Certains neuropeptides (enképhaline et neurotensine) sont des modulateurs du système dopaminergique. Chez les rongeurs, le traitement avec l’antipsychotique typique halopéridol (antagoniste des récepteurs D2), augmente fortement leurs niveaux d’ARNm dans le striatum, une structure centrale du système dopaminergique qui contrôle l’activité locomotrice. Comme l’halopéridol est associé avec de nombreux effets secondaires moteurs, on peut penser que la modulation des neuropeptides est possiblement un mécanisme d’adaptation visant à rétablir l’homéostasie du système dopaminergique après le blocage des récepteurs D2. Cependant, le mécanisme moléculaire de cette régulation transcriptionnelle n’est pas bien compris. Nur77 est un facteur de transcription de la famille des récepteurs nucléaires orphelins qui agit en tant que gène d’induction précoce. Le niveau de son ARNm est aussi fortement augmenté dans le striatum suivant un traitement avec halopéridol. Plusieurs évidences nous suggèrent que Nur77 est impliqué dans la modulation transcriptionnelle des neuropeptides. Nur77 peut former des hétérodimères fonctionnels avec le récepteur rétinoïde X (RXR). En accord avec une activité transcriptionnelle d’un complexe Nur77/RXR, l’agoniste RXR (DHA) réduit tandis que l’antagoniste RXR (HX531) augmente les troubles moteurs induits par un traitement chronique à l’halopéridol chez les souris sauvages tandis que ces ligands pour RXR n’ont aucun effet chez les souris Nur77 nulles. Nos travaux ont révélé que l’antagoniste RXR (HX531) réduit l’augmentation des niveaux d’enképhaline suivant un traitement chronique avec l’halopéridol. Nous avons ensuite démontré la liaison in vitro de Nur77 sur un élément de réponse présent dans le promoteur proximal de la proenképhaline, le peptide précurseur de l’enképhaline. Ces résultats supportent l’hypothèse que Nur77, en combinaison avec RXR, pourrait participer à la régulation transcriptionnelle des neuropeptides dans le striatum et donc contribuer à la neuroadaptation du système dopaminergique suivant un traitement aux antipsychotiques typiques. / Neuropeptides (enkephalin and neurotensin) are modulators of dopaminergic system. In the rodent’s striatum, antipsychotic drugs strongly modulate their mRNA levels. For exemple, haloperidol (D2 receptor antagonist) increases their mRNA levels in the striatum, a central structure of dopaminergic system that control locomotor activity. Since haloperidol is associated with many motor side effects, it is likely that neuropeptides modulation is a compensatory mechanism to restore the dopaminergic system homeostasis after D2 receptor blockade. However, molecular mechanism of this transcriptional regulation is not well understood. Nur77 is a transcription factor of the orphan nuclear receptor family that acts as an immediate early gene. In the striatum, its mRNA level is strongly increased following haloperidol treatment. Several evidences suggest that Nur77 is involved in neuropeptides transcriptional modulation. Nur77 can form functional heterodimers with retinoid X receptor (RXR). In agreement with a transcriptional activity of Nur77/RXR complex, RXR agonist (DHA) decreases while the RXR antagonist (HX531) exacerbates acute and chronic motor side effects of haloperidol treatment in wild type mice but remain without effect in Nur77 knockout mice. Our work shows that RXR antagonist (HX531) significantly reduced the increased levels of enkephalin following chronic treatment with haloperidol. We have set up the EMSA (electro-mobility shift assay) to demonstrate the in vitro binding of Nur77 on a responsive element from proenkephalin’s proximal promotor. These results support the hypothesis that Nur77 could be involve in transcriptional modulation of neuropeptides in the striatum and thus, contribute to neuroadaptation of dopaminergic system after treatment with typical antipsychotic drugs.

Dans le système nerveux central, la dopamine joue un rôle crucial dans de nombreuses fonctions physiologiques telles que : l’apprentissage, le mouvement volontaire, la motivation, la cognition et la production hormonale. Il a été aussi démontré que le système de signalisation dopaminergique est altéré dans plusieurs maladies neurologiques et psychiatriques comme la maladie de Parkinson et la schizophrénie. Des études, effectuées dans le laboratoire du Dr.Daniel Lévesque (laboratoire d’accueil), ont montré que les récepteurs nucléaires Nur77 (NR4A1, NGFI-B) et RXRγ (retinoid X receptors γ) sont impliqués dans la régulation des effets de la dopamine dans le système nerveux central. De plus, ces données suggèrent que le complexe Nur77 et RXR joueraient un rôle crucial dans l’effet des médicaments antipsychotiques et antiparkinsoniens. Toutefois, très peu de médicaments ciblant Nur77 ont été identifiés à ce jour et les médicaments agissant sur RXRγ restent mal caractérisés. En outre, les analyses actuellement disponibles ne peuvent pas résumer la complexité des activités des NRs et génèrent des mesures indirectes des activités des drogues. Afin de mieux comprendre comment est régulée l’interaction Nur77/RXRγ dans ces processus, mon projet a été de mettre au point un essai BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) et PCA-BRET (Protein Complementation Assay-BRET) basé sur le recrutement d'un motif mimant un co-activateur fusionné avec la YFP. Nos différents essais ont été validés par courbes dose-réponse en utilisant différents composés RXR . Les EC50 (concentration efficace médiane, qui permet de mesurer l'efficacité d'un composé) obtenues étaient très semblables aux valeurs précédemment rapportées dans la littérature. Nous avons aussi pu identifier un composé le SR11237 (BMS649) qui semble posséder une sélectivité pour le complexe Nur77/RXRγ par rapport aux complexes Nurr1/RXRγ et RXRγ /RXRγ. Nos résultats indiquent que ces essais de BRET peuvent être utilisés pour évaluer la sélectivité de nouveaux composés pour les complexes Nur77/RXRγ, Nurr1/RXRγ et RXRγ /RXRγ. Un autre aspect de mon projet de doctorat a été de mettre en évidence par BRET l’importance de la SUMOylation dans la régulation de l'activité de Nur77 dans sa forme monomèrique, homodimèrique et hétérodimèrique. Nous avons ainsi identifié que Nur77 recrute principalement SUMO2 sur sa lysine 577. Il est intéressant de noté que le recrutement de la SUMO2 à Nur77 est potentialisé en présence de la SUMO E3 Ligase PIASγ. Aussi, la perte de la SUMOylation sur la lysine 577 entraîne l'incapacité de Nur77 de recruter divers motifs de co-activation mais pas pour ses formes homo- et hétérodimèrique. Cependant, la présence de PIASγ ne potentialise pas le recrutement du co-activateur, suggérant que cette SUMO E3 Ligase est seulement impliqué dans le processus de recrutement de la SUMO mais pas dans celui du co-activateur. Nous avons ainsi déterminé une nouvelle modification post-traductionnelle sur Nur77 régulant spécifiquement son activité monomérique Ces projets pourraient donc apporter de nouvelles données cruciales pour l’amélioration du traitement de la maladie de Parkinson ou de la schizophrénie, ainsi que d'obtenir une meilleure compréhension sur les mécanismes permettant la régulation de la fonction de Nur77 / In the central nervous system, dopamine plays a critical role in many physiological functions such as learning, voluntary movement, motivation, cognition and hormone production. It was also shown that the dopamine signaling system is altered in many neurological and psychiatric disorders like Parkinson's disease and schizophrenia. Studies conducted in the laboratory of Dr. Daniel Lévesque (host laboratory) have shown that nuclear receptors Nur77 (NR4A1, NGFI-B) and RXRγ (retinoid X receptor γ isoform) are involved in the regulation of dopamine effects. These data suggest that the Nur77/RXR complex plays a crucial role in the effect of antipsychotic and anti-parkinsonian drugs. However, very few drugs targeting Nur77 have been identified to date and drugs acting at RXRγ remain poorly characterized. Furthermore, currently available tests cannot recapitulate the complexity of nuclear receptor activities and generate indirect measures of drug activities. To better understand Nur77/RXRγ complex activity we developed a new and original Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-luciferase Protein Complementation Assay (PCA) based on the recruitment of a co-activator motif fused with YFP. The assays have been validated by dose-response curves using different RXR compounds. EC50 obtained were very similar to the values previously reported in the literature. We were also able to identify a compound, SR11237 (BMS649), which appears to have specificity for the complex Nur77/RXRγ compared to Nurr1/RXRγ and RXRγ/RXRγ. Our results indicate that these BRET assays can be used to evaluate the selectivity of compounds at Nur77/RXRγ, Nurr1/RXRγ or RXRγ/RXRγ complexes. Another aspect of my PhD project was to better understand how Nur77 activity is regulated by post-translational modifications. We were able to highlight the importance of Nur77 SUMOylation in the activity of monomeric, homodimer and heterodimer forms of Nur77 using various BRET assays. We identified that Nur77 preferentially recruits SUMO2 mainly on its lysine 577 residue. It is interesting to note that SUMO2 recruitment by Nur77 is potentiated in the presence of SUMO E3 ligase PIAS4 (PIASγ). Also, the loss of SUMOylation on lysine 577 strongly reduced co-activator motif recruitment by monomeric form of Nur77, but not for homo- and hetero-dimer complexes. However, PIAS4 by itself does not potentiate co-activator recruitment, suggesting that this SUMO E3 ligase is only involved in the recruitment process of SUMO, but not in the co-activator recruitment. Thus, we identified a new post-translational modification on Nur77 that specifically regulates its monomeric activity. These results provide critical new data that will help to identify new compounds targeting selective nuclear receptor complexes (Nur77/RXR) that may improve the treatment of Parkinson's disease and schizophrenia, as well as to get a better understanding of the mechanisms regulating the activity of Nur77.

Certains neuropeptides (enképhaline et neurotensine) sont des modulateurs du système dopaminergique. Chez les rongeurs, le traitement avec l’antipsychotique typique halopéridol (antagoniste des récepteurs D2), augmente fortement leurs niveaux d’ARNm dans le striatum, une structure centrale du système dopaminergique qui contrôle l’activité locomotrice. Comme l’halopéridol est associé avec de nombreux effets secondaires moteurs, on peut penser que la modulation des neuropeptides est possiblement un mécanisme d’adaptation visant à rétablir l’homéostasie du système dopaminergique après le blocage des récepteurs D2. Cependant, le mécanisme moléculaire de cette régulation transcriptionnelle n’est pas bien compris. Nur77 est un facteur de transcription de la famille des récepteurs nucléaires orphelins qui agit en tant que gène d’induction précoce. Le niveau de son ARNm est aussi fortement augmenté dans le striatum suivant un traitement avec halopéridol. Plusieurs évidences nous suggèrent que Nur77 est impliqué dans la modulation transcriptionnelle des neuropeptides. Nur77 peut former des hétérodimères fonctionnels avec le récepteur rétinoïde X (RXR). En accord avec une activité transcriptionnelle d’un complexe Nur77/RXR, l’agoniste RXR (DHA) réduit tandis que l’antagoniste RXR (HX531) augmente les troubles moteurs induits par un traitement chronique à l’halopéridol chez les souris sauvages tandis que ces ligands pour RXR n’ont aucun effet chez les souris Nur77 nulles. Nos travaux ont révélé que l’antagoniste RXR (HX531) réduit l’augmentation des niveaux d’enképhaline suivant un traitement chronique avec l’halopéridol. Nous avons ensuite démontré la liaison in vitro de Nur77 sur un élément de réponse présent dans le promoteur proximal de la proenképhaline, le peptide précurseur de l’enképhaline. Ces résultats supportent l’hypothèse que Nur77, en combinaison avec RXR, pourrait participer à la régulation transcriptionnelle des neuropeptides dans le striatum et donc contribuer à la neuroadaptation du système dopaminergique suivant un traitement aux antipsychotiques typiques. / Neuropeptides (enkephalin and neurotensin) are modulators of dopaminergic system. In the rodent’s striatum, antipsychotic drugs strongly modulate their mRNA levels. For exemple, haloperidol (D2 receptor antagonist) increases their mRNA levels in the striatum, a central structure of dopaminergic system that control locomotor activity. Since haloperidol is associated with many motor side effects, it is likely that neuropeptides modulation is a compensatory mechanism to restore the dopaminergic system homeostasis after D2 receptor blockade. However, molecular mechanism of this transcriptional regulation is not well understood. Nur77 is a transcription factor of the orphan nuclear receptor family that acts as an immediate early gene. In the striatum, its mRNA level is strongly increased following haloperidol treatment. Several evidences suggest that Nur77 is involved in neuropeptides transcriptional modulation. Nur77 can form functional heterodimers with retinoid X receptor (RXR). In agreement with a transcriptional activity of Nur77/RXR complex, RXR agonist (DHA) decreases while the RXR antagonist (HX531) exacerbates acute and chronic motor side effects of haloperidol treatment in wild type mice but remain without effect in Nur77 knockout mice. Our work shows that RXR antagonist (HX531) significantly reduced the increased levels of enkephalin following chronic treatment with haloperidol. We have set up the EMSA (electro-mobility shift assay) to demonstrate the in vitro binding of Nur77 on a responsive element from proenkephalin’s proximal promotor. These results support the hypothesis that Nur77 could be involve in transcriptional modulation of neuropeptides in the striatum and thus, contribute to neuroadaptation of dopaminergic system after treatment with typical antipsychotic drugs.