Viral protein R (Vpr) is an evolutionarily conserved but poorly understood protein encoded by all primate lentiviruses, including the lineages that gave rise to both human immunodeficiency virus types 1 and 2 (HIV-1 and HIV-2), the causative agents of AIDS in humans. In this work, I sought to define the contribution of primate lentiviral Vpr to viral replication and evasion from cell-intrinsic antiviral defenses. I found that HIV-1 infection of human dendritic cells (MDDCs) is substantially attenuated upon infection with Vpr-deficient (HIV-1/ΔVpr) virus compared to wild-type (WT) infection. This replication defect to HIV-1/ΔVpr is evident in a single round of infection, results in reduced levels of viral transcription, and is relieved upon complementation by virion-associated Vpr. The block to transcription is alleviated through Vpr-engagement with the Cul4A/DCAF/DDB1 (DCAFCRL4) ubiquitin ligase complex and a yet-to-be identified host factor, hypothesized to induce the DNA damage response (DDR) in infected cells. MDDCs are critical immune cells that are poised to detect invading viruses through a variety of cell-intrinsic antiviral sensors, resulting in the production of type I interferon (IFN) and restriction of virus replication. Surprisingly, infection of MDDCs with Vpr-deficient lentiviruses (HIV-2 or SIVmac) resulted in production of type I IFN indicating that this pathway is targeted by Vpr. I determined that signaling cascades that induce NF-κB-dependent type I IFN production are triggered in response to lentiviral integration, an obligatory process in lentivirus life cycle that results in host DNA lesions and subsequent repair by cellular DNA repair machinery. I also demonstrated that mutations in SIVmac Vpr that ablate the ability to initiate DDR are unable to counteract the antiviral type I IFN response. Together, our work suggests the existence of a novel host factor that detects lentiviral integration in MDDCs to trigger an innate immune response that blocks virus dissemination. I hypothesize that Vpr by overcoming this cell intrinsic block to integration would be a critical viral adaptation to facilitate cross-species transmission that resulted in the HIV pandemic. / 2018-11-01T00:00:00Z

Dekkera and the closely related Brettanomyces are important yeasts in food and beverage production in part due to the metabolism of hydroxycinnamic acids (HCAs). There is a dearth of information concerning the role Brettanomyces spp. play in the food or beverage from which they are isolated and although Dekkera spp. have been investigated further there are discrepancies and questions yet to be answered. Representatives of both genera were examined to define growth and metabolism of individual HCAs in synthetic media. In addition, growth with combinations of HCAs was investigated for the first time. The results provide a comprehensive overview of HCA metabolism and volatile product formation for these genera. Furthermore, results have been confirmed in a semidefined wine medium that more closely resembled the physio-chemical parameters found in the typical wine environment. The enzymes responsible for the metabolism of HCAs were examined in Dekkera and Brettanomyces. Dekkera yeasts are known to enzymatically convert HCAs into vinylphenols (VPs) and ethylphenols (EPs). These products are indicative of Dekkera contamination. The first enzyme in the two-step HCA ─ VP ─ EP biochemical pathway is a hydroxycinnamic acid decarboxylase (HCD). This enzyme has been previously characterised from a single Dekkera strain. The second enzyme, vinylphenol reductase (VPR) has never been isolated or characterised from any microorganism. In order to further elucidate the HCA ─ VP ─ EP pathway, cell extracts were prepared from all five Dekkera and Brettanomyces spp. to evaluate activity against HCAs and VPs. Brettanomyces spp. were unable to metabolise HCAs indicating that these yeast do not have a functional HCD enzyme. Both Dekkera spp. have substrate inducible HCD activity. Temperature and pH optima were 40ºC and 5.75-6.00, respectively. The active protein was purified from cell extracts of D. anomala CBS 77 and a partial sequence was obtained. 3’RACE PCR was performed and a near complete gene sequence determined. This sequence does not have homology to HCA decarboxylase enzymes previously characterised from yeasts and bacteria and thus may represent a novel enzyme not previously described. Biochemical characterisation of the vinylphenol reductase (VPR) enzyme was also undertaken. VPR activity was found for all 5 Dekkera and Brettanomyces spp. Activity was greatest at pH 6 and between 40-50ºC and was induced by both VPs and HCAs. Data obtained during growth experiments indicated that HCAs, and in particular ferulic acid, inhibited the growth of Dekkera and Brettanomyces spp. On this basis a more detailed study was carried out to determine the concentrations required to prevent growth in various media. In a modified red wine a concentration 0.1 mM ferulic acid inhibited growth and 2 mM prevented cultures of both D. anomala and D. bruxellensis from becoming established even when re-inoculated into to a fresh HCA-free medium. Scanning electron micrographs revealed that ferulic acid caused physical damage to Dekkera cells upon exposure. This work could lead to the development of an alternative method for the control of Dekkera in wine or other food products. / http://proxy.library.adelaide.edu.au/login?url= http://library.adelaide.edu.au/cgi-bin/Pwebrecon.cgi?BBID=1454852 / Thesis (Ph.D.) -- University of Adelaide, School of Agriculture, Food and Wine, 2010

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thesis (M.S.)--Uniformed Services University of the Health Sciences, 2006 / Typescript (photocopy)

Le détournement de la machinerie cellulaire basé sur la dégradation par la voie du protéasome est une stratégie fréquemment retrouvée chez les virus afin d’optimiser leur réplication. Ainsi, le VIH-1 a développé toute une série de contremesures via ses protéines accessoires, vif et vpu notamment, afin de cibler les facteurs de restriction vers la voie du protéasome. La protéine accessoire Vpr est également associée à un complexe Cul4 E3 ubiquitin ligase mais est toujoursorphelin de sa cible. Nos travaux ont montré que la protéine CTIP2 est un acteur majeur impliqué dans la restriction de la réplication du VIH-1. Nous proposons de défendre la thèse selon laquelle la protéine CTIP2 est dégradée par la voie du protéasome en présence de la protéine vpr. Nous avons ainsi montré que l’expression de la protéine CTIP2 est plus forte en absence qu’en présence de la protéine vpr. Des expériences utilisant des inhibiteurs de la voie du protéasome sont en faveur d’une régulation de type post traductionnel. Par immunoprécipitation, nous avons montré que CTIP2 fait partie d’un complexe comprenant DDB1 et DCAF1 en présence et en absence de Vpr. Sa dégradation est prévenue en présence du mutant vpr (Q65R) qui n’interagit plus avec DCAF, et en présence d’un Knock Down de DCAF1par ailleurs, DCAF1 est associé avec CTIP2 inclus dans le complexe impliqué dans l’établissement de la latence du VIH-1 comprenant notamment HDAC1. Enfin, les protéines CTIP2, Vpr et DCAF colocalisent dans les noyaux des cellules microgliales. Nos résultats suggèrent fortement que la protéine Vpr favorise la dégradation du facteur CTIP2, qui est décrit comme un facteur restreignant l’infection par le VIH-1 dans les cellules microgliales, et ainsi favorise sa réplication. / Usurping the host ubiquitination proteasome system (UPS) to inactivate the undesirable host protein is a common viral strategy. HIV-1 proteins inactivate the detrimental host proteins by this system. In Microglial cells, CTIP2 represses both initial phase and late phase of HIV-1 gene transcription. As HIV-1 can still replicate in the presence of CTIP2, we postulated that it might inactivate CTIP2 by using Cul4 E3 ubiquitin ligase complex to resume its replication. We observed higher CTIP2 expressions in the absence of Vpr, with no effect on CTIP2 mRNA and proteasome inhibitor can block this degradation. Co-immunoprecipitation assays showed that CTIP2 is associated with DCAF1 and DDB1 in the absence and presence of Vpr. We showed that this degradation is prevented by the using Vpr mutant (Q65R) and by knock down of DCAF1. Finally, we observed the co-localization of CTIP2 with Cul4A-DCAF1-DDB1 complex even in the absence of Vpr, in microglial cells. Additionally, DCAF1 interacts with CTIP2-associated heterochromatin enzymes complex. Our results suggest that Vpr expression increases the turnover of CTIP2 in HIV-1 productively infected cells. By degrading CTIP2, HIV-1 counteracts CTIP2-mediated silencing of its expression and favors its replication.

Les cellules infectées de façon latente constituent de sérieux obstacles à l'éradication du VIH et à la guérison complète des patients. Nous avons précédemment rapporté que le facteur cellulaire CTIP2 joue un rôle clé dans l'établissement et dans la persistance de la latence du VIH dans les cellules de la microglie, principaux réservoirs du virus dans le cerveau. En recrutant des complexes enzymatiques au niveau du promoteur viral, CTIP2 inhibe l'expression des gènes en favorisant la compaction de la chromatine et défavorise la réactivation des réservoirs viraux grâce à son activité inhibitrice de l’activité kinase du complexe d’élongation pTEFb. Cependant, nous ne savons pas comment le VIH-1 contrecarre les effets répresseurs de CTIP2 dans des cellules permissives à son expression. Manipuler la machinerie cellulaire d'ubiquitination afin de cibler les protéines hôtes indésirables est une stratégie commune utilisée par les rétrovirus. Ici, nous postulons que la protéine auxiliaire Vpr pourrait favoriser la dégradation de CTIP2 via le complexe CUL4-DDB1-DCAF1 pour contrer ses effets sur la réplication du VIH-1. Nos précédents résultats ont montré que CTIP2 contribuait à la réponse antivirale cellulaire grâce à son activité répressive sur la transcription du VIH. Nous avons montré que l'expression de CTIP2 était induite par un traitement à l'interféron-α suggérant que ce facteur fait partie de la réponse cellulaire à des infections virales. Nous avons observé que la réplication du wt- mais pas du mutant délété pour vpr diminue l'expression de CTIP2 dans des cellules infectées de manières productives. L'expression de Vpr a été corrélée avec une dégradation de CTIP2 et une augmentation de la transcription des gènes du VIH-1. De plus, nous avons montré par des expériences d’immunoprécipitation et de FRET/FLIM que la protéine CTIP2 interagit avec DDB1, DCAF1 et Vpr afin d'induire la dégradation de CTIP2 par la voie du protéasome. Enfin, nous démontrons que DCAF1 est nécessaire à la dégradation de CTIP2 par Vpr dans les noyaux des cellules infectées. Nos résultats suggèrent ainsi que la protéine virale Vpr détourne la machinerie cellulaire et plus spécifiquement la voie de dégradation du protéasome afin d'induire la dégradation de CTIP2. En dégradant CTIP2, le VIH-1 contrecarre une réponse cellulaire anti-virale et favorise ainsi sa réplication. Notre travail a permis de mieux comprendre la nature des mécanismes mis en jeu par le VIH-1 afin de favoriser sa réplication dans les cellules microgliales. / Latently infected cells constitute major blocks to HIV-1 eradication and a functional cure of the patients. We have previously reported that the cellular co-factor CTIP2 plays a key role in the establishment and persistence of HIV latency in microglial cells, the main reservoirs of the virus in the brain. By recruiting large enzymatic complexes at the viral promoter, CTIP2 silences HIV-1 gene transcription and disfavors the viral reactivation from the reservoirs. However, nothing is known on how HIV-1 can counteract the effects of CTIP2 in permissively infected cells. Usurping the host ubiquitination machinery to target undesirable host proteins is a common strategy utilized by retroviruses. Here, we tend to postulate that HIV-1 Vpr may target CTIP2 by Cul4A-DDB1-DCAF1 complex to counteract its effects on HIV-1 replication. Our results showed that CTIP2 contributes to the cellular anti-viral response. We demonstrated that interferon treatments induce expression of CTIP2 suggesting that this factor may be part of the cellular response to viral infections. We observed that replication of wt- but not Vpr-deleted HIV-1 reduced CTIP2 expression in productively infected cells. Vpr expression was correlated with low levels of CTIP2 and increased levels HIV-1 gene transcription. In addition, we showed that CTIP2 interacts with DDB1, DCAF1 and HIV-1 Vpr in order to induce the degradation of CTIP2 via proteasome by coimmunoprecipitation and FRET experiments. Finally, the abrogation of Vpr binding to the DCAF1-CUL4-DDB1 complex prevented CTIP2 degradation. Our results suggest that Vpr engages the ubiquitination machinery to induce CTIP2 degradation. By degrading CTIP2, HIV-1 counteracts CTIP2-mediated silencing of its expression and thus favors viral replication. Our work has helped to understand the nature of the mechanisms involved in HIV-1 to foster its replication in microglial cells. These results allow us to consider new strategies toward a cure of the patients.

L’autophagie est un mécanisme de l’immunité innée contre le VIH-1 déclenché très rapidement dans les cellules T CD4 par les protéines d’enveloppe du virus (Env). Dans les cellules T CD4 appelées « bystander », c’est-à-dire où l’infection est abortive, l’autophagie entraine l’apoptose. Dans les cellules T CD4 infectées de façon productive, l’autophagie est inhibée, empêchant ainsi à la fois la dégradation du virus et/ou des protéines virales et l’apoptose médiée par Env. Le but de cette étude de doctorat est de comprendre comment l’autophagie est bloquée dans les cellules T CD4 infectées par le VIH-1. Durant la première année de ma thèse, j’ai contribué au travail montrant que Vif nouvellement synthétisé bloque l’autophagie dans les lymphocytes T CD4 infectés. Les données ont été publiées en Janvier 2015 dans AIDS sous le titre «HIV-1 viral infectivity factor interacts with microtubule-associated protein light chain 3 and inhibits autophagy». Ensuite, j’ai montré que Vpr contribue aussi à l’inhibition de l’autophagie. En effet, Vpr ectopique diminue grandement le nombre des autophagosomes présents dans les cellules T CD4 quand l’autophagie est induite par un inhibiteur de mTOR. De même, Vpr incorporé dans les virions diminue le nombre des autophagosomes présents dans les cellules T CD4 très rapidement après leur infection productive (4h et 8h). Dans le but de définir le mécanisme par lequel la protéine Vpr entraine ce blocage, j’ai fait des expériences de GST pull-down et j’ai identifié que Vpr interagit avec BNIP3, une protéine pro-autophagique. De plus, le niveau d’expression de BNIP3 est augmenté dans les cellules T CD4 après le contact avec Env, suggérant que BNIP3 pourrait être impliqué dans l’induction de l’autophagie médiée par l’Env. Vpr co-localise avec BNIP3 et Vpr incorporé dans les virions induit une diminution drastique du niveau d’expression de BNIP3 après 8 heures d’infection. En conclusion, j’ai montré qu’au moins deux protéines du VIH-1 sont séquentiellement impliquées dans l’inhibition de l’autophagie dans les cellules T CD4 infectées par le VIH-1, Vpr qui contrôle l’autophagie durant la phase précoce de l’infection, et Vif néo-synthétisé qui inhibe l’autophagie après la transcription du génome viral. La compréhension complète des mécanismes par lesquels le VIH-1 inhibe l’autophagie devrait à terme permettre l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce virus. / Autophagy is a potent anti-HIV-1 mechanism. It is triggered in CD4 T cells by the viral envelope (Env) upon HIV-1 entry. In bystander CD4 T cells, autophagy leads to apoptosis. In productively infected CD4 T cells, autophagy is inhibited, preventing thus HIV-1 virophagy and Env-mediated apoptosis. The aim of my PhD study was to understand how autophagy is blocked in the HIV-1-infected CD4 T cells. During the first year of my thesis, I contributed to the work demonstrating that Vif neosynthesized blocks autophagy in the infected CD4 T lymphocytes. The data were published in January 2015 in AIDS under the title “HIV-1 viral infectivity factor interacts with microtubule-associated protein light chain 3 and inhibits autophagy”. Then, I demonstrated that Vpr contributes also to the inhibition of autophagy. Indeed, both ectopic expression of Vpr and Vpr incorporated into the virions decrease the number of autophagosomes in CD4 T cells when autophagy is induced by an inhibitor of mTOR and Env, respectively. To define the mechanism by which HIV-1 Vpr inhibits autophagy, I performed GST pull-down experiments and identified that Vpr interacts with BNIP3, a pro-autophagic protein. Importantly, BNIP3 expression level is increased in CD4 T cells upon Env contact, suggesting that BNIP3 could be responsible for the Env-mediated induction of autophagy. Furthermore, Vpr co-localizes with BNIP3 and viral incorporated Vpr decreases BNIP3 levels after 8 hours of infection. In conclusion, I demonstrated that at least two HIV-1 proteins are sequentially involved in the inhibition of autophagy in HIV-1-infected CD4 T cells, Vpr that controls autophagy during the early phase of infection, and then neo-synthesized Vif that inhibits autophagy after HIV-1 genome transcription. The complete understanding of the mechanisms by which HIV-1 inhibits autophagy should lead to the rising of new molecular strategies to fight against this virus.

Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2012. / ENGLISH ABSTRACT: The synthetic progestins, medroxyprogesterone acetate (MPA) and norethisterone (Net) and its derivatives (norethisterone enanthate (Net-EN) and norethisterone acetate (Net-A)), are widely used as contraceptives and in hormone replacement therapy (HRT). Several studies have indicated that synthetic progestins modulate immune function and increase the risk of sexually transmitted infections. However, little is known about the molecular mechanism of action of MPA and Net, in particular their regulation of gene expression in the female genital tract, as compared to progesterone (P4). In the first part of this thesis, the effect of P4, MPA and Net-A on the expression of the endogenous chemokine genes, macrophage inflammatory protein (MIP)-1α and MIP-1β, was investigated in a human vaginal epithelial cell line (Vk2/E6E7). Quantitative realtime PCR (QPCR) showed that both P4 and MPA upregulated the TNF-α-induced expression of MIP-1α and MIP-1β mRNA, while Net-A had no effect. Using siRNA technology, it was found that the responses to P4 and MPA on the MIP-1α gene, but not the MIP-1β gene, are mediated via the glucocorticoid receptor (GR). In the second part of the thesis, it was investigated whether the HIV-1 accessory protein, viral protein R (Vpr), could modulate the action of ligands on MIP-1α and MIP-1β gene expression. QPCR showed that Vpr abrogates the effects of P4 and MPA on the TNF-α induced expression of MIP-1α and MIP-1β. Silencing the GR with siRNA technology showed that the GR plays a role in the effect of Vpr on the P4 and MPA-induced expression of MIP-1α. Taken together, these results show that MPA and Net-A display differential effects on chemokine gene expression in a human vaginal epithelial cell line. Furthermore, this study shows that Vpr modulates the effects of MPA bound to the GR. Thus, the results of this thesis provide insight into the effect of synthetic progestins on the immune response in the vagina, and possibly how HIV-infection may alter these responses. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Die sintetiese progestiene medroksieprogesteroon asetaat (MPA) en noretisteroon (Net) en derivate daarvan (noretisteroon enantaat (Net-EN) en noretisteroon asetaat (Net-A)), word op grootskaal gebruik as voorbehoedmiddels en in hormoonvervangingsterapie (HVT). Verskeie studies het al aangedui dat sintetiese progestiene immuunfunksie moduleer en die risiko vir seksuel oordraagbare infeksies verhoog. Daar is egter min bekend oor die molekulêre meganisme van aksie van MPA en Net, in die besonder die regulering van geenuitdrukking in die vroulike geslagskanaal in vergelyking met progesteroon (P4). In die eerste deel van hierdie tesis is die effek van P4, MPA en Net-A op die uitdrukking van endogene chemokiene gene, makrofaag inflammatoriese proteïen (MIP)-1α en MIP-1β, in 'n menslike vaginale epiteel sellyn (Vk2/E6E7) bestudeer. Kwantitatiewe intydse PKR (KPKR) het getoon dat beide P4 en MPA die TNF-α-geïnduseerde uitdrukking van beide die MIP-1α en MIP-1β mRNA uitdrukking op reguleer, terwyl Net-A geen effek getoon het nie. Met die gebruik van siRNA-tegnologie is daar bevind dat die effekte van P4 en MPA, bemiddel word deur die glukokortikoïd-reseptor (GR) op MIP-1α geen uitdrukking, maar nie op MIP-1β nie. In die tweede deel van die tesis, is ondersoek of die MIV-1-bykomstigheidsproteïen, virale proteïen R (Vpr), die aksie van die ligande op MIP 1α en MIP-1β geenuitdrukking kan moduleer. KPKR toon dat Vpr die uitwerking van P4 en MPA op die TNF-α-geïnduseerde uitdrukking van MIP 1α en MIP-1β kanselleer. Die verwydering van die GR met siRNA-tegnologie toon dat die GR 'n rol in die uitwerking van Vpr op die P4 en MPA-geïnduseerde uitdrukking van MIP-1α speel. Ter samevatting: hierdie resultate toon dat MPA en Net-A differensiële uitwerkings vertoon op chemokiene geenuitdrukking in 'n menslike vaginale epiteel sellyn, en dat Vpr hierdie uitwerkings moduleer van MPA gobonde aan die GR. Die resultate van hierdie tesis werp dus lig tot die uitwerking van sintetiese progestiene op die immuunreaksie in die vagina, sowel as hoe MIVinfeksie hierdie reaksies kan verander.

<p>Given the emerging epidemic of renal disease in HIV+ patients and the fact that HIV DNA and RNA persist in the kidneys of HIV+ patients despite therapy, it is necessary to understand the role of direct HIV-1 infection of the kidney. HIV-associated kidney disease pathogenesis is attributed in large part to viral proteins. Expression of Vpr in renal tubule epithelial cells (RTECs) induces G2 arrest, apoptosis and polyploidy. The ability of a subset of cells to overcome the G2/M block and progress to polyploidy is not well understood. Polyploidy frequently associates with a bypass of cell death and disease pathogenesis. Given the ability of the kidney to serve as a unique compartment for HIV-1 infection, and the observed occurrence of polyploid cells in HIV+ renal cells, it is critical to understand the mechanisms and consequences of Vpr-induced polyploidy. </p><p>Here I determined effects of HIV-1 Vpr expression in renal cells using highly efficient transduction with VSV.G pseudotyped lentiviral vectors expressing Vpr in the HK2 human tubule epithelial cell line. Using FACS, fluorescence microscopy, and live cell imaging I show that G2 escape immediately precedes a critical junction between two distinct outcomes in Vpr+ RTECs: mitotic cell death and polyploidy. Vpr+ cells that evade aberrant mitosis and become polyploid have a substantially higher survival rate than those that undergo complete mitosis, and this survival correlates with enrichment for polyploidy in cell culture over time. Further, I identify a novel role for ATM kinase in promoting G2 arrest escape and polyploidy in this context. In summary, my work identifies ATM-dependent override of Vpr-mediated G2/M arrest as a critical determinant of cell fate Vpr+ RTECs. Further, our work highlights how a poorly understood HIV mechanism, ploidy increase, may offer insight into key processes of reservoir establishment and disease pathogenesis in HIV+ kidneys.</p> / Dissertation