochondrial affinity, and that C-RAF is the only isoform that binds this organelle efficiently. This affinity is conferred by the C-RAF amino-terminal domain, and does not depend on the presence of RAS GTPases on the surface of mitochondria. Furthermore, we analyze the consequences of C-RAF activation on the cellular and molecular level. C-RAF activation on mitochondria dramatically changes their morphology and their subcellular distribution. On the molecular level, we examine the role of C-RAF in the regulation of the pro-apoptotic Bcl-2 family member BAD. This protein exhibits the original mode of regulation by phosphorylation. Although several reports addressed the regulation of BAD by C-RAF, the exact mode of action as well as the consequences of C-RAF activation on BAD are still not completely understood. We show that the inducible activation of C-RAF promotes the rapid phosphorylation of BAD on Serine-112 (Ser-75 in the human protein), through a cascade involving the kinases MEK and RSK. Our findings reveal a new aspect of the regulation of BAD protein and its control by the RAF pathway: we find that C-RAF activation promotes BAD poly-ubiquitylation in a phosphorylation-dependent fashion, and increases the turn-over of this protein through proteasomal degradation. / Die Proteine der RAF-Familie (A-RAF, B-RAF, C-RAF) sind Serin/Threonin-Kinasen, die eine wichtige Rolle in der Entwicklung, in der Zellregulation und in Krebs spielen. Obwohl es weitgehend anerkannt ist, dass die Lokalisation an Membranen ein wichtiger Aspekt ihrer Funktion ist, gibt es nur wenige Daten, die diesen Punkt ihrer Wirkungsweise beschreiben. Wir zeigen hier, dass jedes Mitglied der RAF-Familie eine spezifische Verteilung an zellulären Membranen besitzt, und dass C-RAF die einzige Isoform ist, die direkt an Mitochondrien bindet. Weiterhin zeigen wir, dass RAF-Kinasen intrinsische Unterschiede in ihrer mitochondrialen Affinität aufweisen, wobei C-RAF die einzige Isoform ist, die an dieses Organell effizient bindet. Diese Affinität wird von der amino-terminalen Domäne von C-RAF vermittelt und ist unabhängig vom Vorkommen der RAS-GTPasen auf der Oberfläche von Mitochondrien. Des Weiteren haben wir die Konsequenzen der Aktivierung von C-RAF auf zellulärer als auch auf molekularer Ebene untersucht. C-RAF Aktivierung an Mitochondrien hat drastische Änderungen in deren Morphologie und subzellulärer Verteilung zur Folge. Auf molekularer Ebene haben wir die Rolle von C-RAF in der Regulation des pro-apoptotischen Bcl-2 Familien Proteins BAD untersucht. Dieses Protein wird über Phosphorylierung reguliert. Obwohl eine Vielzahl von Arbeiten die Regulation von BAD durch C-RAF untersuchten, sind die exakte Wirkungsweise wie auch die Konsequenzen der C-RAF Aktivierung im Hinblick auf BAD immer noch unklar. Wir zeigen, dass die induzierbare Aktivierung von C-RAF die rapide Phosphorylierung von BAD an Serin 112 (Serin 75 im humanen Protein) zur Folge hat. Dieser Prozess wird durch eine Kaskade vermittelt, welche die Kinasen MEK und RSK einbezieht. Des Weiteren decken unsere Ergebnisse einen neuen Aspekt der Regulation des BAD Proteins auf und dessen Kontrolle durch den RAF-Signalweg: Wir zeigen, dass die Aktivierung von C-RAF die phosphorylierungs-abhängige Poly-ubiquitylierung von BAD zur Folge hat. Weiterhin beschleunigt die Aktivierung von C-RAF den Umsatz des BAD Proteins durch proteasomalen Abbau.

Aus genetischen und zellbiologischen Untersuchungen ist bekannt, dass die Proteinkinase Raf Apoptose unterdrücken kann, die Effektoren sind jedoch im Detail nicht klar. Am Modell der IL-3 abhängigen Zellinie 32D wurde die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-kappaB in der Apoptosesuppression durch aktiviertes Raf untersucht. Unter Verwendung zweier aktiver Raf-Mutanten ergaben sich Hinweise auf eine proapoptotische Funktion, passend zu den NF-kappaB zugeschriebenen proaptotischen Zielgenen. Für den Raf-Effektor MEK ist eine antiapoptotische Funktion bekannt. Hier gelang es mit einer hyperaktiven Mutante (deltaStu-MEK-LIDEMANE) aus IL-3 abhängigen 32D Zellen einen Faktor-unabhängigen Zellpool (FID) zu generieren. Das von den bekannten Vorstellungen über Zytokin-abhängige Zellinien abweichende Verhalten, nach dem erst die Mutation von mehr als einem Onkogen zu einer Faktorunabhängigkeit führt, wurde genauer charakterisiert. Die FID-Zellen sind weiter von den Signalmolekülen MEK und PI3-Kinase abhängig und ein autokriner Mechanismus konnte ebenso wie die Expression von Signalmolekülen auf der Zelloberfläche ausgeschlossen werden. / The protein kinase Raf is able to suppress apoptosis, although its effectors are not known in detail. The IL-3-dependent cell line 32D served as a model for the suppression of apoptosis by activated Raf in order to elucidate the role of the transcription factor NF-kappaB. We used two different active Raf mutants in our experimental approach and found evidence of a proapoptotic role for NF-kappaB. This stresses the significance of the proapoptotic target genes of NF-kappaB. The Raf effector MEK has an established antiapoptotic role. Our hyperactive MEK-mutant (deltaStu-MEK-LIDEMANE) turned IL-3-dependent 32D cells into cytokine-independent cells contrary to the traditional model of cytokine dependence. The cytokine-independent cells still employed the MEK and PI3-Kinase pathways. An autocrine mechanism could be excluded as well as the presence of surface signalling molecules.

Der gyrus dentatus im Hippocampus ist die primäre Zielregion kortikaler Afferenzen des Enthorinalen Cortex. Im Laufe seiner Entwicklung erlangt der gyrus dentatus durch die Etablierung einer neurogenen Nische (tertiäre Matrix) die Fähigkeit fortwährender postnataler Neurogenese. Diese wird durch eine Vielzahl von Mediatoren wie Transkriptionsfaktoren gesteuert, die die Proliferation und Zelldifferenzierung, aber auch das Überleben der hippocampalen neuralen Vorläuferzellen (NPCs, neural progenitor cells) kontrollieren. In Säugetieren steuern die homologen RAF Kinasen ARAF, BRAF und CRAF die mitogene Kaskade, die bei der adulten Neurogenese von elementarer Bedeutung ist. In dieser Studie wurde untersucht ob die Nullmutation von CRAF eine Auswirkung auf die postnatale und adulte hippocampale Neurogenese hat. Unsere Analysen von BRAF- und CRAF-defizienten Mäusen zeigen in der frühen Embryonalentwicklung gemeinsame Funktionen beider Kinasen, weshalb das Fehlen einer Kinase bis zu bestimmten embryonalen Entwicklungszeitpunkten durch die jeweils andere Kinase kompensiert werden kann. Letalitätsstudien zeigen jedoch, dass BRAF und CRAF bei späteren Entwicklungsstadien jeweils unabhängig für das Überleben von Tieren relevant sind. CRAF Nullmutanten werden nicht nach der erwarteten Mendelschen Frequenz geboren und nahezu 70% der Tiere sterben bereits kurz nach der Geburt. Die maximale beobachtete Lebenserwartung adulter CRAFko Tiere lag bei postnatal Tag 55. CRAFko Mäuse haben eine reduzierte Körpergröße, veränderte Hautfarbe und einen eye-open-at-birth-Phänotyp. Verhaltensexperimente in unserer Arbeitsgruppe zeigten an heterozygoten CRAF Mäusen einen Einfluss von CRAF auf das Angst - und Lernverhalten, was einen Einfluss von CRAF auf die Neurogenese-vermittelte hippocampale Funktion andeutete. Tatsächlich konnte hier die Expression von CRAF im postnatalen Gehirn von Mäusen immunhistologisch wie auch proteinbiochemisch nachgewiesen werden. Im Hippocampus zeigte sich, dass ein Funktionsverlust von CRAF zu einer erhöhten Anzahl mitotisch aktiver NPCs führt, die massive Zellzyklusveränderungen aufweisen. Zudem wurde eine fehlerhafte Reorganisation der tertiären Matrix beobachtet. NPCs CRAF-defizienter Tiere befinden sich vermehrt im Hilus und bleiben in der Entwicklung zu reifen Körnerzellen im D Zell-Vorläuferstadium stecken. Weitere Analysen zeigen, dass diese fehlplatzierten NPCs teilweise über apoptotische Signalwege eliminiert werden. Als Resultat dieser Entwicklungsstörung ist der gyrus dentatus CRAF-defizienter Tiere verkleinert und es kann eine verlangsamte neuronale Differenzierung NPC-abgeleiteter Neurone beobachtet werden. Diese Befunde zeigen erstmals einen CRAF-spezifischen Einfluss auf die Regulation elementarer, zellulärer Eigenschaften neuronaler Vorläuferzellen des Hippocampus. / The hippocampal dentate gyrus is the primary target region of cortical afferents originating in the entorhinal cortex. During its evolutionary development, the dentate gyrus has achieved the ability of continuous postnatal neurogenesis by establishing a neurogenic niche (tertiary matrix). This process is regulated by multiple mediators such as transcription factors that control proliferation, cell differentiation and survival of hippocampal neural precursor cells (NPCs). Mammals express three homologous RAF kinases ARAF, BRAF and CRAF which regulate the mitogenic cascade, an essential element of adult neurogenesis. In this study we analysed if the nullmutation of CRAF interferes with postnatal and adult hippocampal neurogenesis. Our analysis of BRAF and CRAF-deficient mice reveals common functions of both kinases during early embryogenesis. In this developmental phase, lack of one kinase may be compensated by the other kinase. This phenomenon ends at later embryonic developmental stages. Lethality studies show independent roles of BRAF and CRAF in survival during later developmental stages. CRAF null-mutants are not born in mendelian frequency and almost 70% of all CRAF mutants die within a short time window after birth. The oldest analysed CRAFko mice survived until postnatal day P55. CRAFko mice show a decreased body size, altered skin colour and possess an eye-open-at-birth-phenotype. Previous behavioural experiments by our group revealed the influence of CRAF in anxiety-like behaviour and specific learning paradigms, indicating an effect of CRAF on neurogenesis-dependent hippocampal functions. Indeed, this study confirmed the expression of CRAF with immunohistological and biochemical methods in postnatal mouse brain tissue. In the hippocampus, the loss-of-function mutation of CRAF leads to increased numbers of mitotically activated NPCs which exhibit drastic cell-cycle abnormalities. In addition, CRAF-deficient mice carry malformations in the organisation of their tertiary matrix. NPCs of CRAF-deficient mice are mainly located in the hilus where their maturation towards the neuronal lineage persists in the D-cell stage. A detailed analysis shows that these misplaced NPCs are - at least partially - eliminated by apoptosis. Due to this developmental defect the dentate gyrus of CRAF-deficient mice is smaller and the neuronal differentiation of NPC-derived neurons is delayed. These results show for the first time a CRAF-specific effect on the regulation of basic cellular functions of neuronal precursors in the hippocampus.

Das Multiple Myelom (MM) ist eine durch monoklonale Vermehrung terminal differenzierter Antikörper-produzierender B-Lymphozyten (Plasmazellen) im Knochenmark charakterisierte maligne Krankheit, die sich v.a. in osteolytischen Knochendestruktionen, hämatopoetischer und Niereninsuffizienz äußert. Verbesserte Therapieansätze wie die Hochdosis-Chemotherapie mit Melphalan und anschließender autologer Stammzelltransplantation sowie die Einführung neuer pharmakologischer Substanzklassen (Proteasom-Inhibitoren, Cereblon-bindende Thalidomidderivate) führten zu einer Verlängerung der durchschnittlichen Überlebenszeit, für die meisten der Patienten ist die Erkrankung jedoch derzeit unheilbar. Die Erforschung neuer potenzieller therapeutischer Angriffspunkte auf Grund pathobiologischer Erkenntnisse bleibt daher unabdingbar. Ein Ansatz zur Verbesserung des Verständnisses der Pathogenese ist die funktionelle, molekulare und genetische Analyse des Signalnetzwerkes im MM. Im Zusammenhang mit diesem Konzept wurde entdeckt, dass wachstums-regulierende Signalwege in MM Zellen aktiviert oder dereguliert sind und zum Überleben und der Proliferation des Tumors beitragen. So konnte beispielsweise von unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden, dass onkogenes Ras essentiell zum Überleben der MM Zellen beiträgt. Da Ras derzeit mangels spezifischer Inhibitoren pharmakologisch nicht angreifbar ist, stellen weitere funktionelle Bestandteile des Signalweges eine potenzielle therapeutische Zielstruktur dar. Während die Blockade von MEK1/2 in MM Zellen keinen Einfluss auf das Überleben hatte, konnte durch die Blockade von Raf in ersten Tests unserer Arbeitsgruppe Apoptose hervorgerufen werden. Aus diesem Grund habe ich in der vorliegenden Arbeit zur Evaluation eines neuen Therapieansatzes die Rolle der Raf-abhängigen Signaltransduktion eingehend untersucht. Als Grundlage diente dabei die Hypothese, dass die Raf-Kinasen entscheidende Effektoren der durch onkogenes Ras vermittelten apoptotischen Effekte darstellen. In einem ersten Schritt konnte ich nachweisen, dass alle drei Raf-Isoformen (A-, B- und C-Raf) in humanen MM Zelllinien und in primären MM Zellen aktiviert sind. Mittels shRNA-vermittelter, Isoform-spezifischer Raf-Knockdown-Experimente konnte ich zeigen, dass nur ein simultaner Knockdown aller Isoformen, d.h. ein Pan-Raf-Knockdown, zu einer De-Phosphorylierung von MEK1/2 und ERK1/2 führte. Dieser Versuch ließ sich mittels pharmakologischer Raf-Inhibition, bei der ebenfalls nur eine Pan-Raf-Blockade zu einer Herunterregulation von MEK1/2 und ERK1/2 in MM Zellen führte, bestätigen. Das MEK/ERK-Modul stellte somit einen hervorragenden Surrogat- und Biomarker für die Pan-Raf-Aktivität dar. Im Gegensatz zur Blockade des MEK/ERK-Moduls führte eine Hemmung der Pan-Raf-Aktivität mittels shRNA oder pharmakologischer Inhibitoren in allen untersuchten Zelllinien und in der Mehrheit der primären MM Zellen zu einer starken Induktion von Apoptose. Da das Ansprechen auf eine Pan-Raf-Blockade nicht mit dem Ras-Mutationsstatus korrelierte, könnten die Raf-Kinasen eine von onkogenem Ras unabhängie Qualität als therapeutische Zielstruktur aufweisen. Zur Untersuchung möglicher MEK/ERK-unabhängiger Effektormechanismen der Pan-Raf-Inhibition habe ich die mRNA-basierten Genexpressionsprofile von INA-6 Zellen nach pharmakologischer Pan-Raf- oder MEK-Inhibition verglichen. Dabei führte die Pan-Raf-Inhibition zu einer Regulation von wesentlich mehr Genen, wobei sich auch die Art der regulierten Gene unterschied, darunter Gene mit tumorrelevanten Funktionen wie Regulation von Proliferation, Zellzyklus und Apoptose. Für eine dieser Gengruppen, die Gruppe der PI3K-abhängigen, mTOR-assoziierten Gene, konnte ich eine Regulation auch auf der Proteinebene nachweisen: die Phosphorylierungen von mTOR, p70S6K, Rb und AKT und die Expression von CyclinD1 und PDK1 waren nach Pan-Raf-Inhibition, nicht jedoch nach MEK-Blockade herunterreguliert. Dieses Ergebnis deutet auf eine Ko-Regulation der PI3K-abhängigen Signaltransduktion durch die Raf-kinasen hin. Mittels spezifischer PI3K-Inhibitoren ließ sich sowohl bei der Regulation der untersuchten Proteine als auch bei der Induktion von Apoptose eine deutliche Verstärkung der Pan-Raf-Inhibition in HMZL und in primären Zellen erzielen. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass die Pan-Raf-Blockade eine neue Therapiemöglichkeit darstellt, die durch Kombination mit einer PI3K/AKT-Inhibition noch verstärkt werden kann. / Multiple Myeloma (MM) is a malignant disease which is characterized by monoclonal expansion of terminally differentiated, antibody-producing B-lymphocytes (plasma cells) and results mostly in bone lesions, haematopoietic and renal insufficiency. Improved therapeutic approaches like high-dose melphalan chemotherapy followed by autologous stem-cell transplantation and the introduction of new pharmacological compounds (proteasome inhibitors, cereblon-binding Thalidomide derivates) increased the mean survival time. Nevertheless, the disease remains incurable for most of the patients. Therefore, the exploration of new potential therapeutical targets based on pathobiologic insights becomes vital. One approach to improve the understanding of the pathogenesis is to analyze functionally, molecularly and genetically the signaling network in MM. In the context of this concept, it was discovered, that growth-regulating pathways are activated or deregulated in MM cells and contribute to tumor survival and proliferation. Our working group could already proof that oncogenic Ras is crucial for cell survival. Since Ras itself does not yet represent a druggable target, therapeutical approaches should aim at other functional parts of the pathway. While blocking of MEK1/2 has no influence on MM cell survival, early reports of our working group showed that inhibiting Raf induced apoptosis. For this reason I investigated the role of Raf-dependent signaling in order to evaluate a new therapeutic approach. This was based on the hypothesis that Raf kinases act as important effectors for the apoptotic effects of oncogenic Ras. As a first step, I could prove, that all three Raf isoforms (A-, B- and C-Raf) are activated in human MM cell lines and in primary MM cells. By using of shRNA-mediated, isoform-specific Raf knockdown experiments I could reveal that only the simultaneous knockdown of all three isoforms, i.e. a Pan-Raf knockdown, led to de-phosphorylation of MEK1/2 and ERK1/2. Also pharmacological Raf inhibition showed that only Pan-Raf blockage decreases the phosphorylation of MEK1/2 and ERK1/2 and thereby confirmed the knockdown experiment. These experiments also proved that the MEK/ERK module is a strong surrogate and biomarker for Pan-Raf activity. Contrary to inhibiting the MEK/ERK module the inhibition of Pan-Raf activity by shRNAs or pharmacological inhibitors led on to a strong induction of apoptosis in the tested cell lines and in the majority of primary cells. Since the response to Pan-Raf inhibition did not correlate with Ras mutational status, the Raf kinases could probably represent a Ras-independent therapeutical target of high quality. In order to decode possible MEK/ERK-independent effector mechanisms I compared the mRNA-based gene expression profiles of INA-6 cells after pharmacological inhibition of Pan-Raf or MEK. Pan-Raf inhibition led to the regulation of a greater number of genes, taking into account that the character of the regulated genes also varied. This included genes with functions relevant for tumors like regulation of proliferation, cell cycle and apoptosis. For one of these groups, the PI3K-dependent, mTOR-associated genes, I could show the regulation on the level of the proteins: phosporylation of mTOR, p70S6K, Rb and AKT as well es the expression of cyclinD1 and PDK1 decreased after Pan-Raf inhibition, but not after MEK inhibition. This result suggests a co regulation of the PI3K-dependent signal transduction by Raf kinases. In summary, this thesis presents a rationale for Pan-Raf inhibition as a new therapeutical option, which can be enhanced by combination with PI3K/AKT-inhibition.

Extracellular signals are translated and amplified via cascades of serially switched protein kinases, MAP kinases (MAPKs). One of the MAP pathways, the classical RAS/RAF/MEK/ERK pathway, transduces signals from receptor tyrosine kinases and plays a central role in regulation of cell proliferation. RAF kinases (A-, B- and C-RAF) function atop of this cascade and convert signals emanating from conformational change of RAS GTPases into their kinase activity, which in turn phosphorylates their immediate substrate, MEK. Disregulated kinase activity of RAF can result in tumor formation, as documented for many types of cancer, predominantly melanomas and thyroid carcinomas (B-RAF). A-RAF is the least characterized RAF, possibly due to its low intrinsic kinase activity and comparatively mild phenotype of A-RAF knockout mice. Nevertheless, the unique phenotype of araf -/- mice, showed predominantly neurological abnormalities such as cerebellum disorders, suggesting that A-RAF participates in a specific process not complemented by activities of B- and CRAF. Here we describe the role of A-RAF in membrane trafficking and identify its function in a specific step of endocytosis. This work led to the discovery of a C-terminally truncated version of A-RAF, AR149 that strongly interfered with cell growth and polarization in yeast and with endocytosis and actin polymerization in mammalian cells. As this work was in progress two splicing isoforms of ARAF, termed DA-RAF1 and DA-RAF2 were described that act as natural inhibitors of RAS-ERK signaling during myogenic differentiation (Yokoyama et al., 2007). DA-RAF2 contains the first 153 aa of A-RAF and thus is nearly identical with AR149. AR149 localized specifically to the recycling endosomal compartments as confirmed by colocalization and coimmunoprecipitation with ARF6. Expression of AR149 interferes with recycling of endocytosed transferrin (Tfn) and with actin polymerization. The endocytic compartment, where internalized Tfn is trapped, was identified as ARF6- and RAB11- positive endocytic vesicles. We conclude that the inhibition of Tfn trafficking in the absence of A-RAF or under overexpression of AR149 occurs between tubular- and TGNassociated recycling endosomal compartments. siRNA-mediated depletion of endogenous A-RAF or inhibition of MEK by U0126 mimic the AR149 overexpression phenotype, supporting a role of ARAF regulated ERK signalling at endosomes that is controlled by AR149 and targets ARF6. Our data additionally suggest EFA6 as a partner of A-RAF during activation of ARF6. The novel findings on the A-RAF localization and the interaction with ARF6 have led to a new model of ARAF function were A-RAF via activation of ARF6 controls the recycling of endocytic vesicles.Endocytosis and rapid recycling of synaptic vesicles is critically important for the physiological function of neurons. The finding, that A-RAF regulates endocytic recycling open a new perspective for investigation of the role of A-RAF in the nervous system. / Extrazelluläre Signale werden über eine Serie von nacheinander geschalteten Proteinkinasen, den MAP-Kinasen (MAPK) weitergeleitet und multipliziert. Einer der MAPK-Signalwege, der RAS/RAF/MEK/ERK-Signaltransduktionsweg, leitet Signale von Tyrosinkinaserezeptoren weiter und spielt eine zentralle Role in der Regulation der Zellproliferation. RAF Kinasen (A-, B-, und CRAF) stehen am Anfang der Kaskade. Sie wandeln die signalbedingte strukturellen Änderungen der RAS-GTPase in ihre Kinaseaktivität um und phosphorylieren ihr direktes Substrat, MEK. Eine Störung in der Regulation der Kinaseaktivität des RAF-Proteins kann zur Tumorbildung führen, wie es bei vielen Krebsarten, vor allem Melanom und Schilddrüsenkarzinom (B-RAF), dokumentiert ist. A-RAF ist die bislang am wenigsten charakterisierte RAF-Kinase, möglicherweise aufgrund sihrer nidrigen intrinsischen Kinaseaktivität. Weiterhin weist die A-RAF defficiente Maus einen relativ milden hauptsächlich neuronalen Phänotyp auf, der sich unter anderem auch in einer Fehlfunktion des Cerebellums manifestiert. Dieser einzigartige Phänotyp weist darauf hin, dass eine Reihe zellulärer Prozesse spezifisch durch A-RAF und nicht durch aktiveren B- und C-RAF vermittellt wird. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle des A-RAF-Proteins im intrazellulären Membrantransport analysiert und eine spezifische A-RAF Funktion by endozytotischen Prozessen identifiziert. Diese Arbeit führte zur Entdeckung einer C-terminal verkürtzten Form von A-RAF, AR149, welche das Wachstum und die Polarisation von Hefezellen beeinträchtigt. In Säugetierzellen wirkt AR149 störend auf die Endozytose und die Aktinpolymerisation. Während des Entstehungsprozesses dieser Studie, wurden parallel zwei Spleißisoformen des A-RAF-Proteins, DARAF1 und 2, publiziert, die als natürliche Inhibitoren des RAS-RAF-MEK-ERK-Signalwegs in der myogenen Differenzierung agieren (Yokoyama et al., 2007). DA-RAF2 beinhaltet die ersten 153 Aminosäuren des A-RAF Proteines und ist damit fast identisch mit AR149. Eigene Kolokalisierungund Koimmunopräzipitationsexperimente mit ARF6 weisen darauf hin, dass AR149 spezifisch in ARF6-positiven Recycling-Endosomen lokalisiert ist. Expression des AR149 Proteins bechindert das Recycling von endozytiertem Transferrin und die Aktin Polimerisation. Die endosomalen Kompartimente in denen internalisiertes Transferrin gefangen vor liegt, konntenals ARF6- und RAB11-positive endozytotische Vesikeln characterisiert werden. Diese Ergebnisse lassen auf eine durch A-RAF Überexpression bzw. durch die Abwesenheit an A-RAF vermittelte Blokade des intrazellulären Transferrintransportes zwischen den tubulären- und Trans-Golgi-Netzwerk-assoziirten endosomalen Recycling-Kompartimenten schließen. Inhibierung der endogenen A-RAF-Expression durch siRNA oder Hemmung der MEK-Aktivität durch U0126 haben den selben Effekt wie AR149. Auf der Basis dieser Ergebnisse wird ein neues Modell für die Rolle der A-RAF regulierten ERK Signallwirkung auf Endosomen vorgestellt, bei dem das Zielprotein die ARF6 GTPase durch 3 AR149/DA-RAF2 negativ reguliert wird. Daruber hinaus deuten unsere Daten darauf hin, dass EFA6, ein GEF-Faktor von ARF6, als Kooperationspartner von A-RAF bei der ARF6-Aktivierung fungiert. Endocytose und das schnelle Recycling von synaptischen Vesikeln ist von besonderer Bedeutung für die Funktion von Neuronen. Aus dem Befund, dass A-RAF ein Regulator des endocytotischen Recyclings ist ergibt sich dacher eine neue Perspektieve für die Untersuchung der A-RAF Funktion im Nervensystem.

Das Raf kinase inhibitor protein (RKIP) ist ein Kinaseregulator, der im Herzen eine Präferenz für die G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase 2 (GRK2) zeigt. Die Regulation erfolgt durch direkte Interaktion beider Proteine, wird durch eine PKC-Phosphorylierung an Serin 153 des RKIP induziert und inhibiert die GRK2-vermittelte Phosphorylierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Die GRK2 desensitiviert GPCR und eine Hemmung der GRK2-Aktivität wirkt sich so positiv auf die Ansprechbarkeit von GPCR aus. Die \textbeta-adrenergen Rezeptoren (\textbeta AR) sind im Herzen maßgeblich an der Regulation der kardialen Kontraktilität beteiligt. Erste Zusammenhänge zwischen der RKIP-Expression und der kontraktilen Antwort von Kardiomyozyten wurden bereits in einer früheren Arbeit untersucht und bestätigt. Sie begründen die Fragestellung nach Effekten einer verstärkten RKIP-Expression auf \textbeta-adrenerge Rezeptorsignale, Herzfunktion und die Entwicklung der Herzinsuffizienz. Im Rahmen dieses Projektes konnten die Effekte des RKIP auf \textbeta-adrenerge Signalwege detaillierter beschrieben werden. Dabei erwies sich die inhibitorische Funktion auf die GRK2 als rezeptorspezifisch ohne Einfluss auf zytosolische Angriffspunkte der GRK2 zu nehmen. Verstärkte \textbeta-adrenerge Signale zeigten sich in neonatalen Kardiomyozyten an Hand der erhöhten cAMP-Level, PKA-Aktivität, sowie Kontraktionsrate und Relaxationsgeschwindigkeit nach \textbeta-adrenerger Stimulation. Im Einklang damit konnte eine erhöhte PKA- und CaMKII-Aktivität und eine positive Inotropie in transgenen Tieren, mit herzspezifischer Überexpression von RKIP, beobachtet werden. Durch Messung des Calcium-\textit{Cyclings} in Kardiomyozyten konnte der Phänotyp auf eine verbesserte Rückführung des Calciums, einer daraus resultierenden erhöhten Calciumbeladung des sarkoplasmatischen Retikulums und einem gesteigerten systolischen Calciumspiegel, zurückgeführt werden. Die Untersuchung der Phosphorylierung von Calciumkanälen, L-Typ-Calciumkanal und Ryanodin-Rezeptor 2, die den einwärtsgerichteten Calciumstrom vermitteln konnte ihre Beteiligung an der positiv inotropen Wirkung ausschließen. Neben dem kontraktilen Phänotyp konnten zusätzliche protektive Effekte beobachtet werden. In Modellen, die eine chronische \textbeta-adrenerge Stimulation imitieren, bzw. eine Nachlasterhöhung induzieren konnte eine Verringerung der interstitiellen Fibrose und der damit assoziierten Marker, gezeigt werden. Mit Hilfe von \textit{in vivo} EKG-Messungen konnte die Neigung zur Ausbildung von Arrhythmien untersucht werden. Auch im Hinblick auf die Anzahl der Extrasystolen waren RKIP-transgene Tiere geschützt. Infolge der Untersuchung der Phänotypen in Deletionshintergründen der einzelnen \textbeta AR-Subtypen (\textbeta\textsubscript{1}AR, \textbeta\textsubscript{2}AR) konnte die positive Inotropie mit den spezifischen Signalwegen des \textbeta\textsubscript{1}AR assoziiert und die protektiven Effekte gegenüber den Umbauprozessen und der Arrhythmieneigung dem \textbeta\textsubscript{2}-adrenergen Signalen zugeschrieben werden. Zusätzlich bestätigt sich eine besondere Rolle der G\textalpha\textsubscript{i}-Kopplung des \textbeta\textsubscript{2}AR, durch die er einen hemmenden Einfluss auf die \textbeta\textsubscript{1}AR-Singale nehmen kann. Die Untersuchung einiger Marker, die eine physiologische von einer pathologischen Hypertrophie unterscheiden, konnte das in den RKIP-transgenen Mäusen auftretende Wachstum der Kardiomyozyten als kompensatorische und physiologische Hypertrophie charakterisieren. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse auf eine ausgeglichene Aktivierung der beiden Rezeptoren hin, die sich gegenseitig regulieren und durch die Inhibition der GRK2 in ihrer Anregbarkeit erhalten bleiben. Mittels einer AAV9-vermittelten Gentherapie konnte das therapeutische Potential dieses Prinzips weiter bestätigt werden, da es die prominentesten Veränderungen während der Herzinsuffizienzentwicklung, wie die Verschlechterung der linksventrikulären Funktion, die Dilatation des linken Ventrikels, die Ausbildung von Lungenödemen und interstitieller Fibrose sowie die Expression von Herzinsuffizienz-assoziierten Genen, verhindern konnte. Auch konnten die Auswirkungen der Deletion des RKIP, die sich durch eine beschleunigte und gravierendere Herzinsuffizienzentwicklung auszeichnet, durch Reexpression von RKIP verhindert werden. Diese Arbeit kann somit zeigen, dass das RKIP eine ausgeglichene Verstärkung von \textbeta-adrenergen Signalwegen verursacht, die positiv inotrop und gleichzeitig protektiv wirkt. Dieses Wirkprinzip könnte ferner eine Strategie zur Erhöhung der Kontraktilität in der Herzinsuffizienz darstellen, die entgegen etablierter Theorien auf der Stimulation beider \textbeta AR basiert. / The Raf kinase inhibitor protein (RKIP) is a kinase regulator with a preference for the G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) in the heart. The mechanism is a direct interaction of GRK2 and RKIP, which is triggered by a PKC-mediated phosphorylation at serine 153 of RKIP. By binding the GRK2, RKIP prevents the GRK2-mediated GPCR-phosphorylation and, thus, desensitisation of GPCR. As a result, inhibition of GRK2-activity positively affects the responsiveness of cardiac G protein-coupled receptors (GPCR). The GPCR primarly responsible for the regulation of the cardiac contractility are the \textbeta-adrenergic receptors (\textbeta AR). Previous work proved an interrelation of RKIP-expression and contractile response of cardiomyocytes and set a basis for the subject of this thesis, dealing with the effects of RKIP-expression on beta-adrenergic signalling, cardiac function and the development of heart failure. The work describes the impact of RKIP on \textbeta-adrenergic signaling in more detail. An important feature of the inhibitory function of RKIP on GRK2 is a specificity for receptor targets (\textbeta AR) with no, or only minor, impact on the cytosolic targets of the GRK2. RKIP also increases \textbeta-adrenergic signalling. This appears in neonatal cardiac myocytes through an increased cAMP-generation, PKA-activity, contractile action and relaxation velocity after \textbeta-adrenergic stimulation. Similarly, RKIP-transgenic mice, with heart specific RKIP-expression, showed higher PKA and CaMKII-activities as well as, a positive inotropy. Analysis of the calcium cycling in these cardiomyocytes provided an explanation for the hypercontractile phenotype: an enhanced calcium reuptake into the sarcoplasmatic reticulum (SR), the resulting higher calcium load of the SR and an increased calcium amplitude in the cytosol during the systole cause the augmented contractile force. Furthermore, it could be ruled out, that two inward rectifying channels - L-type calcium channnel and Ryanodin Receptor 2 contribute to the positve inotropy in RKIP-transgenic mice. Besides, the RKIP-expression had additional protective effects in heart failure development, which were investigated by desease models. Hypertrophy was induced by chronic \textbeta-adrenergic stimulation and heart failure by induction of pressure overload. Under these conditions, RKIP could reduce the development of interstitial fibrosis and the expression of associated marker genes. The occurence of arrhythmias, in particular ectopic beats, was assessed by the analysis of \textit{in vivo} ECG-traces. Rated by the number of ectopic beats RKIP-transgenic mice were also protected against the induction of arrhythmia. The analysis of RKIP-expression in \textbeta AR subtype-KOs (\textbeta\textsubscript{1}KO, \textbeta\textsubscript{2}KO) could relate the different effects of RKIP to the signalling pathways of either \textbeta\textsubscript{1}AR or \textbeta\textsubscript{2}AR. As a result, RKIP effects the positive inotropy through signals of the \textbeta\textsubscript{1}AR and the protection against heart failure-related remodelling processes and arrhythmia through signals of the \textbeta\textsubscript{2}AR. Additionally a major importance could be assigned to the G\textalpha\textsubscript{i} coupling of the \textbeta\textsubscript{2}AR. This capacity of the \textbeta\textsubscript{2}AR can counteract potentially maladaptive signalling of the \textbeta\textsubscript{1}AR. A monitored growth of cardiomyocytes of RKIP-transgenic mice was assessed in greater depth using different markers to differentiate physiological from pathological hypertrophy. Thereby the occurring hypertrophy was characterised as physiological and compensatory. Taken together, these results point towards a balanced activation of both \textbeta AR. They influence each other through downstream signals and are protected from desensitisation and loss of \textbeta-adrenergic responsivness through inhibition of the GRK2 by RKIP. To validate the therapeutic potential of this mode of action, an AAV9-mediated gene therapy was conducted. In this setting, RKIP was able to prevent, or strongly reduce the most prominent changes during heart failure development. Among these are the decline of the left ventricular function, dilation of the left ventricle, development of a pulmonary congestion, interstitial fibrosis and the expression of heart failure associated genes. Moreover, the consequences of RKIP deletion, which are reflected in an accelerated and deteriorated heart failure development, could be reversed by the reexpression of RKIP. This work shows, that RKIP induces an even activation of \textbeta-adrenergic signalling, which results in a positive inotropy with concomitant protective effects. RKIPs mode of action represents a strategy and bears the possibilty to enhance cardiac contractility in the failing heart by stimulation of both \textbeta AR, which is contrary to the common belief.

Durch Phosphorylierung inaktiviert GRK2 kardiale ß-Adrenorezeptoren und vermindert dadurch die Kontraktilität von neonatalen Rattenkardiomyozyten. Als natürlicher Inhibitor der GRK2 beeinflusst RKIP die Signalweiterleitung bei Stimulation von ß-Adrenorezeptoren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von RKIP die Kontraktilität von neonatalen Rattenkardiomyozyten erhöht. Es wurde die Anzahl auftretender Spontankontraktionen vor und nach Stimulation mit Isoproterenol erfasst sowie eine zeitliche Analyse der Calciumfreisetzung und –aufnahme nach elektrischer Stimulation durchgeführt. Im unstimulierten Zustand zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, die Wildtyp-RKIP überexprimierten, verglichen mit der Kontrollgruppe, keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich auftretender Spontankontraktionen. Nach Stimulation mit Isoproterenol zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, in denen Wildtyp-RKIP überexprimiert wurde, eine signifikant höhere Anzahl auftretender Spontankontraktionen. Eine Analyse der Calciumtransienten zeigte bei RKIP-Wildtyp überexprimierenden neonatalen Rattenkardiomyozyten eine erhöhte Calciumfreisetzung während der Systole sowie eine beschleunigte Calciumwiederaufnahme während der Diastole. Zudem wurden die RKIP-Mutanten RKIPS51V und RKIPS52V im Hinblick auf ihre Kontraktilität untersucht. Neonatale Rattenkardiomyozyten welche RKIPS51V und RKIPS52V überexprimierten zeigten weder im Hinblick auf auftretende Spontankontraktionen noch bei der Analyse der Calciumtransienten signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe. Da auch eine Phosphorylierung an Aminosäureposition 51 bzw. Aminosäureposition 52 ohne direkte Auswirkung auf die Kontraktilität möglich ist, wurde in einem in vitro Kinase Assay analysiert, ob neben der bekannten Phosphorylierungsstelle S153 eine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKA oder PKC erfolgt. Bei Einsatz der an Aminosäureposition 153 phosphorylierungsdefizienten RKIP Mutante RKIPS153A konnte keine Phosphorylierung beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit konnte neben einer Phosphorylierung an S153 keine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKC oder PKA beobachtet werden. / By phosphorylation, GRK2 inactivates cardiac ß-adrenoreceptors and thereby reduces the contractility of neonatal rat cardiomyocytes. As a natural inhibitor of GRK2, RKIP influences cell signaling when ß-adrenoreceptors are stimulated. The presented research shows that an overexpression of RKIP increases the contractility of neonatal rat cardiomyocytes. The number of spontaneous contractions occurring before and after stimulation with isoproterenol was recorded and a temporal analysis of calcium release and uptake after electrical stimulation was performed. In the unstimulated state, neonatal rat cardiomyocytes which overexpressed wild-type RKIP showed no significant differences in terms of spontaneous contractions compared with the control group. After stimulation with isoproterenol, neonatal rat cardiomyocytes in which wild-type RKIP was overexpressed showed a significantly higher number of occurring spontaneous contractions. Neonatal rat cardiomyocytes overexpressing wild-type RKIP showed an increased calcium release during systole and an accelerated calcium reuptake during diastole. The RKIP mutants RKIPS51V and RKIPS52V were examined regarding their contractility. Neonatal rat cardiomyocytes which overexpressed RKIPS51V and RKIPS52V showed no significant differences compared to the control group in terms of spontaneous contractions or calcium cycling. Since phosphorylation at amino acid position 51 or amino acid position 52 could also be possible without direct effect on contractility, an in vitro kinase assay focusing on PKA and PKC was performed. In the presented work, apart from phosphorylation at S153, no further phosphorylation of RKIP by PKC or PKA could be observed.

Unterhalb des Interleukin 3 (Il-3) Rezeptors sind zwei Ras-abhängige Signalwege beschrieben, die entweder zur Aktivierung von C-Raf oder von PI3-Kinase (PI3K)/Proteinkinase B (PKB, AKT) führen und Wachstum und Überleben vermitteln. Frühere Untersuchungen des Mechanismus, über den C-Raf Apoptose unterdrückt, zeigten die Notwendigkeit einer Anwesenheit der zytoplasmatischen Kinase an den Mitochondrien. Diese Translokation konnte entweder durch Überexpression des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 oder aber durch Fusion der Kinase mit dem mitochondriellen Protein Mas p70 erreicht werden. Aktiviertes mitochondriell gebundenes C-Raf ist nicht in der Lage ERK1 und ERK2 zu aktivieren, vermag aber durch Inaktivierung des proapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes BAD Apoptose zu unterdrücken. Ungeachtet dieser Ergebnisse deuteten andere genetische und biochemische Untersuchungen auch auf eine Bedeutung der Raf Effektoren MEK und ERK in der Unterdrückung des programmierten Zelltodes hin. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher die Bedeutung von MEK und MEK-abhängigen Signalwegen für das zelluläres Überleben untersucht. Wir nutzten für diese Untersuchungen überwiegend die Il-3 abhängige Zelllinie 23D. MEK war essentiell für das zelluläre Überleben und Wachstum nach Stimulation durch Il-3. Eine konstitutiv aktive MEK1 Mutante verzögerte signifikant das Einsetzen der Apoptose nach Entzug des Wachstumsfaktors, während eine dominant negative Mutante den Zelltod akzelerierte. In der Fibroblastenzelllinie NIH 3T3 unterdrückte eine konstitutiv aktive Mutante von ERK2, ähnlich effektiv wie onkogenes MEK, durch Doxorubicin induzierten Zelltod. Diese Beobachtung lässt auf einen, das Überleben der Zelle vermittelnden, Signalweg von MEK schließen, der zur Aktivierung von ERK führt. Der protektive Effekt von aktiviertem MEK in 32D Zellen wurde durch MEK- und PI3K-abhängige Mechanismen vermittelt. Die dabei beobachtete Aktivierung von PI3K führt zur Phosphorylierung und Aktivierung von AKT. Die Abhängigkeit von MEK und PI3K Signalwegen konnte auch für den Schutz von 32D Zellen vor Apoptose durch onkogenes C-Raf gezeigt werden. Diese Befunde ließen sich ebenso in der Il-3 abhängigen pro-B Zelllinie BaF3 verifizieren, was darauf schließen lässt, dass die Rekrutierung von MEK/ERK im antiapoptotischen Signalweg von aktiviertem Raf ein allgemeingültiger Mechanismus ist. Dass in diesem antiapoptotischen Signalweg von C-Raf auch der PI3K Effektor AKT notwendig ist zeigten weitere Untersuchungen, in denen eine dominant negative Mutante von AKT den protektiven Effekt von aktiviertem C-Raf inhibierte, während eine konstitutiv aktive Form von AKT einen synergistischen Effekt mit C-Raf in der Unterdrückung der Apoptose hatte. Diese Daten zeigen einen, zelluläres Überleben vermittelnden Effekt von Raf, der durch MEK und AKT vermittelt wird. / Two Ras effector pathways leading to the activation of C-Raf and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) have been implicated in the survival signaling by the interleukin 3 (IL-3) receptor. Analysis of apoptosis suppression by C-Raf demonstrated the requirement for mitochondrial translocation of the kinase in this process. This could be achieved either by overexpression of the antiapoptotic protein Bcl-2 or by targeting C-Raf to the mitochondria via fusion to the mitochondrial protein Mas p70. Mitochondrially active C-Raf is unable to activate extracellular signal-related kinase 1 (ERK1) and ERK2 but suppresses cell death by inactivating the proapoptotic Bcl-2 family member BAD. However, genetic and biochemical data also have suggested a role for the C-Raf effector module MEK-ERK in apoptosis suppression. We thus tested for MEK requirement in cell survival signaling using the interleukin 3 (IL-3)-dependent cell line 32D. MEK is essential for survival and growth in the presence of IL-3. Upon growth factor withdrawal the expression of constitutively active MEK1 mutants significantly delays the onset of apoptosis, whereas the presence of a dominant negative mutant accelerates cell death. Survival signaling by MEK most likely results from the activation of ERKs since expression of a constitutively active form of ERK2 was as effective in protecting NIH 3T3 fibroblasts against doxorubicin-induced cell death as oncogenic MEK. The survival effect of activated MEK in 32D cells is achieved by both MEK- and PI3K-dependent mechanisms and results in the activation of PI3K and in the phosphorylation of AKT. MEK and PI3K dependence is also observed in 32D cells protected from apoptosis by oncogenic C-Raf. Additionally, we also could extend these findings to the IL-3-dependent pro-B-cell line BaF3, suggesting that recruitment of MEK is a common mechanism for survival signaling by activated Raf. Requirement for the PI3K effector AKT in this process is further demonstrated by the inhibitory effect of a dominant negative AKT mutant on Raf-1-induced cell survival. Moreover, a constitutively active form of AKT synergizes with Raf-1 in apoptosis suppression. In summary these data strongly suggest a Raf effector pathway for cell survival that is mediated by MEK and AKT.