Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_suselaine_de_goes_madeira.pdf: 652203 bytes, checksum: 896583af93cb2ee4488550d558cab177 (MD5) Previous issue date: 2007-12-07 / Tuberculosis, caused by Mycobacterium tuberculosis, is one of the most serious infectious illnesses in the world, being responsible for millions of deaths. Despite the use of the vaccination with M. bovis BCG, the number of new cases remains high. Immunological methods are hampered by the reaction afforded by BCG. Better diagnostic tools should allow detection and treatment of infected patients before they develop active disease. Antigens present in M. tuberculosis but absent from the vaccine strain are needed for this purpose. Therefore, this work has been developed aimed at the characterization of proteins Rv3402, Rv3404 and Rv3405, contained in RD16, missing only region M. bovis BCG Moreau, the strain vaccine used in Brazil, but present in all other strains of BCG and M. Tuberculosis. The genes rv3402, rv3404 and rv3405 were obtained by PCR from M. tuberculosis H37RV and cloned in the vector pENTR/D/Topo (Gateway System Invitrogen) and used to transform Escherichia coli TOP10F. The coding sequence for each gene was then transferred to the expression vector pDEST17, which allows the fusion of the protein with a tail of histidine, facilitating their purification. After extracted and purified, these plasmids were used to transform E. coli BL21 pLysS. The purification of the protein was performed by affinity chromatography using the ÄKTAPrime system (Amersham Biosciences). BALB/c mice were inoculated with purified proteins and serum obtained from these animals was used for characterization of the proteins by ELISA and Western blot. It was possible to demonstrate that the proteins are immunogenic and that they are expressed by M. tuberculosis. The protein contained in the RD16 and evaluated in this study, were quantified in a concentration of 0.5 mg.mL-1 for Rv3402 and Rv3404 and 0.2 mg.mL-1 for Rv3405 and were able to induce a specific and statistically significant humoral immune response in immunized mice, indicating that they can be used for the development of immunodiagnostic tests for tuberculosis, aiming to differentiate individuals vaccinated and infected with the tuberculosis bacillus. / Tuberculose, causada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis, é uma das mais graves doenças infecciosas no mundo, sendo responsável por milhões de mortes. Apesar do uso da vacinação com M. bovis BCG, o número de novos casos continua elevado. Métodos imunológicos para diagnóstico de tuberculose são limitados devido à reação cruzada desencadeada pelo BCG. Novas ferramentas diagnósticas permitiriam a detecção e tratamento de pacientes infectados antes do desenvolvimento da doença ativa, necessitando para isso antígenos presentes em M. tuberculosis, mas ausentes na cepa vacinal. Neste sentido, esse trabalho foi desenvolvido visando à caracterização das proteínas Rv3402, Rv3404 e Rv3405, contidas na RD16, região ausente apenas M. bovis BCG Moreau, a cepa vacinal utilizada no Brasil, mas presente em todas as outras cepas de BCG e em M. tuberculosis. Os genes rv3402, rv3404 e rv3405 foram obtidos por PCR a partir de M. tuberculosis H37RV e clonados no vetor pENTR/D/Topo (Gateway System - Invitrogen) e usados para transformar Escherichia Coli Top10F. A seqüência codificadora de cada gene foi então transferida para o vetor de expressão pDEST17, o qual permite a fusão da proteína com uma cauda de histidina, facilitando a sua purificação. Depois de extraídos e purificados, esses plasmídios foram usados para transformar E. coli BL21 pLysS. A purificação das proteínas foi realizada através de cromatografia de afinidade. Camundongos BALB/c foram imunizados com as proteínas purificadas e o soro obtido destes animais foi utilizado para caracterização das proteínas por Western blot e ELISA. Foi possível demonstrar que as proteínas são imunogênicas e que são expressas por M. tuberculosis. As proteínas contidas na RD16 e avaliadas nesse estudo, foram quantificadas em uma concentração de 0,5 mg.mL-1 para Rv3402 e Rv3404 e 0,2 mg.mL-1 para Rv3405 e foram capazes de induzir uma resposta imune humoral específica e estatisticamente significativa em camundongos imunizados, indicando que podem vir a ser utilizadas para o desenvolvimento de testes de imunodiagnósticos para tuberculose, visando à diferenciação entre indivíduos vacinados e infectados com o bacilo da tuberculose.