Replication protein A (RPA) is a eukaryotic single-stranded DNA-binding protein consisting of three subunits of 70-, 32-, and 14-kDa (RPA70, RPA32, RPA14, respectively). It is a protein essential for most cellular DNA metabolic pathways. Checkpoint proteins Rad9, Rad1, and Hus1 form a clamp-like complex which plays a central role in the DNA damage-induced checkpoint response. In this report, we presented the evidence that Rad9-Rad1-Hus1 (9-1-1) complex directly interacted with RPA in human cells, and this interaction was mediated by the binding of Rad9 protein to both RPA70 and RPA32 subunits. In addition, the cellular interaction of 9-1-1 with RPA or hyperphosphorylated RPA was stimulated by UV irradiation or camptothecin treatment in a dose-dependent manner. Such treatments also resulted in the colocalization of the nuclear foci formed with the two complexes. Consistently, knockdown of the RPA expression in cells by the small interference RNA (siRNA) blocked the DNA damage-dependent chromatin association of 9-1-1, and also inhibited the 9-1-1 complex formation. Taken together, our results suggest that 9-1-1 and RPA complexes collaboratively function in DNA damage responses, and that the RPA may serve as a regulator for the activity of 9-1-1 complex in the cellular checkpoint network.

La protéine auxiliaire Vpr du VIH-1 est exprimée tardivement au cours de la réplication virale. Toutefois, du fait de son encapsidation dans les particules virales, elle joue un rôle important dès les étapes initiales du cycle de réplication viral. Cette protéine de 96 acides aminés intervient en effet au cours de la rétrotranscription du génome viral puis de la translocation de l’ADN viral vers le noyau de la cellule hôte. Parallèlement, elle provoque un arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose des lymphocytes T infectés. Alors qu’il a été établi que Vpr participait au contrôle de la fidélité de la rétrotranscription via le recrutement au sein des particules virales de l’uracile DNA glycosylase 2 (UNG2), enzyme impliquée dans les processus de réparation de l’ADN, certaines études ont ensuite remis en question l’impact positif de l’encapsidation de l’UNG2 sur la réplication virale. Les travaux présentés ici permettent de confirmer le rôle de l’UNG2 dans le contrôle du taux de mutations au sein de l’ADN synthétisé à partir de l'ARN viral par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique, mais lié à des déterminants situés dans la partie N-terminale de la protéine engagée dans le recrutement de la sous-unité p32 du complexe RPA (Replication protein A) (RPA32). Nous avons montré, dans un premier temps, que la production de virus dans des cellules dont les niveaux d'expression de l'UNG2 et de RPA32 étaient diminués se traduisait par une réduction significative du pouvoir infectieux des particules virales et de la synthèse de l’ADN viral. Nous avons ensuite montré que la protéine Vpr est capable de former un complexe tri-moléculaire avec les protéines UNG2 et RPA32, et confirmé l’importance de ces deux protéines cellulaires pour permettre une réplication virale optimale aussi bien dans des lignées cellulaires T que dans les cellules primaires cibles du VIH-1. Même si les macrophages et les PBMCs (cellules mononucléaires du sang périphérique), cellules cibles du VIH-1, expriment des niveaux faibles d’UNG2 et de RPA32, ces protéines cellulaires semblent requises pour permettre une synthèse d'ADN virale suffisante à la réplication optimale du virus dans ces cellules primaires. L’ensemble de ces résultats suggère que le contrôle de la rétrotranscription par Vpr a lieu via le recrutement de deux protéines cellulaires UNG2 et RPA32 permettant la dissémination efficace du VIH-1 dans les cellules cibles primaires. / The HIV-1 auxiliary protein Vpr is expressed during the late steps of the viral replication. However, Vpr is incorporated into HIV-1 viral particles and plays a key role during the initial steps of the viral replication cycle. This 96 amino acids protein is involved in viral genome reverse transcription as well as in viral DNA translocation into the nucleus of the host cell. In parallel, Vpr provokes cell cycle arrest and apoptosis of infected T cells. Previously, it has been well established that Vpr participates in the control of the fidelity of the reverse transcription through the recruitment of the Uracil DNA Glycosylase 2 (UNG2) into the viral particles. UNG2 is an enzyme involved in different DNA repair pathway. However some studies have challenged the positive impact of UNG2 encapsidation for HIV-1 replication. Here, our studies confirm the important role of UNG2 for the control of the mutation rate in the newly synthesized viral DNA by a mechanism independent of its enzymatic activity but dependent to determinants located in the N-terminal domain that is involved in the recruitment of the p32 subunit of the RPA (Replication Protein A) complex (RPA32). First we showed that viruses produced in UNG2 or RPA32 depleted cells present a defect of infectivity and that the reverse transcription step is impaired during the course of infection of these viruses. Then we reported that the Vpr protein is able to form a trimolecular complex with UNG2 and RPA32 and we confirmed the importance of both UNG2 and RPA32 for optimal virus replication in a T cell line as well as in HIV-1 primary target cells. Even though macrophages and PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells), target cells of HIV-1, express low level of UNG2 and RPA32, these cellular proteins seem to be required for an efficient viral DNA synthesis leading to an optimal virus replication in primary cells. All these results suggest that Vpr controls the reverse transcription step through the recruitment of two cellular proteins UNG2 and RPA32 which allow the efficient dissemination of HIV-1 in the primary target cells.

La protéine auxiliaire Vpr du VIH-1 est exprimée tardivement au cours de la réplication virale. Toutefois, du fait de son encapsidation dans les particules virales, elle joue un rôle important dès les étapes initiales du cycle de réplication viral. Cette protéine de 96 acides aminés intervient en effet au cours de la rétrotranscription du génome viral puis de la translocation de l’ADN viral vers le noyau de la cellule hôte. Parallèlement, elle provoque un arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose des lymphocytes T infectés. Alors qu’il a été établi que Vpr participait au contrôle de la fidélité de la rétrotranscription via le recrutement au sein des particules virales de l’uracile DNA glycosylase 2 (UNG2), enzyme impliquée dans les processus de réparation de l’ADN, certaines études ont ensuite remis en question l’impact positif de l’encapsidation de l’UNG2 sur la réplication virale. Les travaux présentés ici permettent de confirmer le rôle de l’UNG2 dans le contrôle du taux de mutations au sein de l’ADN synthétisé à partir de l'ARN viral par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique, mais lié à des déterminants situés dans la partie N-terminale de la protéine engagée dans le recrutement de la sous-unité p32 du complexe RPA (Replication protein A) (RPA32). Nous avons montré, dans un premier temps, que la production de virus dans des cellules dont les niveaux d'expression de l'UNG2 et de RPA32 étaient diminués se traduisait par une réduction significative du pouvoir infectieux des particules virales et de la synthèse de l’ADN viral. Nous avons ensuite montré que la protéine Vpr est capable de former un complexe tri-moléculaire avec les protéines UNG2 et RPA32, et confirmé l’importance de ces deux protéines cellulaires pour permettre une réplication virale optimale aussi bien dans des lignées cellulaires T que dans les cellules primaires cibles du VIH-1. Même si les macrophages et les PBMCs (cellules mononucléaires du sang périphérique), cellules cibles du VIH-1, expriment des niveaux faibles d’UNG2 et de RPA32, ces protéines cellulaires semblent requises pour permettre une synthèse d'ADN virale suffisante à la réplication optimale du virus dans ces cellules primaires. L’ensemble de ces résultats suggère que le contrôle de la rétrotranscription par Vpr a lieu via le recrutement de deux protéines cellulaires UNG2 et RPA32 permettant la dissémination efficace du VIH-1 dans les cellules cibles primaires. / The HIV-1 auxiliary protein Vpr is expressed during the late steps of the viral replication. However, Vpr is incorporated into HIV-1 viral particles and plays a key role during the initial steps of the viral replication cycle. This 96 amino acids protein is involved in viral genome reverse transcription as well as in viral DNA translocation into the nucleus of the host cell. In parallel, Vpr provokes cell cycle arrest and apoptosis of infected T cells. Previously, it has been well established that Vpr participates in the control of the fidelity of the reverse transcription through the recruitment of the Uracil DNA Glycosylase 2 (UNG2) into the viral particles. UNG2 is an enzyme involved in different DNA repair pathway. However some studies have challenged the positive impact of UNG2 encapsidation for HIV-1 replication. Here, our studies confirm the important role of UNG2 for the control of the mutation rate in the newly synthesized viral DNA by a mechanism independent of its enzymatic activity but dependent to determinants located in the N-terminal domain that is involved in the recruitment of the p32 subunit of the RPA (Replication Protein A) complex (RPA32). First we showed that viruses produced in UNG2 or RPA32 depleted cells present a defect of infectivity and that the reverse transcription step is impaired during the course of infection of these viruses. Then we reported that the Vpr protein is able to form a trimolecular complex with UNG2 and RPA32 and we confirmed the importance of both UNG2 and RPA32 for optimal virus replication in a T cell line as well as in HIV-1 primary target cells. Even though macrophages and PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells), target cells of HIV-1, express low level of UNG2 and RPA32, these cellular proteins seem to be required for an efficient viral DNA synthesis leading to an optimal virus replication in primary cells. All these results suggest that Vpr controls the reverse transcription step through the recruitment of two cellular proteins UNG2 and RPA32 which allow the efficient dissemination of HIV-1 in the primary target cells.

La protéine auxiliaire Vpr du VIH-1 est exprimée tardivement au cours de la réplication virale. Toutefois, du fait de son encapsidation dans les particules virales, elle joue un rôle important dès les étapes initiales du cycle de réplication viral. Cette protéine de 96 acides aminés intervient en effet au cours de la rétrotranscription du génome viral puis de la translocation de l’ADN viral vers le noyau de la cellule hôte. Parallèlement, elle provoque un arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose des lymphocytes T infectés. Alors qu’il a été établi que Vpr participait au contrôle de la fidélité de la rétrotranscription via le recrutement au sein des particules virales de l’uracile DNA glycosylase 2 (UNG2), enzyme impliquée dans les processus de réparation de l’ADN, certaines études ont ensuite remis en question l’impact positif de l’encapsidation de l’UNG2 sur la réplication virale. Les travaux présentés ici permettent de confirmer le rôle de l’UNG2 dans le contrôle du taux de mutations au sein de l’ADN synthétisé à partir de l'ARN viral par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique, mais lié à des déterminants situés dans la partie N-terminale de la protéine engagée dans le recrutement de la sous-unité p32 du complexe RPA (Replication protein A) (RPA32). Nous avons montré, dans un premier temps, que la production de virus dans des cellules dont les niveaux d'expression de l'UNG2 et de RPA32 étaient diminués se traduisait par une réduction significative du pouvoir infectieux des particules virales et de la synthèse de l’ADN viral. Nous avons ensuite montré que la protéine Vpr est capable de former un complexe tri-moléculaire avec les protéines UNG2 et RPA32, et confirmé l’importance de ces deux protéines cellulaires pour permettre une réplication virale optimale aussi bien dans des lignées cellulaires T que dans les cellules primaires cibles du VIH-1. Même si les macrophages et les PBMCs (cellules mononucléaires du sang périphérique), cellules cibles du VIH-1, expriment des niveaux faibles d’UNG2 et de RPA32, ces protéines cellulaires semblent requises pour permettre une synthèse d'ADN virale suffisante à la réplication optimale du virus dans ces cellules primaires. L’ensemble de ces résultats suggère que le contrôle de la rétrotranscription par Vpr a lieu via le recrutement de deux protéines cellulaires UNG2 et RPA32 permettant la dissémination efficace du VIH-1 dans les cellules cibles primaires. / The HIV-1 auxiliary protein Vpr is expressed during the late steps of the viral replication. However, Vpr is incorporated into HIV-1 viral particles and plays a key role during the initial steps of the viral replication cycle. This 96 amino acids protein is involved in viral genome reverse transcription as well as in viral DNA translocation into the nucleus of the host cell. In parallel, Vpr provokes cell cycle arrest and apoptosis of infected T cells. Previously, it has been well established that Vpr participates in the control of the fidelity of the reverse transcription through the recruitment of the Uracil DNA Glycosylase 2 (UNG2) into the viral particles. UNG2 is an enzyme involved in different DNA repair pathway. However some studies have challenged the positive impact of UNG2 encapsidation for HIV-1 replication. Here, our studies confirm the important role of UNG2 for the control of the mutation rate in the newly synthesized viral DNA by a mechanism independent of its enzymatic activity but dependent to determinants located in the N-terminal domain that is involved in the recruitment of the p32 subunit of the RPA (Replication Protein A) complex (RPA32). First we showed that viruses produced in UNG2 or RPA32 depleted cells present a defect of infectivity and that the reverse transcription step is impaired during the course of infection of these viruses. Then we reported that the Vpr protein is able to form a trimolecular complex with UNG2 and RPA32 and we confirmed the importance of both UNG2 and RPA32 for optimal virus replication in a T cell line as well as in HIV-1 primary target cells. Even though macrophages and PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells), target cells of HIV-1, express low level of UNG2 and RPA32, these cellular proteins seem to be required for an efficient viral DNA synthesis leading to an optimal virus replication in primary cells. All these results suggest that Vpr controls the reverse transcription step through the recruitment of two cellular proteins UNG2 and RPA32 which allow the efficient dissemination of HIV-1 in the primary target cells.