Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Benedito Barraviera / Banca: Paulo Inácio da Costa / Banca: Célia Maria de Almeida Soares / Banca: Clarice Queico Fujimura Leite / Resumo: Cryptococcus neoformans é patógeno importante, principalmente em pacientes imunocomprometidos. A principal porta de entrada deste patógeno é pela via respiratória, disseminando-se posteriormente e atingindo principalmente o sistema nervoso central, provocando a meningite criptocóccica. A primeira parte deste estudo teve como objetivos determinar, nos 106 isolados clínicos de C. neoformans obtidos de dois Estados (São Paulo e Rio de Janeiro), (1) as variedades e (2) os mating-types por PCR (Polymerase Chain Reaction), (3) analisar a diversidade genética por PCR-fingerprinting com a seqüência iniciadora específica para regiões microssatélite (GACA)4, (4) por RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) com o iniciador 6 e (5) por PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) do gene da fosfolipase B (PLB1) digerido com a enzima de restrição AvaI e (6) determinar a sensibilidade a quatro antifúngicos (fluconazol, itraconazol, 5-fluorocitosina e anfotericina B) seguindo o método de referência (documento M27-A2) do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). A segunda parte teve como objetivo, analisar transcritos diferencialmente expressos durante a infecção pulmonar de C. neoformans, pela técnica de RDA (Representational Difference Analysis). Entre os 106 isolados, 104 foram identificados como C. neoformans e apenas dois foram C. gattii (=C. neoformans var. gattii), todos MATa. O tipo molecular VNI (C. neoformans var. grubii, sorotipo A) foi o mais prevalente entre os isolados (97/106), seguido do tipo VNII (C. neoformans var. grubii, sorotipo A) (7/106) e VGII (C. gattii, sorotipos B ou C) (2/106) quando analisados por PCR-fingerprinting e PCR-RFLP. Homogeneidade alta foi obtida com o iniciador (GACA)4, com a maioria dos isolados apresentando correlação em torno de 0,9. Os resultados do RAPD, por sua vez, revelaram maior heterogeneidade com número maior de perfis moleculares. / Abstract: Cryptococcus neoformans is an important pathogen, mainly in immunocompromised patients. The pathogen penetrates mainly by respiratory way, disseminate afterward and reach specially the central nervous system causing the cryptococcal meningitis. The first part of this study had the objective to determine, in the 106 clinical isolates of C. neoformans obtained from São Paulo and Rio de Janeiro State, (1) the varieties and (2) mating-types by PCR (Polymerase Chain Reaction), (3) analyze the genetic diversity by PCR-fingerprinting with specific primer to microsatellite regions (GACA)4, (4) by RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) with primer 6 and (5) by PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) of the phospholipase B gene (PLB1) digested with restriction enzyme AvaI and (6) to determine the susceptibility to four antifungal (fluconazole, itraconazole, 5-flucytosine and amphotericin B) following the reference method (document M27-A2) from CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute). The second part had the goal to analyze differentially expressed transcription during pulmonary infection of C. neoformans, by RDA (Representational Difference Analysis) technique. Among 106 isolates, 104 were identified as C. neoformans and only two were C. gattii (=C. neoformans var. gattii), all MATa. The molecular type VNI (C. neoformans var. grubii, serotype A) was the most prevalent among the isolates (97/106), followed by VNII (C. neoformans var. grubii, serotype A) (7/106) and VGII (C. gattii, serotypes B ou C) (2/106) when analyzed by PCR-fingerprinting and PCR-RFLP. High homogeneity was obtained with the primer (GACA)4, with most of the isolates showing correlation around 0.9. By contrast, the RAPD analysis revealed more heterogeneous with more numbers of molecular profiles. / Doutor

Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Clarice Queico Fujimura Leite / Banca: Celia Maria de Almeida Soares / Banca: Paulo Inácio da Costa / Banca: Mário Hiroyuki Hirata / Resumo: As dermatofitoses são processos infecciosos de pele, pêlo e unhas muito comuns no mundo inteiro. Trichophyton rubrum é o dermatófito mais freqüentemente isolado em lesões superficiais de pele e unha. Estudos envolvendo este patógeno são cada vez mais importantes devido ao aparecimento de linhagens resistentes aos medicamentos antifúngicos disponíveis no mercado e ao comportamento invasivo deste agente em pacientes com o sistema imune comprometido. Estes fatos e poucos estudos levam à necessidade de se ampliar o conhecimento sobre a biologia deste agente. Visando colaborar nesse sentido, o presente trabalho teve dois objetivos centrais: 1) Realizar a tipagem molecular de isolados clínicos de T. rubrum com e sem relação epidemiológica por RAPD (Amplificação Randômica de DNA Polimórfico) com duas seqüências randômicas diferentes (denominadas de 1 e 6), bem como a análise dos elementos repetitivos (TRS-1 e TRS-2) do espaço não transcrito (NTS) do DNA ribossomal (DNAr) e 2) Identificar transcritos envolvidos na interação deste patógeno com fonte humana de queratina, através do RDA (Análise de Diferença Representacional). A aplicação do RDA permitiu pela primeira vez a identificação de alguns transcritos expressos, provavelmente relacionados à patogênese deste microrganismo. / Abstract: Dermatophytosis is common infection process which occurs in skin, hair and nails and Trichophyton rubrum is the most frequently isolated dermatophyte. Studies on this pathogen are becoming increasingly important because of frequent reports on resistant strains to antifungal drugs commercially available and the invasive behavior of these agents in immunocompromised patients. These facts, associated with few studies with this agent, indicate the need to expand the information about the fungal biology. As a contribution to this goal, the present study had two central objectives: 1) To compare different methodologies for molecular typing of clinical isolates of T. rubrum epidemiologically related and unrelated for RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) with two different random primers (denominated of 1 and 6); as well as the analysis of the repetitive elements (TRS-1 and TRS-2) of the space non-transcribed (NTS) of the ribosomal DNA (DNAr) and 2) To identify transcripts involved in the interaction of this pathogen with human keratin by RDA (Representational Difference Analysis). The application of the RDA allowed for the first time the identification of expressed transcripts during the microorganism proliferation that could be related to the T. rubrum virulence. / Doutor