Diss. (sammanfattning) Umeå : Univ., 2003. / Härtill 5 uppsatser.

The liver is a vital organ, playing numerous critical roles in the body. The liver's ability to perform essential functions is disturbed by injuries that are often associated with many complications such as calcification. Although many reports in the literature document observations of liver calcification, the mechanisms regulating this phenomenon remain unclear. Herein, we aim to investigate the cellular and molecular events that occur during pathological calcification of the liver. / To study the mechanisms of calcification, assessments included histological-staining, immunolabeling, and biochemical and electron microscopy analyses. The findings suggest that calcification may result from hydroxyapatite precipitation in necrotic or apoptotic hepatocytes. Similarly, calcification may be associated with differentiated myofibroblasts expressing bone matrix proteins downstream of TGFbeta signalling. / To identify specific protein regulators linked to the various stages in calcification, and to assess the protein composition of the tissue, a proteomic analysis was used. This analysis identified IQGAP1, an effector of the Rho-GTPases and a master regulator of cell adhesion and migration. IQGAP1 is strongly expressed in myofibroblasts, suggesting that IQGAP1 may be implicated in myofibroblasts migrating towards calcification. Studies on IQGAP1 interactions with its binding partners reveal that it is part of a protein complex that includes beta-catenin, an adhesion protein, and Rac1, a cytoskeletal regulator. These results suggest that IQGAP1 may play an important role in myofibroblast migration upon liver injury. / Having identified that activin and TGFbeta signalling are activated in myofibroblasts, we hypothesised that they may stimulate myofibroblast differentiation and proliferation. Studies using a C3H/10T1/2 cell model reveal that both activin and TGFbeta stimulate differentiation, but only activin induces cell proliferation in a Smad-independent fashion, which requires activation of the ERK/MAPK pathway. / In summary, this work provides new mechanistic insights on the global regulation of liver calcification. The various phases of this work collectively cover the central role of myofibroblasts in liver injury: association with calcification, rapid proliferation, differentiation to an activated form, and migration toward the injured area. The findings allow us to better understand the mechanisms by which liver myofibroblasts are regulated in a specific pathological context.

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Les petites GTPases RAS alternent entre une forme inactive liée au GDP et une forme active liée au GTP. Ce mécanisme permet aux protéines RAS de transmettre les signaux des récepteurs se trouvant à la surface cellulaire vers divers réseaux de signalisation en aval. La protéine RAS joue un rôle important dans plusieurs fonctions biologiques, notamment la prolifération cellulaire, la survie cellulaire et même l'apoptose. Les mutations des gènes de la famille RAS sont retrouvées dans environ un tiers des tumeurs. HRAS, KRAS et NRAS, les trois principaux homologues de la protéine RAS, sont principalement mutées au niveau des codons 12, 13 ou 61. Les mutations avec un effet de gain de fonction au niveau de ces codons rendent ces protéines RAS constitutivement actives et sont à l’origine des signaux hyperprolifératifs. Depuis la découverte de la protéine RAS, de nombreuses "protéines effectrices RAS" agissant en aval ont été identifiées. Le rôle biologique de la plupart de ces effecteurs RAS est lié à la prolifération et à la survie des cellules. Cependant, au cours des deux dernières décennies une nouvelle famille d'effecteurs RAS, les protéines RASSF, a été découverte comme ayant une fonction pro-apoptotique. Les protéines suppresseures de tumeurs de la famille RASSF sont fréquemment inhibées dans les cellules cancéreuses humaines. Il existe 10 homologues de RASSF (RASSF1-10) chez humain, chacun comprenant un domaine d'association RAS (RA) impliqué dans la liaison avec les GTPases RAS. Plusieurs RASSF comportent également les domaines SARAH (Salvador-RASSF-Hippo), connus pour interagir avec les kinases Hippo contenant aussi les domaines SARAH. On ne sait toutefois pas si toutes les protéines RASSF sont de véritables effecteurs RAS. Il a été démontré qu'un seul membre de la famille RASSF, appelé RASSF5, s'associe directement à HRAS et cette interaction a été validée par des études cristallographiques à rayons X. Dans la première partie de cette thèse, je démontre qu'aucun autre membre de la famille RASSF n'interagit directement avec KRAS. En me servant de la modélisation par l'homologie du domaine RA hautement apparenté de RASSF1, j’ai identifié les acides aminés essentiels pour l’interaction avec la GTPase. Je démontre que la substitution d’un seul acide aminé dans la protéine RASSF1 permet l'interaction avec KRAS, et je pose l'hypothèse que ce résidu, ayant divergé au cours de l'évolution, a modifié la spécificité de RASSF1 pour les petites GTPases. En utilisant une approche informatique, nous avons prédit six GTPases candidates que pourraient interagir avec RASSF1 : GEM, REM1, REM2, RASL12, ERAS et DIRAS3. J'ai validé les interactions avec plusieurs GTPases RGK (GEM, REM1, REM2) et j’ai démontré que la co-expression des GTPases RGK avec RASSF1 active la voie Hippo. Ainsi, je propose un nouveau lien entre ces GTPases peu étudiées et la régulation de la voie de signalisation Hippo. Dans la deuxième partie de ma thèse, je tente de rediriger la signalisation de prolifération cellulaire de KRAS (RAF/MAPK) vers une signalisation impliquant les effecteurs pro-apoptotiques (RASSF-Hippo). Pour y parvenir, j'ai conçu des mutations dans KRAS dans le but d’augmenter son affinité pour RASSF5 et d’affaiblir son interaction avec BRAF. Comme deuxième stratégie, j'ai remplacé les résidus divergents de l'effecteur RASSF1 par les résidus correspondants de RASSF5 et j’ai démontré que cette variante de RASSF1 est capable de lier KRAS. Diverses approches biophysiques et biochimiques ont été utilisées pour valider KRAS et RASSF1 mutés, impliquées dans cette signalisation redirigée. Les études de co-localisation montrent que ces mutants interagissent avec leurs nouveaux partenaires comme prévu. D’autre part, je démontre par les expériences intracellulaires que KRAS modifiée ne lie plus BRAF tout en interagissant fortement avec RASSF5 et RASSF1, et que les mutants établis activent la voie Hippo. Ainsi, j'ai développé deux approches qui nous aideront à étudier la signalisation de KRAS dans la voie pro-apoptotique impliquant RASSF en absence de l’activation de la voie des MAP kinases. Les données présentées ici nous permettent de mieux comprendre la manière dont les protéines RASSF ont divergé au cours de l'évolution; cette divergence leur empêchant d’interagir avec les RAS. Ces données fournissent également une stratégie innovante pour rediriger les signaux RAS vers les effecteurs RASSF, qui pourrait être utilisée comme nouvelle stratégie dans les études cliniques utilisant RAS comme cible thérapeutique. / RAS small GTPases function as molecular switches to transduce signals from cell surface receptors to various downstream signalling networks. The RAS protein has roles in multiple biological functions, including cell proliferation, survival, and even apoptosis. Mutations in RAS genes are present in up to 30% of all human tumors. The three major RAS homologs HRAS, KRAS, and NRAS are each found mutated, predominantly at codons 12, 13 or 61. Gain-of-function mutations at these codons render these RAS proteins constitutively active and thereby produce hyperproliferative signals. Since the discovery of RAS, numerous downstream ‘RAS effector proteins’ have been identified. The biological role of most identified RAS effectors relates to cell proliferation and survival, however, in the past two decades a new family of RAS effectors, RASSF proteins, were discovered to have a pro-apoptotic function. The RASSF family of tumor suppressors proteins are frequently downregulated in human cancer cells. There are 10 RASSF homologs (RASSF1-10) in humans, each comprising a RAS association (RA) domain presumed to bind RAS GTPases. RASSF also encode SARAH (Salvador-RASSF-Hippo) domain, known to interact with SARAH-containing Hippo kinases. It is not clear whether all the RASSF proteins are true RAS effectors. Only a single family member, RASSF5, has been shown to directly associate with HRAS and this interaction has been completely validated by X-Ray crystallographic studies. In the first part of this thesis, I demonstrate that no other RASSF family members directly interact with KRAS. I used homology modelling of the highly related RASSF1 RA domain to identify amino acids crucial to GTPase binding. I show that a single amino acid substitution in RASSF1 enables interaction with KRAS, and hypothesize that this evolutionarily diverged residue has altered RASSF1 specificity for small GTPases. Using an informatics approach, we predicted six candidate GTPases that could interact with RASSF1: GEM, REM1, REM2, RASL12, ERAS and DIRAS3. I validated interactions with several RGK GTPases (GEM, REM1, REM2) and show that co-expression of RGK GTPases with RASSF1 activates the Hippo pathway. Thus, I show a novel link between these unstudied GTPases to Hippo pathway regulation. In the second part of my thesis I attempt to rewire KRAS signalling from cell proliferation pathways (RAF/MAPK) to pro-apoptotic effectors (RASSF-Hippo). To achieve this, I designed mutations in KRAS that augmented its affinity for RASSF5 and weakened interaction with BRAF. As a second strategy, I reverted evolutionarily diverged residues in the RASSF1 effector to corresponding residues in RASSF5 and demonstrate that this variant now binds KRAS. Various biophysical and biochemical approaches were used to validate both the KRAS and RASSF1 rewired mutants, and co-localization studies show that these mutants interact with their new binding partners as predicted. Further, I demonstrate that our rewired KRAS no longer binds BRAF in cells but interacts strongly with RASSF5 and rewired RASSF1, and that the rewiring mutants activate the Hippo pathway. Thus, I have developed two rewiring approaches that will help us to study KRAS signalling towards pro-apoptotic RASSF pathway in the absence of strong MAP kinase activation. The data presented here provide several novel insights into how RASSF proteins diverged through evolution and are not all direct effectors of RAS. In addition, I present an innovative rewiring strategy to couple RAS signals towards RASSF effectors which can be a clinical tactic to target RAS oncogenesis.

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RAS est une GTPase qui transduit les signaux extracellulaires envers des voies de signalisation intracellulaires, en liant ses effecteurs. RAS peut activer la voie Hippo qui inhibe la croissance cellulaire et qui est souvent dérégulée dans le cancer. Les protéines RASSF suppresseurs de tumeurs relient RAS à la voie Hippo. L’expression exogène de KRASG12V avec RASSF1 ou RASSF5 conduit à l'activation de la voie Hippo, bien que KRAS et RASSF1 ne s’associent pas directement. Ce projet de maîtrise vise à identifier les protéines impliquées dans l'activation de la voie Hippo par RAS. Nous avons effectué plusieurs expériences BioID, une technique qui permet d’identifier les interacteurs proximaux d’une protéine d’intérêt, dans des lignées cellulaires U2OS stables et inductibles exprimant les protéines KRASG12V, RASSF1 ou RASSF5 seules ou coexprimées, permettant de comparer les conditions où la voie Hippo inactive ou active. Nous avons élucidé l'interactome d'un mutant de KRAS avec affinité accrue envers RASSF5 et affinité réduite envers RAF, permettant d’étudier les voies activées en aval de RASSF5, avec une activation réduite de la voie MAPK. Nos données montrent que RASSF1 et RASSF5 relâchent les kinases Hippo MST1 et MST2 lorsque la voie Hippo est active, conformément aux données in vitro démontrant un rôle inhibiteur de l'interaction RASSF/MST. De plus, nous avons démontré que KRAS est un interacteur proximal des protéines VAMP3 et SNAP23. Comprendre comment l'oncoprotéine RAS active des effecteurs et des voies de signalisation moins étudiés, en particulier ceux qui ont des fonctions suppressives de tumeurs a des implications importantes pour le développement de nouvelles thérapies ciblées pour les cancers induits par RAS. / RAS is a small GTPase that transduces signals from membrane-bound receptors to intracellular pathways, by signaling to downstream effector proteins. RAS can activate the Hippo pathway, a growth-suppressive pathway that is often dysregulated in cancer. The tumor suppressor RASSF proteins link RAS to Hippo signaling. Co-expression of KRASG12V with either RASSF1 or RASSF5 leads to Hippo pathway activation, despite KRAS and RASSF1 not being direct binding partners. This M.Sc. project aims to identify proteins that are involved in RAS-mediated activation of the Hippo pathway. We performed BioID, a proteomic technique which is used to identify the proximal interactors of a protein of interest, in stable and inducible U2OS osteosarcoma lines expressing KRASG12V, RASSF1, or RASSF5 proteins alone, as well as in lines co-expressing both KRASG12V and the RASSF proteins, allowing for a comparison between inactive and active Hippo pathway interactomes. Furthermore, we mapped the interactome of a double mutant of KRAS that displays increased affinity for RASSF5 and decreased affinity for the effector RAF, allowing us to study KRAS signaling downstream of RASSF5, with decreased activation of the MAPK pathway. Our BioID data shows that RASSF1 and RASSF5 disengage the Hippo kinases MST1 and MST2 when the Hippo pathway is active, in line with the inhibitory role of the RASSF/MST interaction observed in vitro. Furthermore, we show that KRAS is a proximal interactor of the SNARE proteins VAMP3 and SNAP23. Understanding how the oncoprotein RAS signals to less studied effectors and pathways, particularly those with tumor suppressive functions has significant implications for understanding oncogenesis, and for development of new targeted therapies for RAS-driven cancers.