O parasita protozoário Leishmania apresenta um genoma plástico e dinâmico onde a amplificação gênica e translocações cromossomais são fenômenos comuns. Tal plasticidade sugere a necessidade de mecanismos robustos de reparo do DNA e de manutenção do genoma. A célula eucariótica desenvolveu sistemas de controle checkpoint que reconhecem estruturas alteradas de DNA e bloqueiam a progressão do ciclo celular permitindo que o reparo do DNA aconteça. Nestas células, o complexo heterotrimérico formado pelas proteínas Hus1, Rad9, e Rad1 participa nas etapas iniciais de reconhecimento e sinalização do estresse replicativo. Neste trabalho mostramos que a proteína Hus1 homóloga de Leishmania major é uma proteína nuclear que melhora a capacidade do parasito em lidar com o estresse replicativo. A análise de northern e PCR em tempo real mostraram que, após a transfecção do gene, a linhagem selecionada apresenta níveis aumentados dos transcritos LmHUS1. A utilização de um anticorpo anti-LmHus1 demonstrou o aumento nos níveis da proteína nestas células. Ainda, a superexpressão de LmHus1 confere resistência às drogas genotóxicas hidroxiuréia (HU) e metil metanosulfonato (MMS), e a resistência à HU correlaciona-se com a redução de dano no DNA após a expressão da LmHus1. A ruptura de um dos alelos LmHUS1 diminui os níveis do seu produto, compromete o crescimento do parasito e proporciona discreta diminuição na resistência às drogas genotóxicas. Resultados preliminares associam a expressão da LmHus1 ao fenômeno de amplificação gênica em L. major. Além disso, a possível quinase Chk1, efetora da sinalização iniciada em Hus1, foi clonada e transfectada no parasito, o anticorpo anti-Chk1 também foi produzido. Finalmente, considerando que LmHus1 funcione na detecção do dano e controle de defeitos na replicação de DNA, formulamos a hipótese de que o produto deste gene atue na forquilha de replicação e participe no fenômeno de rearranjo do DNA e na formação de amplicons neste parasito. / The protozoan parasite Leishmania presents a dynamic and plastic genome in which gene amplification and chromosome translocations are common phenomena. Such plasticity hints at the necessity of dependable genome maintenance pathways. Eukaryotic cells have evolved checkpoint control systems that recognize altered DNA structures and halt cell cycle progression allowing DNA repair to take place. In these cells, the PCNA-related heterotrimeric complex formed by the proteins Hus1, Rad9, and Rad1 is known to participate in the early steps of replicative stress sensing and signaling. Here we show that the Hus1 homolog of Leishmania major is a nuclear protein that improves the cell capability to cope with replicative stress. Northern analysis and real-time PCR showed that after transfection of the gene, the selected lineage presents increase in the LmHUS1 transcripts levels and overexpression was confirmed using anti-LmHus1. Thus, overexpression of LmHus1 confers resistance to the genotoxic drugs hydroxyurea (HU) and methyl methanesulfonate (MMS) and resistance to HU correlates to reduced net DNA damage upon LmHus1 expression. Preliminary results associate the LmHus1 expression to the gene amplification phenomena in L. major. And a possible Chk1-like kinase was cloned and transfected into the parasite, the anti-Chk1 was also produced. Besides, LmHus1 mutant is presented, and the LmHUS1 gene disruption decreases its product levels, leads to serious effects on growth, and presenting an slight decrease in the resistance to genotoxic drugs. Finally, considering the hypothesis that LmHus1 participates in the damage sensing and in the control of the DNA replication threats, we hypothesized that the product of this gene acts in replication forks and is involved in DNA rearrangement s and in the amplicons generation in this parasite.

O parasita protozoário Leishmania apresenta um genoma plástico e dinâmico onde a amplificação gênica e translocações cromossomais são fenômenos comuns. Tal plasticidade sugere a necessidade de mecanismos robustos de reparo do DNA e de manutenção do genoma. A célula eucariótica desenvolveu sistemas de controle checkpoint que reconhecem estruturas alteradas de DNA e bloqueiam a progressão do ciclo celular permitindo que o reparo do DNA aconteça. Nestas células, o complexo heterotrimérico formado pelas proteínas Hus1, Rad9, e Rad1 participa nas etapas iniciais de reconhecimento e sinalização do estresse replicativo. Neste trabalho mostramos que a proteína Hus1 homóloga de Leishmania major é uma proteína nuclear que melhora a capacidade do parasito em lidar com o estresse replicativo. A análise de northern e PCR em tempo real mostraram que, após a transfecção do gene, a linhagem selecionada apresenta níveis aumentados dos transcritos LmHUS1. A utilização de um anticorpo anti-LmHus1 demonstrou o aumento nos níveis da proteína nestas células. Ainda, a superexpressão de LmHus1 confere resistência às drogas genotóxicas hidroxiuréia (HU) e metil metanosulfonato (MMS), e a resistência à HU correlaciona-se com a redução de dano no DNA após a expressão da LmHus1. A ruptura de um dos alelos LmHUS1 diminui os níveis do seu produto, compromete o crescimento do parasito e proporciona discreta diminuição na resistência às drogas genotóxicas. Resultados preliminares associam a expressão da LmHus1 ao fenômeno de amplificação gênica em L. major. Além disso, a possível quinase Chk1, efetora da sinalização iniciada em Hus1, foi clonada e transfectada no parasito, o anticorpo anti-Chk1 também foi produzido. Finalmente, considerando que LmHus1 funcione na detecção do dano e controle de defeitos na replicação de DNA, formulamos a hipótese de que o produto deste gene atue na forquilha de replicação e participe no fenômeno de rearranjo do DNA e na formação de amplicons neste parasito. / The protozoan parasite Leishmania presents a dynamic and plastic genome in which gene amplification and chromosome translocations are common phenomena. Such plasticity hints at the necessity of dependable genome maintenance pathways. Eukaryotic cells have evolved checkpoint control systems that recognize altered DNA structures and halt cell cycle progression allowing DNA repair to take place. In these cells, the PCNA-related heterotrimeric complex formed by the proteins Hus1, Rad9, and Rad1 is known to participate in the early steps of replicative stress sensing and signaling. Here we show that the Hus1 homolog of Leishmania major is a nuclear protein that improves the cell capability to cope with replicative stress. Northern analysis and real-time PCR showed that after transfection of the gene, the selected lineage presents increase in the LmHUS1 transcripts levels and overexpression was confirmed using anti-LmHus1. Thus, overexpression of LmHus1 confers resistance to the genotoxic drugs hydroxyurea (HU) and methyl methanesulfonate (MMS) and resistance to HU correlates to reduced net DNA damage upon LmHus1 expression. Preliminary results associate the LmHus1 expression to the gene amplification phenomena in L. major. And a possible Chk1-like kinase was cloned and transfected into the parasite, the anti-Chk1 was also produced. Besides, LmHus1 mutant is presented, and the LmHUS1 gene disruption decreases its product levels, leads to serious effects on growth, and presenting an slight decrease in the resistance to genotoxic drugs. Finally, considering the hypothesis that LmHus1 participates in the damage sensing and in the control of the DNA replication threats, we hypothesized that the product of this gene acts in replication forks and is involved in DNA rearrangement s and in the amplicons generation in this parasite.

Replication protein A (RPA) is a eukaryotic single-stranded DNA-binding protein consisting of three subunits of 70-, 32-, and 14-kDa (RPA70, RPA32, RPA14, respectively). It is a protein essential for most cellular DNA metabolic pathways. Checkpoint proteins Rad9, Rad1, and Hus1 form a clamp-like complex which plays a central role in the DNA damage-induced checkpoint response. In this report, we presented the evidence that Rad9-Rad1-Hus1 (9-1-1) complex directly interacted with RPA in human cells, and this interaction was mediated by the binding of Rad9 protein to both RPA70 and RPA32 subunits. In addition, the cellular interaction of 9-1-1 with RPA or hyperphosphorylated RPA was stimulated by UV irradiation or camptothecin treatment in a dose-dependent manner. Such treatments also resulted in the colocalization of the nuclear foci formed with the two complexes. Consistently, knockdown of the RPA expression in cells by the small interference RNA (siRNA) blocked the DNA damage-dependent chromatin association of 9-1-1, and also inhibited the 9-1-1 complex formation. Taken together, our results suggest that 9-1-1 and RPA complexes collaboratively function in DNA damage responses, and that the RPA may serve as a regulator for the activity of 9-1-1 complex in the cellular checkpoint network.