O objetivo deste estudo foi avaliar a taxa de detecção, quantidade e atividade metabólica de Propionibacterium acnes, antes e após os procedimentos endodônticos de desinfecção, utilizando métodos moleculares baseados em rRNA e rDNA. Foram selecionados 22 pacientes com necrose pulpar e periodontite apical assintomática. Amostras microbiológicas foram coletadas dos canais radiculares após a cirurgia de acesso (S1), após o preparo químico-cirúrgico realizado com Sistema Reciproc e NaClO- 2,5% (S2) e após medicação intracanal com Ca(OH)2 por 14 dias (S3). As amostras dos canais radiculares foram submetidas à extração de DNA e RNA. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa (RT) para confecção de DNA complementar (cDNA). DNA e cDNA foram submetidos a reações de qPCR utilizando iniciadores complementares à sequência de 16S rRNA de P. acnes. O efeito dos procedimentos endodônticos na redução bacteriana foi determinado por qPCR baseada em rDNA. A atividade metabólica bacteriana foi calculada pela razão rRNA/rDNA baseados nos dados dos ensaios de qPCR. Os dados foram analisados pelo teste de Wilcoxon para análise entre as amostras e teste de McNemar para comparação da taxa de detecção dos métodos baseados em rDNA e rRNA, com nível de significância de 5%. A taxa de detecção de P. acnes nas amostras endodônticas foi maior pelo método baseado em rRNA do que pelo método baseado em rDNA (P < 0,0001). P. acnes foi detectado em 36,4% (8/22) e 90,9% (20/22) das amostras S1 utilizando qPCR baseado em rDNA e rRNA, respectivamente. Nas amostras S2, P. acnes foi detectado em 36,4% (8/22) das amostras utilizando o método baseado em rDNA e em 86,4% (19/22) pelo método baseado em rRNA. Nas amostras S3, P. acnes persistiu em níveis detectáveis em todas as amostras positivas em S2. Na análise quantitativa, o nível médio de P. acnes foi 1,28 x 103 cópias de rDNA nas amostras S1. Não houve uma alteração significante dos níveis bacterianos nas amostras S2 e S3 quando comparadas às amostras S1 (P > 0,05). O número de cópias de rRNA foi maior do que o de rDNA em todas as amostras (P < 0,0001). Em S1, o valor mediano da razão rRNA/rDNA foi 7,93 (intervalo de 2,03 a 2,04 x 102). Essa razão permaneceu positiva em S2 (mediana 16,40, intervalo de 2,21 a 4,87 x 102) e S3 (mediana 25,34, intervalo de 0,58 a 1,05 x 103), sem diferença estatística na comparação entre as amostras S1-S2 e S2-S3 (ambos P > 0,05). Baseados nesses achados, concluiu-se que o ensaio de qPCR baseado em rRNA revelou uma alta prevalência de P. acnes nas infecções endodônticas primárias e que este permaneceu metabolicamente ativo nos canais radiculares após o preparo químico-cirúrgico e medicação intracanal. / This study aimed to evaluate the detection rate, quantity and metabolic activity of Propionibacterium acnes before and after endodontic disinfection procedures using RNA- and DNA-based molecular methods. Twenty-two patients with pulp necrosis and asymptomatic apical periodontitis were selected. The microbiological samples were collected from the root canals after access cavity (S1), after the chemo-mechanical preparation performed with the Reciproc System and NaClO- 2.5% (S2) and after intracanal medication with Ca(OH)2 for 14 days (S3). The root canal samples were submitted to DNA and RNA extraction. Complementary DNA (cDNA) was synthetized using the reverse transcription reaction. cDNA and genomic DNA were subjected to qPCR with primers complementary for P. acnes 16S rRNA sequence. The effect of endodontic procedures on bacterial reduction was determined by rDNA-based qPCR. The bacterial metabolic activity was calculate by the rRNA / rDNA ratio based on qPCR assays. Data were analysed by the Wilcoxon test for analysis between samples and McNemar test for detection rate of RNA- and DNA-based molecular methods, with a significance level of 5%. The detection rate of P. acnes in endodontic samples was higher by the rRNA-based method than by the rDNA-based method (P < 0.0001). P. acnes was detected in 36.4% (8/22) e 90.9% (20/22) of the S1 samples using on rDNA- and rRNA- based qPCR, respectively. In S2 samples, P. acnes was detected in 36.4% (8/22) of the samples using the rDNA based method and 86.4% (19/22) by the rRNA based method. In S3 samples, detectable levels of P. acnes persisted in all S2-positive samples. Quantitative analysis of S1 samples revealed that the mean level of P. acnes was 1.28 x 103 rDNA copies per sample. There was no significant change in bacterial levels in S2 and S3 samples when compared to S1 samples (P> 0.05). The number of rRNA copies was greater than the rDNA ones in all samples (P < 0.0001). In S1, the median value of the rRNA / rDNA ratio was 7.93 (range: 2.03 - 2,04 x 102). This ratio remained positive in S2 samples (median 16.40, range: 2.21 - 4.87 x 102) and in S3 (median 25.34, range: 0.58 - 1.05 x 103), with no statistical difference in the comparisons between S1-S2 and S2-S3 samples (both P> 0.05). Based on these findings, it was concluded that the rRNA-based qPCR assay revealed a high prevalence of P. acnes in primary endodontic infections and that it remained metabolically active in the root canals after chemical-surgical preparation and intracanal medication.

Micro-organismos persistentes que permanecem viáveis e em níveis elevados nos canais radiculares após os procedimentos endodônticos podem influenciar no sucesso do tratamento endodôntico. O objetivo deste estudo foi avaliar a quantidade e a atividade metabólica de bactérias persistentes utilizando métodos moleculares baseados em rDNA e rRNA. Foram selecionados 15 pacientes com infecções endodônticas primárias assintomáticas. Amostras microbiológicas foram coletadas dos canais radiculares após a cirurgia de acesso (S1), após o preparo químico-cirúrgico realizado com Sistema Reciproc e NaOCl 2.5% (S2) e após medicação intracanal com Ca(OH)2 por 14 dias (S3). As amostras dos canais radiculares foram submetidas à extração de DNA e RNA. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa para confecção de DNA complementar (cDNA). O efeito dos procedimentos endodônticos na redução bacteriana foi determinado por qPCR baseada em rDNA, utilizando iniciadores universais para a região 16S rRNA do domínio Bacteria e iniciadores espécie-específicos para Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272. A atividade metabólica de bactérias totais e Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 foi calculada pela razão rRNA/rDNA baseados nos dados dos ensaios de qPCR. Os dados foram analisados pelo teste de Wilcoxon para análise quantitativa e teste de McNemar para comparação da taxa de detecção dos métodos, com nível de significância de 5%. Todas as amostras S1 foram positivas para bactérias totais, com uma mediana de 1,87 x 105 cópias de rDNA por amostra. Após o preparo químico-cirúrgico houve uma redução significativa de rDNA de bactérias totais (mediana 7,86 x 104, P = 0,01). Entretanto, não houve redução de rDNA bacteriano após a medicação intracanal quando comparada à etapa anterior (mediana 7,97 x 104, P > 0,05). Os resultados da razão rRNA/rDNA revelaram que houve uma redução do metabolismo de bactérias totais em S2 (mediana 1, P = 0,04) e um aumento do metabolismo bacteriano em S3 (mediana 2, P = 0,04). Na análise de Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272, o tratamento endodôntico não influenciou na redução nem no metabolismo bacteriano. Concluiu-se que o número total de bactérias foi drasticamente reduzido após o preparo químico-cirúrgico, assim como seu metabolismo. Entretanto, o metabolismo bacteriano aumentou após o uso da medicação intracanal com Ca(OH)2. Bacteroidaceae [G-1] sp. oral taxon 272 permaneceu metabolicamente ativo após o preparo químico-cirúrgico e medicação intracanal, participando, assim, da composição da microbiota persistente. / High levels of microorganisms that persist viable in root canals after endodontic procedures may influence endodontic treatment outcome. This study aimed to evaluate the amount and the metabolic activity of persistent bacteria using rRNA- and rDNA-based molecular methods. Fifteen patients with primary endodontic infections were selected. Microbiological samples were taken from root canals after access cavity (S1), after chemomechanical preparation with Reciproc System and 2.5% NaOCl (S2) and after intracanal medication with calcium hydroxide for 14 days (S3). DNA and RNA were extracted from root canal samples, and cDNA was synthetized using reverse transcription reaction. The effect of endodontic procedures on bacterial reduction was determined by rDNA-based qPCR using universal primers for 16S rRNA Bacteria domain and species-specific primers to Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272. The metabolic activity of total bacteria and Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 was calculated by rRNA/ rDNA ratio estimated by qPCR. The data was analyzed by the Wilcoxon test for quantitative analysis and McNemar test for comparison of the detection rate of the methods, with 5% significance level. All S1 samples were positive for total bacteria, with a median value of 1.87 x 105 bacterial cells. After chemomechanical preparation a significant reduction of bacterial rDNA was observed (median 7.86 x 104, P = 0.01). Nevertheless, there was no bacterial rDNA reduction after intracanal medication when compared to S2 samples (median 7.97 x 104, P > 0.05). The rRNA/ rDNA ratio showed a reduction of total bacteria metabolism in S2 (median 1, P = 0,04), and an increase of bacterial metabolism in S3 (median 2, P = 0,04). Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 analysis showed that endodontic treatment did not impact the amount and the metabolic activity of this taxon. In conclusion, the number and metabolism of total bacteria were severely reduced after chemomechanical preparation. On the other hand, the bacterial metabolism increased after intracanal dressing with Ca(OH)2. Bacteroidaceae [G-1] sp. oral taxon 272 remained metabolically active after chemomechanical preparation and intracanal dressing thus participating in the composition of the persistent microbiota.

Micro-organismos persistentes que permanecem viáveis e em níveis elevados nos canais radiculares após os procedimentos endodônticos podem influenciar no sucesso do tratamento endodôntico. O objetivo deste estudo foi avaliar a quantidade e a atividade metabólica de bactérias persistentes utilizando métodos moleculares baseados em rDNA e rRNA. Foram selecionados 15 pacientes com infecções endodônticas primárias assintomáticas. Amostras microbiológicas foram coletadas dos canais radiculares após a cirurgia de acesso (S1), após o preparo químico-cirúrgico realizado com Sistema Reciproc e NaOCl 2.5% (S2) e após medicação intracanal com Ca(OH)2 por 14 dias (S3). As amostras dos canais radiculares foram submetidas à extração de DNA e RNA. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa para confecção de DNA complementar (cDNA). O efeito dos procedimentos endodônticos na redução bacteriana foi determinado por qPCR baseada em rDNA, utilizando iniciadores universais para a região 16S rRNA do domínio Bacteria e iniciadores espécie-específicos para Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272. A atividade metabólica de bactérias totais e Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 foi calculada pela razão rRNA/rDNA baseados nos dados dos ensaios de qPCR. Os dados foram analisados pelo teste de Wilcoxon para análise quantitativa e teste de McNemar para comparação da taxa de detecção dos métodos, com nível de significância de 5%. Todas as amostras S1 foram positivas para bactérias totais, com uma mediana de 1,87 x 105 cópias de rDNA por amostra. Após o preparo químico-cirúrgico houve uma redução significativa de rDNA de bactérias totais (mediana 7,86 x 104, P = 0,01). Entretanto, não houve redução de rDNA bacteriano após a medicação intracanal quando comparada à etapa anterior (mediana 7,97 x 104, P > 0,05). Os resultados da razão rRNA/rDNA revelaram que houve uma redução do metabolismo de bactérias totais em S2 (mediana 1, P = 0,04) e um aumento do metabolismo bacteriano em S3 (mediana 2, P = 0,04). Na análise de Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272, o tratamento endodôntico não influenciou na redução nem no metabolismo bacteriano. Concluiu-se que o número total de bactérias foi drasticamente reduzido após o preparo químico-cirúrgico, assim como seu metabolismo. Entretanto, o metabolismo bacteriano aumentou após o uso da medicação intracanal com Ca(OH)2. Bacteroidaceae [G-1] sp. oral taxon 272 permaneceu metabolicamente ativo após o preparo químico-cirúrgico e medicação intracanal, participando, assim, da composição da microbiota persistente. / High levels of microorganisms that persist viable in root canals after endodontic procedures may influence endodontic treatment outcome. This study aimed to evaluate the amount and the metabolic activity of persistent bacteria using rRNA- and rDNA-based molecular methods. Fifteen patients with primary endodontic infections were selected. Microbiological samples were taken from root canals after access cavity (S1), after chemomechanical preparation with Reciproc System and 2.5% NaOCl (S2) and after intracanal medication with calcium hydroxide for 14 days (S3). DNA and RNA were extracted from root canal samples, and cDNA was synthetized using reverse transcription reaction. The effect of endodontic procedures on bacterial reduction was determined by rDNA-based qPCR using universal primers for 16S rRNA Bacteria domain and species-specific primers to Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272. The metabolic activity of total bacteria and Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 was calculated by rRNA/ rDNA ratio estimated by qPCR. The data was analyzed by the Wilcoxon test for quantitative analysis and McNemar test for comparison of the detection rate of the methods, with 5% significance level. All S1 samples were positive for total bacteria, with a median value of 1.87 x 105 bacterial cells. After chemomechanical preparation a significant reduction of bacterial rDNA was observed (median 7.86 x 104, P = 0.01). Nevertheless, there was no bacterial rDNA reduction after intracanal medication when compared to S2 samples (median 7.97 x 104, P > 0.05). The rRNA/ rDNA ratio showed a reduction of total bacteria metabolism in S2 (median 1, P = 0,04), and an increase of bacterial metabolism in S3 (median 2, P = 0,04). Bacteroidaceae [G-1] sp oral taxon 272 analysis showed that endodontic treatment did not impact the amount and the metabolic activity of this taxon. In conclusion, the number and metabolism of total bacteria were severely reduced after chemomechanical preparation. On the other hand, the bacterial metabolism increased after intracanal dressing with Ca(OH)2. Bacteroidaceae [G-1] sp. oral taxon 272 remained metabolically active after chemomechanical preparation and intracanal dressing thus participating in the composition of the persistent microbiota.

Procedimentos clínicos complementares realizados após o preparo químico-cirúrgico de canais radiculares visam potencializar a limpeza e desinfecção após a fase de preparo. O objetivo deste trabalho foi avaliar, por métodos moleculares baseados em rDNA e rRNA, a eficácia antimicrobiana de procedimentos complementares de primeira e de segunda sessão, realizados após o PQC em dentes com periodontite apical. Baseado em estudo piloto prévio, amostras microbiológicas dos canais radiculares de 20 dentes unirradiculares com periodontite apical foram coletadas na primeira sessão clínica: após a cirurgia de acesso (S1), após o PQC realizado com Sistema Reciproc e NaOCl 2,5% (S2), após a utilização do instrumento XP-endo Finisher (S3a), e após a ativação ultrassônica (S3b). Na segunda sessão clínica as amostras foram coletadas após medicação intracanal entre sessões por 14 dias (S4), e após o repreparo dos canais na segunda sessão de tratamento (S5). As amostras foram submetidas à extração de DNA e RNA. O RNA foi submetido à reação de transcrição reversa (RT-PCR) para confecção da fita dupla de DNA complementar (cDNA). DNA e cDNA foram submetidos a reações de qPCR, com iniciadores universais para a região 16S rRNA do domínio Bacteria. A atividade metabólica das bactérias foi verificada através da relação entre os níveis de rRNA e rDNA das amostras baseados nos dados dos ensaios de qPCR. Os dados foram analisados pelo teste de Wilcoxon para amostras pareadas (p < 0,05). Todas amostras S1 foram positivas para bactérias (mediana: 1,79 x 105 cópias de rDNA). Doze canais (60%) permaneceram infectados em S2, com uma redução significativa de rDNA (mediana: 7,58 x 103; P = 0,0001). Em S3a e S3b, o número de canais infectados reduziu para 11 (55%) e 10 (50%), respectivamente, e aumentou para 14 (70%) em S4; porém não houve diferenças significativas entre os níveis de rDNA bacteriano quando essas amostras foram comparadas às amostras S2 ou comparadas entre si (P > 0,05). A prevalência de canais infectados voltou a cair em S5 para 6 (30%) e o número cópias de rDNA bacteriano detectado reduziu de maneira significativa quando comparado às amostras S4 (p = 0,0061). Nas amostras positivas para os 2 métodos, os níveis de rRNA foram significativamente maiores do que os níveis de rDNA nas amostras S1 (p = 0,0007) e S4 (p = 0,0499), indicando um alto metabolismo bacteriano. A relação dos níveis de rRNA e de rDNA revelou uma redução do metabolismo de bactérias totais em S2, S3a e S3b e um aumento significativo do metabolismo bacteriano em S4 (p = 0,0173) quando comparado a S3b. Concluiu-se que: o PQC promoveu redução dos níveis e da atividade metabólica de bactérias nos canais radiculares; o uso do instrumento XP-endo Finisher e ativação ultrassônica não contribuiu para uma desinfecção adicional na primeira sessão; após o uso de Ca(OH)2 como medicação intracanal, houve um aumento no metabolismo de bactérias persistentes; o repreparo dos canais radiculares após medicação intracanal, na segunda sessão, promoveu maior desinfecção do que os procedimentos realizados na primeira sessão do tratamento de dentes com periodontite apical. / Supplementary procedures performed after the chemical-surgical preparation of root canals aim to enhance cleaning and disinfection in endodontic treatment. The objective of this clinical study was to evaluate using molecular microbiological techniques based on rDNA and rRNA, the antimicrobial efficacy of supplementary disinfection procedures performed in multiple sessions after the chemical-surgical preparation in teeth with apical periodontitis. Based on a previous pilot study, microbiological samples of the root canals of 20 unirradicular teeth with apical periodontitis were taken after the access surgery (S1), after the chemical-surgical preparation using Reciproc and 2,5% NaOCl (S2) after the XP-endo Finisher (S3a), after ultrasonic activation (S3b), after intracanal medication for 14 days (S4), and after re-preparation of the root canals in the second treatment appointment (S5). The samples were submitted to DNA and RNA extraction. The RNA was subjected to the reverse transcription reaction (RT-PCR) to make the complementary DNA double strand (cDNA). The effect of endodontic procedures on bacterial reduction was determined by rDNA-based qPCR using universal primers for the 16S rRNA region of the Bacteria domain. The metabolic activity of the bacteria was assessed by the rRNA/rDNA ratio based on qPCR assay data. Data were analyzed by the Wilcoxon signed-rank test (P < 0.05). All S1 samples were positive for bacteria (median 1.79 x 105 rDNA copies). Twelve root canals (60%) remained infected in S2, with a significant reduction of rDNA (median: 7.58 x 103; P = 0.0001). In S3a and S3b, the number of infected teeth decreased to 11 (55%) and 10 (50%), respectively, and increased to 14 (70%) in S4; however there were no significant differences between bacterial rDNA levels when these samples were compared to the S2 samples or compared to each other (P> 0.05). The prevalence of infected canals dropped back to 6 (30%) in S5 and the number of bacterial rDNA detected significantly reduced when compared to S4 samples (p = 0.0061). In samples with positive reactions for both methods, rRNA levels were significantly higher than the rDNA levels in S1 (p = 0.0007) and S4 (p = 0.0499), indicating a high metabolic activity of bacteria. The results of the rRNA/rDNA ratio revealed a reduction in the metabolism of total bacteria in S2, S3a and S3b and a significant increase in metabolic activity of bacteria in S4 (p = 0.0173) when compared to S3b. It was concluded that: PQC promoted reduction of the levels and metabolic activity of bacteria in the root canals; the use of XP-endo Finisher plus ultrasonic activation did not contribute to an additional disinfection in the first session; after the use of Ca(OH)2 as intracanal medication, there was an increase in the metabolismo of persistente bacteria; the repreparation of the root canals in the second session after the use of intracanal medication, promoted greater disinfection than the procedures performed in the first session of the treatment of teeth with apical periodontitis.