RNA editing in trypanosomes is the post-transcriptional insertion or deletion of uridylates at specific sites in mitochondrial mRNAs. This process is catalyzed by a multienzyme, multisubunit complex through a series of enzymatic cycles directed by small, trans-acting RNA molecules. Despite impressive progress in our understanding of the mechanism of RNA editing and the composition of the editing complex, fundamental questions regarding RNP assembly and the regulation of catalysis remain. This dissertation presents studies of RNA-protein interactions between RNA editing complexes and substrate RNAs and the determination of substrate secondary structural determinants that govern them. Our results suggest that substrate association, cleavage and full-round editing by RNA editing complexes in vitro obey hierarchical determinants that increase in complexity as editing progresses and we propose a model for substrate recognition by RNA editing complexes. In addition, this dissertation also presents the characterization of a novel mitochondrial RNA helicase, named REH2 and its macromolecular interactions. Our data suggest that REH2 is intimately involved in interactions with macromolecular complexes that integrate diverse processes mediating mitochondrial gene expression. These results have implications for the mechanism of substrate RNA recognition by RNA editing complexes as well as for the integration of RNA editing to other facets of mitochondrial RNA metabolism.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2003. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 164-175).

Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2005. / Available online via OhioLINK's ETD Center; full text release delayed at author's request until 2008 Nov 30

Thesis (Ph.D. in Human Medical Genetics) -- University of Colorado, 2006. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 118-127). Free to UCDHSC affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

This thesis describes the dynamics of mitochondrial RNA-binding protein 1 and 2 (MRP1/2) complex in different cell lines of Trypanosoma brucei under an optimized immobilized condition. This study reveals the influence of RNA on the complex's dynamics. Furthermore, the function of RNA-binding complex 1 (MRB1) core has been studied via reverse genetic, biochemical and molecular techniques, with its role in RNA editing being proposed.

This thesis characterizes RNA footprints of several RNA-binding proteins (RBPs) thatare involved in U-insertion/deletion, A-to-I, and C-to-U RNA editing in Trypanosoma brucei. Relying on iCLIP data and biochemical methods it shows that two paralogs proteins from the MRB1 complex regulate distinct editing fates of the mitochondrial transcripts. Further, this thesis provides evidence where the combinatorial interplay of RBPs might fine-tune the levels of edited mRNA. Finally, the presented thesis adds to the growing evidence of the importance of RBPs in post-transcriptional gene regulation.

The function of two subunits of the putative mitochondrial RNA binding complex (MRB1) associated with RNA editing in parasitic protist Trypanosoma brucei was studied using various in vivo and in vitro methods of molecular biology.

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez la femme et représente la principale cause de mortalité liée au cancer. Le décés est habituellement causé par le développement de résistance aux traitements et la propagation métastatique de la maladie. Malgré la pertinence clinique, la complexité moléculaire de la maladie et sa dynamique restent à ce jour peu connues.Depuis longtemps, l’hétérogénéité du cancer du sein a été observée au niveau histologique et du profil évolutif clinique, et ces différences ont servi de base pour la classification de la maladie. Avec le développement des technologies à haut débit, telles que les puces à damier (microarrays) et le séquençage à haut débit, cette classification a été affinée et une complexité génétique jusqu'alors inconnue a été révélée.Des études utilisant ces techniques ont montré que des différences moléculaires existent non seulement entre les différentes patientes atteintes d’un cancer du sein (hétérogénéité inter-tumorale), mais aussi chez la même patiente (hétérogénéité intra-tumorale). En outre, l'hétérogénéité intra-tumorale peut exister non seulement entre les différentes parties d'une tumeur (hétérogénéité intra-tumorale spatiale) mais elle peut aussi résulter de l’évolution moléculaire d'une tumeur au cours du temps (hétérogénéité intra-tumorale temporelle). Cette complexité pourrait avoir un impact important sur la façon dont les patientes atteintes d’un cancer du sein sont prises en charge et traitées.La recherche que j’ai menée dans le Breast Cancer Translational Research Laboratory sous la direction du Professeur Christos Sotiriou avait deux objectifs principaux. Le premier était de déterminer l'ampleur et les implications cliniques de l'hétérogénéité intra-tumorale dans deux scénarios cliniques courants, à savoir: les cancers du sein multifocaux (MFBCs) et les cancers du sein métastatiques ER positif / HER2 négatif. Le deuxième était d'étudier l'impact de l'édition de l'ARN dans la détermination de l'hétérogénéité inter-tumorale, phénomène encore peu caractérisé. Notre recherche a notamment montré que:1) Les lésions de tous les MFBCs que l’on a étudiés partagent une origine commune. Malgré cela, et malgré des caractéristiques pathologiques similaires, chez un tiers des patientes, les lésions multifocales d’une même patiente ne partageaient aucune substitution et aucune insertion/déletion. De plus, l’hétérogénéité inter-lésion a été observée pour des mutations oncogéniques dans des gènes tels que PIK3CA, TP53, GATA3 et PTEN;2) En se concentrant sur un nombre défini de gènes associés au cancer, une concordance substantielle des mutations et du nombre de copies des gènes a été observée entre les lésions primaires et métastatiques appariées de cancers du sein ER positif / HER2 négatif. Des différences entre les lésions appariées ont cependant été trouvées pour les niveaux d’expression de certains gènes. Dans les lésions primaires, seuls les niveaux d’expression de quelques gènes et un niveau élevé d'amplification de FGFR1 ont été associés à la survie;3) L'édition de l’ARN est une source généralisée de variation du transcriptome dans le cancer du sein. Dans ce cancer, et potentiellement dans tous les cancers, l'édition de l’ARN est principalement contrôlée par deux facteurs, à savoir l'amplification de 1q et l'inflammation, qui sont toutes deux très répandues parmi les cancers humains. La magnitude de l'édition de l’ARN, en combinaison avec la conservation des sites d'édition détectés dans les tissus et les patientes, suggère qu'il pourrait y avoir des implications cliniques et thérapeutiques pour un large éventail de patientes atteintes d’un cancer.Nos résultats suggèrent qu'une caractérisation moléculaire approfondie des cancers du sein multifocaux et métastatiques est importante pour apprécier leur complexité, et que dans la recherche sur le cancer du sein, plus d’importance devrait être accordée à l'édition de l'ARN, un phénomène encore peu étudié qui pourrait influencer notre connaissance sur le développement et l'évolution de la maladie. / Breast cancer still represents the most frequently diagnosed cancer and the leading cause of cancer-related mortality in women. Death is usually caused by the development of resistance to treatments and the resulting metastatic spread of the disease. Despite the clinical relevance, little is known about the molecular complexity of the disease and its dynamics.Breast tumor heterogeneity has been observed at the level of the histology and the natural history of the disease for a long time, and these differences have served as the basis for disease classification. With the advent of high-throughput technologies, such as gene expression microarrays and massively parallel sequencing, this classification has been refined and a previously unknown genetic complexity has been revealed. Studies implementing these technologies have shown that molecular dif¬ferences exist not only between different breast cancer patients (inter-tumor heterogeneity), but also within the same patient (intra-tumor heterogeneity). Furthermore, intra-tumor heterogeneity could occur either between different regions of a tumor (spatial intra-tumor heterogeneity), or as the result of the molecular evolu¬tion of a tumor over time (temporal intra-tumor heterogeneity). This complexity might have a profound impact on the way breast cancer patients are managed and treated. The research work that I carried out in the Breast Cancer Translational Research Laboratory under the direction of Prof Christos Sotiriou had two main aims. The first was to determine the extent and the clinical implications of intra-tumor heterogeneity in two common clinical scenarios, namely: multifocal breast cancers (MFBCs) and metastatic ER positive/HER2 negative breast cancers. The second was to investigate the potential impact of yet poorly characterized phenomenon, such as RNA editing, in determining inter-tumor heterogeneity. For this purpose, I have conducted three main projects, which resulted in three manuscripts.We showed that:1) The lesions of all the investigated MFBCs shared a common origin. Despite this, and despite having similar pathological features, in up to a third of the patients the lesions of the same MFBC didn’t share any substitution/indels, and inter-lesion heterogeneity was observed for oncogenic mutation(s) in genes such as PIK3CA, TP53, GATA3, and PTEN; 2) When focusing on a defined number of cancer-associated genes, a substantial concordance for mutations and copy number aberrations could be found between primary and matched metastatic lesions of ER positive/HER2 negative breast cancers. Differences between matched pairs could however be found for the level of expressions of few genes. In primary lesions, only the expression levels of few genes and high FGFR1 amplification levels were associated with OS;3) A-to-I RNA editing is a pervasive source of transcriptome variation in breast cancer. In breast and potentially all cancers, A-to-I editing is mainly controlled by two factors, namely 1q amplification and inflammation, both of which are highly prevalent among human cancers. The wide-spread editing observed, in combination with the conservation of editing sites detected across tissues and patients, suggests that there might be clinical and therapeutic implications for a wide range of cancer patients.Our results suggest both that a thorough molecular characterization of multifocal and metastatic breast cancers is important to appreciate their genomic complexity, and that in breast cancer research more relevance should be given to RNA editing, a yet poorly investigated phenomenon that has the potential to impact the development and the evolution of the disease. / Doctorat en Sciences médicales (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第22284号 / 理博第4598号 / 新制||理||1660(附属図書館) / 京都大学大学院理学研究科生物科学専攻 / (主査)教授 鹿内 利治, 教授 長谷 あきら, 准教授 竹中 瑞樹 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DGAM

付記する学位プログラム名: 充実した健康長寿社会を築く総合医療開発リーダー育成プログラム / 京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医科学) / 甲第22697号 / 医科博第112号 / 新制||医科||8(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医科学専攻 / (主査)教授 竹内 理, 教授 髙折 晃史, 教授 河本 宏 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM