Thesis (Ph. D.)--Michigan State University. Biochemistry and Molecular Biology, 2008. / Title from PDF t.p. (Proquest, viewed on Aug. 18, 2009) Includes bibliographical references. Also issued in print.

Thesis (Ph. D.)--Hong Kong University of Science and Technology, 2002. / Includes bibliographical references (leaves 105-123). Also available in electronic version. Access restricted to campus users.

RNAs play essential roles in various biological processes. Mounting evidence has demonstrated that RNA subcellular localization and intercellular trafficking govern their functions in coordinating plant growth at the organismal level. Beyond that, plants constantly encounter foreign RNAs (i.e., RNAs from pathogens including viruses and viroids). The subcellular localizations of RNAs are crucial for their function. While numerous types of RNAs (i.e., mRNAs, small RNAs, rRNAs, tRNAs, and long noncoding RNAs) have been found to traffic in a non-cell-autonomous fashion within plants, the underlying regulatory mechanism remains unclear. Viroids are single-stranded circular noncoding RNAs, which entirely rely on their RNA motifs to exploit cellular machinery for organelle entry and exit, cell-to-cell movement through plasmodesmata, and systemic trafficking. Viroids represent an excellent model to dissect the role of RNA 3-dimensional (3D) structural motifs in regulating RNA movement. Using nuclear-replicating viroids as a model, we showed that cellular Importin alpha-4 is likely involved in viroid RNA nuclear import, empirically supporting the involvement of Importin-based cellular pathway in RNA nuclear import. We also confirmed the involvement of a cellular protein (Virp1) that binds both Importin alpha-4 and viroids. Moreover, a conserved C-loop in nuclear-replicating viroids serves as a key signal for nuclear import. Disrupting C-loop impairs Virp1 binding, viroid nuclear accumulation and infectivity. Further, C-loop exists in a subviral satellite noncoding RNA that relies on Virp1 for nuclear import. On the other hand, no viroid can systemically infect the model plant Arabidopsis thaliana, suggesting the existence of non-host resistance yet to be understood. Here, we attempted to test whether a gene involved in RNA silencing, RNA-dependent RNA polymerase 6 (RDR6), plays a role in non-host resistance in Arabidopsis. I will discuss the data below in detail.

a. Do ponto de vista metodológico dois problemas foram enfrentados neste trabalho: i) extração dos RNA\'s e ii) fracionamento das células das glândulas salivares de R. angelae. i) O processo prático elaborado para resolver o primeiro problema se constituiu numa variação da técnica clássica de extração com fenol. Jogando com a presença de detergente e variações de pH e de temperatura, foi possível se chegar a um método que garante a extração e um fracionamento parcial de, praticamente, todo RNA celular. Com extrações a baixa temperatura obtém-se preferencialmente rRNA e tRNA. O RNA refratário a extração com fenol a frio tem propriedades do RNA nuclear, mas o citoplasma, também parece conter classes de RNA somente extraíveis a quente. A dificuldade de extração do RNA nuclear com fenol frio, foi especulativamente interpretada como uma propriedade das RNP\'s que encerram esta classe de RNA. A grande vantagem deste método de extração está no fato de ter permitido isolar, com as extrações a alta temperatura, frações de RNA enriquecidas em produtos de transcrição específicos de determinados períodos do desenvolvimento larval. ii) O fracionamento celular das glândulas salivares não é alcançado pela aplicação das técnicas tradicionais de fracionamento de tecido. Em vista disso foi necessário procurar uma alternativa experimental para êste caso. Combinando um enzima proteolítico com a ação de detergentes não iônicos foi conseguido um método útil para o fracionamento das células das glândulas salivares. Êste método foi aplicado nesta tese para um estudo inicial das RNP\'s e da transferência do rRNA do núcleo para o citoplasma nas células das glândulas salivares. b. Foi possível verificar com êste trabalho que o rRNA é sintetizado inicialmente na forma de um precursor primário de 37s, o qual é processado no interior do núcleo para dar as espécies maduras de rRNA segundo o esquema: (Ver no arquivo) No 3º período do 4º estádio do desenvolvimento larval de R. angelae, a síntese de rRNA é intensa. Neste mesmo período observa-se claramente um nucleolo típico na base do cromossomo X. No período seguinte ocorre uma redução na síntese das formas maduras de rRNA. Esta queda de síntese é desencadeada por um bloqueio ao nível do processamento dos precursores nucleares de rRNA citoplasmático. Estudos citológicos tem revelado que neste período o nucleolo sofre uma aparente desagregação. c. Os resultados de incorporação de uridina-H3 mostraram que o 3º e 4º períodos tem uma velocidade de síntese de RNA muito à do 2º período. No 4º período quando a síntese de rRNA é inibida aumenta de importância a síntese de outras classes de RNA. Aparentemente é muito intensificada a síntese de RNA nuclear. Êstes resultados são interpretados como consequência da ativação de novos genes nesta época do desenvolvimento larval. Êstes fatos não são inesperados pois este estágio se caracteriza pelo desenvolvimento de \"puffs\" gigantes, os quais são específicos do tecido e do período de desenvolvimento. O 5º período parece representar uma fase de transição entre uma época de ativa síntese de RNA e outra onde a atividade transcritiva sofre uma redução drástica, provavelmente devido à histólise do tecido que vai ocorrer logo em seguida. d. Os dados apresentados nesta tese são considerados sob todos os aspectos significativos. Com isto faz-se uma tentativa de discussão crítica, no sentido de avaliar a importância do sistema glândulas salivares de R. angelae, como modelo de estudo para a genética molecular dos organismos superiores. / Not available

a. Do ponto de vista metodológico dois problemas foram enfrentados neste trabalho: i) extração dos RNA\'s e ii) fracionamento das células das glândulas salivares de R. angelae. i) O processo prático elaborado para resolver o primeiro problema se constituiu numa variação da técnica clássica de extração com fenol. Jogando com a presença de detergente e variações de pH e de temperatura, foi possível se chegar a um método que garante a extração e um fracionamento parcial de, praticamente, todo RNA celular. Com extrações a baixa temperatura obtém-se preferencialmente rRNA e tRNA. O RNA refratário a extração com fenol a frio tem propriedades do RNA nuclear, mas o citoplasma, também parece conter classes de RNA somente extraíveis a quente. A dificuldade de extração do RNA nuclear com fenol frio, foi especulativamente interpretada como uma propriedade das RNP\'s que encerram esta classe de RNA. A grande vantagem deste método de extração está no fato de ter permitido isolar, com as extrações a alta temperatura, frações de RNA enriquecidas em produtos de transcrição específicos de determinados períodos do desenvolvimento larval. ii) O fracionamento celular das glândulas salivares não é alcançado pela aplicação das técnicas tradicionais de fracionamento de tecido. Em vista disso foi necessário procurar uma alternativa experimental para êste caso. Combinando um enzima proteolítico com a ação de detergentes não iônicos foi conseguido um método útil para o fracionamento das células das glândulas salivares. Êste método foi aplicado nesta tese para um estudo inicial das RNP\'s e da transferência do rRNA do núcleo para o citoplasma nas células das glândulas salivares. b. Foi possível verificar com êste trabalho que o rRNA é sintetizado inicialmente na forma de um precursor primário de 37s, o qual é processado no interior do núcleo para dar as espécies maduras de rRNA segundo o esquema: (Ver no arquivo) No 3º período do 4º estádio do desenvolvimento larval de R. angelae, a síntese de rRNA é intensa. Neste mesmo período observa-se claramente um nucleolo típico na base do cromossomo X. No período seguinte ocorre uma redução na síntese das formas maduras de rRNA. Esta queda de síntese é desencadeada por um bloqueio ao nível do processamento dos precursores nucleares de rRNA citoplasmático. Estudos citológicos tem revelado que neste período o nucleolo sofre uma aparente desagregação. c. Os resultados de incorporação de uridina-H3 mostraram que o 3º e 4º períodos tem uma velocidade de síntese de RNA muito à do 2º período. No 4º período quando a síntese de rRNA é inibida aumenta de importância a síntese de outras classes de RNA. Aparentemente é muito intensificada a síntese de RNA nuclear. Êstes resultados são interpretados como consequência da ativação de novos genes nesta época do desenvolvimento larval. Êstes fatos não são inesperados pois este estágio se caracteriza pelo desenvolvimento de \"puffs\" gigantes, os quais são específicos do tecido e do período de desenvolvimento. O 5º período parece representar uma fase de transição entre uma época de ativa síntese de RNA e outra onde a atividade transcritiva sofre uma redução drástica, provavelmente devido à histólise do tecido que vai ocorrer logo em seguida. d. Os dados apresentados nesta tese são considerados sob todos os aspectos significativos. Com isto faz-se uma tentativa de discussão crítica, no sentido de avaliar a importância do sistema glândulas salivares de R. angelae, como modelo de estudo para a genética molecular dos organismos superiores. / Not available

One of the important tasks of virology and immunology is to explore the species- and cell-barriers preventing virus horizontal transmission and reveal the ways how viruses overcome these barriers and "adapt" to different species. This work is based on a well- established retroviral model - avian Rous sarcoma virus (RSV) and studies virus replication blocks in mammalian cells at both pre- and post-integration level. Interaction of the viral envelope glycoprotein (Env) with a specific cellular receptor mediates virus entry into cells. Although mammalian orthologues of specific chicken receptors do not support RSV entry, it was observed that some RSV strains are able to enter mammalian cells. Several RSV-transformed rodent cells lines were described and analysis of provirus H20- RSV in one these cells lines (hamster H-20 tumor cell line) showed multiple mutations including two crucial amino acid substitutions in different regions of Env. Substitutions D32G and L378S confer virus transmission to hamster, human and also chicken cells lacking the appropriate receptor. Altered conformation of H20-RSV Env is similar to a receptor-primed (activated) state of Env. This observation indicates that virus can circumvent the need of original cell receptor because of spontaneous Env activation caused by single...