Orientadora: Maria da Glória Buzinaro / Banca: Samir Issa Samara / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Resumo: O presente estudo teve como objetivo determinar a ocorrência de rotavírus do grupo A e a genotipagem G e P de estirpes detectadas em bezerros de rebanhos leiteiros e gado de corte, durante o período de julho de 2006 a setembro de 2008, em propriedades rurais do Estado de São Paulo, Brasil. Foram amostrados 395 bezerros, na faixa etária entre 1 e 60 dias, independentemente da manifestação clínica de diarréia, de 18 rebanhos bovinos, sendo nove de exploração leiteira e nove de gado de corte. Por meio da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA), determinou-se a ocorrência de rotavírus em 33,3% (06/18) entre os rebanhos e de 8,6% (34/395) na população amostrada. A maior freqüência de infecção foi detectada em animais com idade entre 16 e 30 dias (p < 0,01). Foram diagnosticados bezerros infectados por rotavírus tanto em animais com sinais clínicos de diarréia (22%;29/133) quanto naqueles clinicamente normais (1,9%;05/262), existindo, porém, uma correlação entre a presença da infecção e a manifestação clínica da diarréia (p<0,01). Em relação ao tipo de exploração, nos rebanhos leiteiros 0 percentual de ocorrência foi de 5,3% (14/264), enquanto que nos rebanhos de gado de corte o rotavírus teve maior ocorrência (15,3%; 20/131). A análise do perfil do genoma de rotavírus por EGPA identificou dois eletroferótipos distintos, cujas diferenças estavam localizadas na posição de migração dos segmentos 2, 3, 7, 8 e 9. A genotipagem pela reação em cadeia pela polimerase (RT-SNMPCR) das amostras de rotavírus revelou a que as estirpes circulantes nos rebanhos eram G6P[5], G10P[5], não foi possível fazer associação com o genotipo P[1]. / Abstract: The present study aimed to determine the Group A rotavirus and G/P genotyping in detected virus strains in dairy and beef cattle calves from July 2006 to September 2008 in São Paulo State-Brazil farms. 395 calves in 18 flocks (9 dairy cattle and 9 beef cattle) from 1 to 60-day-old were sampled, independently whether manifesting clinically diarrhea or not. By using Poliacrylamide Gel Electrophoresis Technique (PAGE), the rotavirus occurrence of 33.3% (06/18) among flocks and 8.6% (34/395) among the population sampled were determined. The higher infection frequency was detected in 16-to-30-day-old calves (P<0.01). Rotavirus-infected flocks rotavirus-infected were diagnosticated as much the ones having clinical symptoms of diarrhea (22%, 29/133) as the ones clinically normal (1.9%, 05/262), shawing a correlation between the presence of infection and the diarrhea manifestation (p<0.01). Related to the kind of exploration, the occurrence in dairy cattle was 5.3% (14/264) while in the beef cattle the occurrence was higher (15.3%, 20/131). The rotavirus genome profile analysis by PAGE identified two distinct electroferotypes, in which differences were located in the following segment migration positions: 2, 3, 7, 8 and 9. The genotyping of the Rotavirus sample by polymerase chain reaction (RT-snmPCR) revealed that the circulating strains among the flocks were G6P[5], G10P[5] e G?P[1]. / Mestre

Resumo: O tumor venéreo transmissível canino (TVTC) é uma neoplasia transmitida entre cães saudáveis pelo contato direto de pele e/ou mucosas lesionadas. Face aos escassos estudos relacionados aos eventos celulares envolvidos nas fases de crescimento do TVTC, o presente estudo teve por objetivo identificar a presença do gene TP53 e o RNAm referente a proteína codificada, além de detectar a expressão das proteínas p53, Bcl-2 e p63 em cortes histológicos de 13 amostras de TVTC. Com relação à evolução da neoplasia, 46% das amostras foram consideradas em fase de progressão e 54% no estágio de regressão. Foram utilizadas as técnicas de hibridização in situ (ISH) e RT-PCR in situ, que demonstrou a presença do DNA homólogo ao TP53 e seu respectivo RNAm em 92,30% das amostras. A expressão das proteínas p53, p63 e Bcl-2 foram detectadas em 50%, 70% e 100% das amostras, respectivamente. A p63 foi expressa de forma evidente nas amostras em regressão, porém a p53 e a Bcl-2 não apresentaram relação com o estágio evolutivo do tumor e provavelmente não podem ser analisados como fatores de prognóstico do TVTC. Observou-se, nesse estudo que, através das técnicas de ISH e RT-PCR in situ foi possível detectar o DNA do TP53 e seus transcritos, porém esse fato não significou a transcrição da p53, devido aos baixos níveis de expressão nas análises quantitativa e qualitativa nas amostras de TVTC / Abstract: The canine transmissible venereal tumor (CTVT) is transmitted by direct contact of skin or mucosal presenting lesions. In fact, few reports have been found describing the cellular immune response related to the evolution of the tumor. The objective of this study was to identify the TP53 gen and its transcription in CTVT in different stages of evolution, collected from dogs (N=13) examined at veterinary school, UNESP, Aracatuba, SP, Brasil. In addition, it was also evaluated the expression of p53, p63 and Bcl-2 in histological sections by the use of immunohistochemystry assay. The p53, p63 and Bcl-2 were evident in 50, 70 and 100% of analyzed samples. Regarding to tumor evolution, 6 out of 13 were considered in a progressive stage (46%), was list 7 out of 13 were classified in a regressive stage (54%). The use of in situ hybridization and reverse transcriptase polymerase chain reaction in situ (RT-PCR), revealed that TP53 was present in all samples and P63 was more expressed than p53. Take all results together, the real role of those marker are extremely important to understand the biological behavior and to improve therapeutic procedures for CTVT / Orientador: Maria Cecília Rui Luvizotto / Coorientador: Tereza Cristina Cardoso / Banca: Alexandre Lima de Andrade / Banca: Paula Rahal / Mestre

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Liana Brentano / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Resumo: A técnica de imunocaptura associada com a reação de transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (IC-RT-PCR) executadas tanto pelos procedimentos convencional como em tempo real foram testadas para a detecção rápida do gene da glicoproteína de Matriz (M) do vírus de influenza aviária (AIV) em amostras de líquido cório-alantóide (LCA) e em suabes traqueais e cloacais. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e otimizar a técnica de IC-RT-PCR para o diagnóstico do vírus da Influenza aviária. Os resultados obtidos foram comparados com um sistema empregando "beads" magnéticas em microplacas (AMBION), que é o método padrão de extração de RNA usado no laboratório de referência para diagnóstico de influenza aviária, o National Veterinary Services Laboratory - Ames, EUA (USDA), acrescido ainda de outros métodos de extração tradicionalmente usados nos laboratórios de referência para AIV, como os procedimentos com o uso do solvente orgânico Trizol® (Invitrogen) e com um sistema robotizado e que utiliza "beads" magnéticas (MagNA Pure - ROCHE). A técnica de IC-RT-PCR em tempo real neste estudo detectou a estirpe H2N2 do AIV, sem que nenhum outro dos RNA-vírus heterólogos testados fossem detectados (vírus das doença de Gumboro, de Newcastle e da bronquite infecciosa aviária). Os limites de detecção do IC-RTPCR foram iguais aos obtidos na técnica de extração com o kit da AMBION e menores do que aqueles que foram observados para os métodos de extração com Trizol® (Invitrogen) e com o MagNA Pure. O IC-RT-PCR demonstrou ser um sistema de diagnóstico capaz de conciliar simplicidade operacional e um menor custo com sensibilidade e especificidade analíticas iguais às do procedimento padrão atualmente adotado, podendo ser inclusive por laboratórios dotados de uma infra-estrutura mais simples / Abstract: The polymerase chain reaction (PCR) and reverse transcription-PCR (RT-PCR), including real-time RT-PCR have been used for the rapid detection of Matrix glycoprotein gene (M gene) Avian influenza virus (AIV). Despite the availability of various RNA extraction methods for using in RT-PCR, isolation and detection of viral RNA are still difficult due to the unstable nature of viral RNA molecules and the presence of PCR inhibitory substances. In this study, a simple method using immune-capture (IC) to recover viral RNA from H2 AIV samples was developed and compared to one standard and two others reference methods used for viral RNA extraction, such as Ambion MagMAXTM kit and Trizol® (Invitrogen) and Magnapure kit (Roche), respectively, with subsequent analysis by real-time RT-PCR. The real-time IC-RT-PCR developed in was able to detect specifically H2N2 AIV strain, without detecting non-related avian RNA-virus pathogens, such as Newcastle disease virus, avian infectious bronchitis virus and Gumboro disease virus. Comparable detection limits were found for IC and the standard RNA extraction method using Ambion MagMAXTM kit, either for the detection of AIV in allantoic fluid suspension or in seeded tracheal and cloacal swab samples by conventional or real time RT-PCR techniques. These methods were less sensitive than Trizol® (Invitrogen) and Magnapure kit (Roche) procedures. Thus, IC was rapid and as sensitive and specific as current standard AIV RNA extraction method for real time or conventional RT-PCR, besides it conciliated simplicity and lower cost and can be applied simultaneously for direct detection of AIV in a large number of samples, including less-equipped laboratories / Mestre

Orientador: Ciro Moraes Barros / Resumo: Em células da teca e da granulosa, de folículos bovinos, foram detectados quatro transcritos alternativos do receptor do hormônio luteinizante (LHR). Apenas dois deles são traduzidos em proteínas funcionais com afinidades distintas em relação aos ligantes. Em humanos e símios, a isoforma completa ("full-length") tem afinidade pelo LH e hCG, enquanto que a isoforma que apresenta deleção do exon 10 tem afinidade somente pelo hCG. Além disso, isoformas com deleção do exon 3 foram observadas em ratos, embora nenhum outro estudo tenha investigado essa região do gene bovino. Objetivouse com este trabalho caracterizar o padrão da expressão do gene do LHR nas células da teca e da granulosa de folículos antrais bovinos. Ovários foram coletados em matadouro, os folículos (5-14 mm) foram dissecados e as células da teca e da granulosa separadas para extração de RNA total com Trizol. As concentrações de esteróides no fluido folicular foram determinadas por radioimunoensaio (RIE). A expressão gênica do LHR foi mensurada por RTPCR semiquantitativo com oligonucleotídeos iniciadores ("primers") específicos para amplificar o fragmento entre o final da região extracelular e o final da intracelular (LHRBC; "primers" posicionados nos exons 9 e 11). A ocorrência de transcritos alternativos oriundos do início da região extracelular (LHRA; "primers" posicionados nos exons 2 e 9) foi investigada mediante amplificação por RT-PCR. Como controle interno no PCR, utilizou-se a expressão da GAPDH. Paralelamente, células da granulosa cultivadas in vitro foram tratadas com 1 ou 10 ng de FSH no meio de cultura. Mediante RT-PCR, foi investigada a expressão das isoformas do LHRBC nas células da granulosa cultivadas e tratadas com FSH... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Growth of dominant follicle in the absence of circulating FSH and the events following the LH surge that culminate in ovulation, are dependent on the interaction between LH and its receptor (LHR). Four LHR alternative transcripts were described in theca and granulosa cells from bovine follicles. Only two of them can be translated to functional proteins (receptors coupled with G protein) with different affinities to their ligands. In humans and marmosets, the full-length isoform has affinity to both LH and hCG molecules, whereas the isoform with deletion of only exon 10 has affinity to hCG exclusively. Additionally, isoforms with deletion of exon 3 were observed in rats, although no previous report have investigated this region of the bovine gene. The objective of this study was to characterize the pattern of gene expression of the LHR in theca and granulosa cells from bovine antral follicles. Additionally, LHR expression was determined in cultured granulosa cells under FSH treatment. From ovaries collected in abattoir, antral follicles were dissected (5 to 14mm of diameter), and samples of theca and granulosa cells were obtained to total RNA extraction (Trizol protocol). Steroids concentrations in the follicular fluid were determined by RIA. Gene expression of LHR was measured by semiquantitative RT-PCR with specific primers to amplify part of extracellular region (LHRA; primers annealing on exons 2 and 9) and the fragment from the end of extracellular region, including the transmembrane domain and finishing near the end of intracellular region (LHRBC; primers annealing on exons 9 and 11). As internal control of the PCR, it was used GAPDH expression. Cultured granulosa cells were treated with 0, 1 or 10 ng of FSH (3 replicates each dose). As in vivo and positive control, theca cell sample was utilized to comparison... (Complete abstract, access undermentioned electronic address) / Doutor

Orientador: Renate Krause Satake / Banca: Marcelo Agenor Pavan / Banca: Romulo Fujito Kobori / Resumo: Recentemente sintomas da doença conhecida como engrossamento das nervuras, ou big-vein, foram observados no Estado de São Paulo, principalmente no período de inverno. A doença foi historicamente associada ao Lettuce big-vein associated virus (LBVaV), porém a presença dos sintomas característicos foi atribuída ao Mirafiori lettuce big-vein virus (MLBVV). Tradicionamente ambos vírus vem sendo diagnosticados pelo teste de ELISA, de modo que resultados discrepantes quanto ao agente causal dos sintomas da doença foram obtidos na Europa, possivelmente devido à falta de sensibilidade do teste. Deste modo, o presente trabalho teve como finalidade utilizar a técnica de RT-PCR na detecção segura e específica do MLBVV e LBVaV. Foram coletadas 366 plantas sintomáticas nas regiões produtoras de Bauru, Campinas e Mogi das Cruzes no Estado de São Paulo nos meses de junho e setembro de 2004 e abril e julho de 2005, e 18 plantas assintomáticas na região de Mogi das Cruzes no mês de dezembro de 2004. Os oligonucleotídeos específicos foram altamente eficientes na detecção de ambos os vírus, sendo que a banda viral foi clonada e sequenciada para alguns dos isolados, comprovando a identidade viral de cada um dos vírus. Foi observado que 76,2% das plantas sintomáticas apresentaram infecção mista do LBVaV e MLBVV, em 11,5% somente o MLBVV e em 6,6% somente o LBVaV. Nas plantas assintomáticas foi detectada a presença de infecção mista por MLBVV e LBVaV em quatro amostras, infecção apenas por MLBVV em cinco amostras e apenas por LBVaV em três amostras, indicando que o desenvolvimento de sintomas depende de fatores abióticos, além da presenca dos vírus. A análise das sequencias de aminoácidos da região codificadora da proteína capsidial, revelou que os isolados de LBVaV possuem baixa variabilidade genética e mesma origem evolutiva entre isolados de diferentes partes do mundo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Lettuce plants with big-vein symptons have been observed in the São Paulo State during the winter. The disease has been historically associated to Lettuce big-vein associated virus (LBVaV), however recently the development of symptoms was atributted to Mirafiori lettuce big-vein virus (MLBVV). Tradicionally both viruses were routinely detected by ELISA, but discrepants results about the main disease agent were obtained in the Europe possible by the low sensibility of the assay. The objective of this study was to detect MLBVV and LBVaV by RT-PCR, using specifics primers. A total of 366 samples from symptomatic plants of Bauru, Campinas and Mogi das Cruzes regions, from São Paulo State, were collected during june and september of 2004 and april and july of 2005, and 18 symptomless plants from the Mogi das Cruzes region during December 2004. The primers were highly efficient in the 4 detection of both viruses, and the fragment of some isolates were cloned and sequenced to confirm the RT-PCR. Mixed infection of LBVaV and MLBVV was observed on 76,2% symptomatic plants. MLBVV on 11,5% and LBVaV on 6,6%. In a total of 18 symptomless plants, four were infected with both viruses, five only with MLBVV and three plants with LBVaV. These results indicates that not only the presence of the viruses, but also abiotic factors are necessary for the occurrence of big-vein symptoms. Amino acid sequence identities of part of the coat protein gene of LBVaV isolates was high indicating a possible same evolutive origin. Genetic diversity among MLBVV isolates was higher when compared to LBVaV isolates. MLBVV brazilian isolates belongs to subgroup A, with one RsaI restriction site on the coat protein sequence. One plant with MLBVV and LBVaV (mixed infection) was sap inoculated on a host range (temperature and luminosity controled), indicating that MLBVV can be transmitted to Nicotiana tabacum TNN, N. rustica... (Complete abstract, click electronic address below). / Mestre