Le VIH-1 est un rétrovirus contenant deux copies de son génome ARN simple brin positif. Dans la cellule, son ARN est rétrotranscrit en ADN puis cet ADN est intégré dans le génome cellulaire. L'ADN viral est ensuite transcrit en ARN dont la moitié évite l'épissage. Dans le cytoplasme, cet ARN possède une double fonctionnalité : il sert d'ARNm pour la synthèse des protéines Gag et Gag-Pol et d'ARN génomique (ARNg) qui est encapsidé sous forme de dimère. Malgré sa faible abondance dans la cellule, l'ARNg est préférentiellement encapsidé. Cependant, il a été montré par nous et d'autres que d'autres ARN non-génomiques peuvent également être spécifiquement encapsidés, tels que des ARN viraux épissés et certains ARN cellulaires, bousculant ainsi le dogme d'une spécificité unique pour l'ARNg. Nous avons montré que le VIH-1 contrôlerait l'incorporation des ARN viraux, épissés et non épissés, par un mécanisme de compétition, impliquant des facteurs communs. En revanche, les ARN cellulaires 7SL et U6 semblent encapsidés par des mécanismes indépendants. Afin d'identifier les déterminants qui régissent la spécificité d'encapsidation, nous avons testé le rôle de la nucléocapside (NC) qui est fortement impliquée dans l'encapsidation. Nous montrons ici que de façon tou t à fait inattendue, des mutations de NC conduisent à l'encapsidation d'ADN et augmentent également l'encapsidation d'ARN viraux épissés. Nous avons ensuite cartographié les déterminants de la région 5' UTR de l'ARNg et déterminé que la tige-boucle polyA et la région PBS sont impliquées dans l'encapsidation des ARN viraux épissés. Ce travail apporte une meilleure compréhension de la spécificité d'encapsidation, primordiale pour la mise au point de thérapies géniques utilisant des vecteurs lentiviraux. / HIV-1 is a retrovirus containing two copies of its single stranded positive RNA genome. In the cell, its RNA is reverse transcribed into DNA and this DNA is integrated into the cellular genome. The viral DNA is then transcribed into RNA. One moiety of this RNA pool escapes splicing. Once in the cytoplasm, this RNA has a double function: it serves as mRNA for synthesis of Gag and Gag-Pol proteins and as genomic RNA (gRNA) that is packaged as a dimer. Despite its low abundance in the cell, the gRNA is preferentially encapsidated into virions. However, it has been shown by us and others that other non-genomic RNA can be specifically packaged, such as spliced viral RNA and some cellular RNA, thus shaking up the dogma of a unique specificity for the gRNA. We have shown that HIV-1 might control the incorporation of the spliced and unspliced RNA by a mechanism of competition, involving common factors. In contrast, cellular RNA 7SL and U6 seem encapsid ated through independent mechanisms. To identify the determinants that govern the specificity of encapsidation, we tested the role of the nucleocapsid (NC) which is strongly involved in the packaging. Here we show that unexpectedly, mutations of NC lead to the encapsidation of DNA and also increase the encapsidation of spliced viral RNA. We then mapped the determinants in the 5' UTR of the gRNA and determined that the polyA stem-loop and the PBS region are involved in the encapsidation of the spliced viral RNA. This work provides a better understanding of the specificity of encapsidation that is crucial for the development of gene therapy using lentiviral vectors.

Le VIH-1 est un rétrovirus dont le génome est constitué d'ARN (ARNg). La conversion de cet ARNg en ADN est réalisée lors de la rétrotranscription (RTion). Elle permet de convertir l'ARNg simple brin en une molécule d'ADN double brin, qui sera ensuite intégrée dans le génome de la cellule hôte pour assurer la réplication du virus. La RTion est réalisée dans les premières heures de l'infection, dès l'entrée du virus. La protéine de nucléocapside (NC) participe activement à cette conversion. La NC est une petite protéine avec deux motifs en doigt à zinc (ZF1 et ZF2) qui avec sa partie basique N-term sont responsables de son activité chaperonne des acides nucléiques. L'équipe a récemment découvert un nouveau rôle de la NC en observant que la mutation des doigts de zinc ou de la région basique N-term déclenche prématurément la RTion avant le relargage des nouveaux virus, c'est à dire pendant les phases tardives de réplication du VIH. Nous parlons alors de "RTion tardive". Celle-ci génère des virus à forte teneur en ADN viral. Ces résultats originaux indiquent que la NC joue un rôle dans le contrôle spatio-temporel de la RTion au cours de la réplication du VIH. Mon projet de thèse a consisté à identifier les partenaires potentiels de la NC dans cette RT tardive et à élucider les mécanismes moléculaires mis en jeu. L'approche expérimentale principalement utilisée au cours de ma thèse, consiste à la production de particules VIH-1 (pNL4-3) et à l'analyse de leur contenu en acides nucléiques par PCR quantitative en temps réel. En mesurant l'effet de la présence et de l'absence de la protéine virale Vif sur le déclenchement de la RTion tardive dans des cellules produisant le VIH-1, nous avons démontré l'implication de Vif dans la régulation de la RTion tardive. Nous avons également montré que l'ARNg, et plus particulièrement sa région 5'UTR, est un partenaire essentiel de la NC et de Vif dans le contrôle du timing de la RTion tardive. Notre étude comparative avec un rétrovirus plus ancien et plus simple (pas de Vif) comme le Murine Leukemia Virus (MuLV), montre que cette propriété de la NC du VIH-1 à contrôler la RTion tardive n'est pas commune à tous les rétrovirus. Pour mieux comprendre le rôle de la NC au cours des phases tardives de la réplication du VIH-1, nous avons utilisé la technique de microscopie TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence microscopy) en cellules vivantes. Cette technique de microscopie permet de visualiser les étapes d'assemblage, de bourgeonnement et de relargage des particules virales à la membrane plasmique de la cellule hôte. Bien que la NC n'influe pas sur la cinétique d'assemblage du virus, elle est en revanche fortement impliquée dans le contrôle du bourgeonnement et du relargage des particules VIH-1. Des expériences de trans-complémentation du VIH-1 mutant (délétion du ZF2) montrent que la NC contribue au recrutement des protéines cellulaires ESCRT (Endosomal Sorting Complex Required for Transport) aux sites d'assemblage viral, notamment via la voie Tsg101. / HIV-1 is a retrovirus whose genome consists of RNA (gRNA). Conversion of this gRNA into DNA is made during reverse transcription (RTion). It can convert single-stranded gRNA in a double-stranded DNA molecule, which is then integrated into the genome of the host cell to ensure the virus replication. The RTion is carried out in the early hours of infection, soon after virus entry. The nucleocapsid protein (NC) is actively involved in this conversion. The NC protein chaperones this process via its nucleic acid annealing activities and its interactions with the reverse transcriptase enzyme. To function the NC needs its two conserved zinc fingers and flanking basic residues. The team recently discovered a new role for the NC. When the NC has a mutation of its zinc fingers or its N-terminal basic region, the RTion is made prematurely before the release of new viruses, i.e. during the later stages of HIV replication. We call it «late RTion". This RTion generates virus with a high level of viral DNA. These results indicate that the NC plays a role in the spatio-temporal control of the RTion during HIV replication. My thesis project was to identify potential partners of the NC in the late RT process and to elucidate the molecular mechanisms involved.The experimental approach mainly used in my project is the production of HIV-1 particles (pNL4-3) and the analysis of their nucleic acid content by Q-PCR in real-time. By measuring the effect of the presence and absence of the viral protein Vif on the initiation of late RTion in cells producing HIV-1, we demonstrated the role of Vif in late RTion regulation. We also showed that the gRNA, and particularly its 5'UTR, is a key partner of the NC and Vif in the control of the late RTion. Our comparative study between HIV-1 and an old and simple (no Vif) retrovirus such as the Murine Leukemia Virus (MuLV) showed that the ability of the HIV-1 NC to control late RTion is not common to all retroviruses.To better understand the role of NC during the late stages of the HIV-1 replication, we used the TIRF microscopy (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) in live cells. The TIRF allows the visualization of the viral assembly, budding and release of virus particles at the plasma membrane of the host cell. Although the NC does not contribute to the kinetic of the virus assembly, it is however strongly involved in the control of the budding and the release of the HIV-1 particles. Experiences of trans-complementation of a HIV-1 mutant (deletion of ZF2) showed that NC contributes to the recruitment of the cellular ESCRT machinery (Endosomal Sorting Complex Required for Transport) at the assembly sites, particularly through the Tsg101 pathway.

La protéine auxiliaire Vpr du VIH-1 est exprimée tardivement au cours de la réplication virale. Toutefois, du fait de son encapsidation dans les particules virales, elle joue un rôle important dès les étapes initiales du cycle de réplication viral. Cette protéine de 96 acides aminés intervient en effet au cours de la rétrotranscription du génome viral puis de la translocation de l’ADN viral vers le noyau de la cellule hôte. Parallèlement, elle provoque un arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose des lymphocytes T infectés. Alors qu’il a été établi que Vpr participait au contrôle de la fidélité de la rétrotranscription via le recrutement au sein des particules virales de l’uracile DNA glycosylase 2 (UNG2), enzyme impliquée dans les processus de réparation de l’ADN, certaines études ont ensuite remis en question l’impact positif de l’encapsidation de l’UNG2 sur la réplication virale. Les travaux présentés ici permettent de confirmer le rôle de l’UNG2 dans le contrôle du taux de mutations au sein de l’ADN synthétisé à partir de l'ARN viral par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique, mais lié à des déterminants situés dans la partie N-terminale de la protéine engagée dans le recrutement de la sous-unité p32 du complexe RPA (Replication protein A) (RPA32). Nous avons montré, dans un premier temps, que la production de virus dans des cellules dont les niveaux d'expression de l'UNG2 et de RPA32 étaient diminués se traduisait par une réduction significative du pouvoir infectieux des particules virales et de la synthèse de l’ADN viral. Nous avons ensuite montré que la protéine Vpr est capable de former un complexe tri-moléculaire avec les protéines UNG2 et RPA32, et confirmé l’importance de ces deux protéines cellulaires pour permettre une réplication virale optimale aussi bien dans des lignées cellulaires T que dans les cellules primaires cibles du VIH-1. Même si les macrophages et les PBMCs (cellules mononucléaires du sang périphérique), cellules cibles du VIH-1, expriment des niveaux faibles d’UNG2 et de RPA32, ces protéines cellulaires semblent requises pour permettre une synthèse d'ADN virale suffisante à la réplication optimale du virus dans ces cellules primaires. L’ensemble de ces résultats suggère que le contrôle de la rétrotranscription par Vpr a lieu via le recrutement de deux protéines cellulaires UNG2 et RPA32 permettant la dissémination efficace du VIH-1 dans les cellules cibles primaires. / The HIV-1 auxiliary protein Vpr is expressed during the late steps of the viral replication. However, Vpr is incorporated into HIV-1 viral particles and plays a key role during the initial steps of the viral replication cycle. This 96 amino acids protein is involved in viral genome reverse transcription as well as in viral DNA translocation into the nucleus of the host cell. In parallel, Vpr provokes cell cycle arrest and apoptosis of infected T cells. Previously, it has been well established that Vpr participates in the control of the fidelity of the reverse transcription through the recruitment of the Uracil DNA Glycosylase 2 (UNG2) into the viral particles. UNG2 is an enzyme involved in different DNA repair pathway. However some studies have challenged the positive impact of UNG2 encapsidation for HIV-1 replication. Here, our studies confirm the important role of UNG2 for the control of the mutation rate in the newly synthesized viral DNA by a mechanism independent of its enzymatic activity but dependent to determinants located in the N-terminal domain that is involved in the recruitment of the p32 subunit of the RPA (Replication Protein A) complex (RPA32). First we showed that viruses produced in UNG2 or RPA32 depleted cells present a defect of infectivity and that the reverse transcription step is impaired during the course of infection of these viruses. Then we reported that the Vpr protein is able to form a trimolecular complex with UNG2 and RPA32 and we confirmed the importance of both UNG2 and RPA32 for optimal virus replication in a T cell line as well as in HIV-1 primary target cells. Even though macrophages and PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells), target cells of HIV-1, express low level of UNG2 and RPA32, these cellular proteins seem to be required for an efficient viral DNA synthesis leading to an optimal virus replication in primary cells. All these results suggest that Vpr controls the reverse transcription step through the recruitment of two cellular proteins UNG2 and RPA32 which allow the efficient dissemination of HIV-1 in the primary target cells.

La protéine auxiliaire Vpr du VIH-1 est exprimée tardivement au cours de la réplication virale. Toutefois, du fait de son encapsidation dans les particules virales, elle joue un rôle important dès les étapes initiales du cycle de réplication viral. Cette protéine de 96 acides aminés intervient en effet au cours de la rétrotranscription du génome viral puis de la translocation de l’ADN viral vers le noyau de la cellule hôte. Parallèlement, elle provoque un arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose des lymphocytes T infectés. Alors qu’il a été établi que Vpr participait au contrôle de la fidélité de la rétrotranscription via le recrutement au sein des particules virales de l’uracile DNA glycosylase 2 (UNG2), enzyme impliquée dans les processus de réparation de l’ADN, certaines études ont ensuite remis en question l’impact positif de l’encapsidation de l’UNG2 sur la réplication virale. Les travaux présentés ici permettent de confirmer le rôle de l’UNG2 dans le contrôle du taux de mutations au sein de l’ADN synthétisé à partir de l'ARN viral par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique, mais lié à des déterminants situés dans la partie N-terminale de la protéine engagée dans le recrutement de la sous-unité p32 du complexe RPA (Replication protein A) (RPA32). Nous avons montré, dans un premier temps, que la production de virus dans des cellules dont les niveaux d'expression de l'UNG2 et de RPA32 étaient diminués se traduisait par une réduction significative du pouvoir infectieux des particules virales et de la synthèse de l’ADN viral. Nous avons ensuite montré que la protéine Vpr est capable de former un complexe tri-moléculaire avec les protéines UNG2 et RPA32, et confirmé l’importance de ces deux protéines cellulaires pour permettre une réplication virale optimale aussi bien dans des lignées cellulaires T que dans les cellules primaires cibles du VIH-1. Même si les macrophages et les PBMCs (cellules mononucléaires du sang périphérique), cellules cibles du VIH-1, expriment des niveaux faibles d’UNG2 et de RPA32, ces protéines cellulaires semblent requises pour permettre une synthèse d'ADN virale suffisante à la réplication optimale du virus dans ces cellules primaires. L’ensemble de ces résultats suggère que le contrôle de la rétrotranscription par Vpr a lieu via le recrutement de deux protéines cellulaires UNG2 et RPA32 permettant la dissémination efficace du VIH-1 dans les cellules cibles primaires. / The HIV-1 auxiliary protein Vpr is expressed during the late steps of the viral replication. However, Vpr is incorporated into HIV-1 viral particles and plays a key role during the initial steps of the viral replication cycle. This 96 amino acids protein is involved in viral genome reverse transcription as well as in viral DNA translocation into the nucleus of the host cell. In parallel, Vpr provokes cell cycle arrest and apoptosis of infected T cells. Previously, it has been well established that Vpr participates in the control of the fidelity of the reverse transcription through the recruitment of the Uracil DNA Glycosylase 2 (UNG2) into the viral particles. UNG2 is an enzyme involved in different DNA repair pathway. However some studies have challenged the positive impact of UNG2 encapsidation for HIV-1 replication. Here, our studies confirm the important role of UNG2 for the control of the mutation rate in the newly synthesized viral DNA by a mechanism independent of its enzymatic activity but dependent to determinants located in the N-terminal domain that is involved in the recruitment of the p32 subunit of the RPA (Replication Protein A) complex (RPA32). First we showed that viruses produced in UNG2 or RPA32 depleted cells present a defect of infectivity and that the reverse transcription step is impaired during the course of infection of these viruses. Then we reported that the Vpr protein is able to form a trimolecular complex with UNG2 and RPA32 and we confirmed the importance of both UNG2 and RPA32 for optimal virus replication in a T cell line as well as in HIV-1 primary target cells. Even though macrophages and PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells), target cells of HIV-1, express low level of UNG2 and RPA32, these cellular proteins seem to be required for an efficient viral DNA synthesis leading to an optimal virus replication in primary cells. All these results suggest that Vpr controls the reverse transcription step through the recruitment of two cellular proteins UNG2 and RPA32 which allow the efficient dissemination of HIV-1 in the primary target cells.

La protéine auxiliaire Vpr du VIH-1 est exprimée tardivement au cours de la réplication virale. Toutefois, du fait de son encapsidation dans les particules virales, elle joue un rôle important dès les étapes initiales du cycle de réplication viral. Cette protéine de 96 acides aminés intervient en effet au cours de la rétrotranscription du génome viral puis de la translocation de l’ADN viral vers le noyau de la cellule hôte. Parallèlement, elle provoque un arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose des lymphocytes T infectés. Alors qu’il a été établi que Vpr participait au contrôle de la fidélité de la rétrotranscription via le recrutement au sein des particules virales de l’uracile DNA glycosylase 2 (UNG2), enzyme impliquée dans les processus de réparation de l’ADN, certaines études ont ensuite remis en question l’impact positif de l’encapsidation de l’UNG2 sur la réplication virale. Les travaux présentés ici permettent de confirmer le rôle de l’UNG2 dans le contrôle du taux de mutations au sein de l’ADN synthétisé à partir de l'ARN viral par un mécanisme indépendant de son activité enzymatique, mais lié à des déterminants situés dans la partie N-terminale de la protéine engagée dans le recrutement de la sous-unité p32 du complexe RPA (Replication protein A) (RPA32). Nous avons montré, dans un premier temps, que la production de virus dans des cellules dont les niveaux d'expression de l'UNG2 et de RPA32 étaient diminués se traduisait par une réduction significative du pouvoir infectieux des particules virales et de la synthèse de l’ADN viral. Nous avons ensuite montré que la protéine Vpr est capable de former un complexe tri-moléculaire avec les protéines UNG2 et RPA32, et confirmé l’importance de ces deux protéines cellulaires pour permettre une réplication virale optimale aussi bien dans des lignées cellulaires T que dans les cellules primaires cibles du VIH-1. Même si les macrophages et les PBMCs (cellules mononucléaires du sang périphérique), cellules cibles du VIH-1, expriment des niveaux faibles d’UNG2 et de RPA32, ces protéines cellulaires semblent requises pour permettre une synthèse d'ADN virale suffisante à la réplication optimale du virus dans ces cellules primaires. L’ensemble de ces résultats suggère que le contrôle de la rétrotranscription par Vpr a lieu via le recrutement de deux protéines cellulaires UNG2 et RPA32 permettant la dissémination efficace du VIH-1 dans les cellules cibles primaires. / The HIV-1 auxiliary protein Vpr is expressed during the late steps of the viral replication. However, Vpr is incorporated into HIV-1 viral particles and plays a key role during the initial steps of the viral replication cycle. This 96 amino acids protein is involved in viral genome reverse transcription as well as in viral DNA translocation into the nucleus of the host cell. In parallel, Vpr provokes cell cycle arrest and apoptosis of infected T cells. Previously, it has been well established that Vpr participates in the control of the fidelity of the reverse transcription through the recruitment of the Uracil DNA Glycosylase 2 (UNG2) into the viral particles. UNG2 is an enzyme involved in different DNA repair pathway. However some studies have challenged the positive impact of UNG2 encapsidation for HIV-1 replication. Here, our studies confirm the important role of UNG2 for the control of the mutation rate in the newly synthesized viral DNA by a mechanism independent of its enzymatic activity but dependent to determinants located in the N-terminal domain that is involved in the recruitment of the p32 subunit of the RPA (Replication Protein A) complex (RPA32). First we showed that viruses produced in UNG2 or RPA32 depleted cells present a defect of infectivity and that the reverse transcription step is impaired during the course of infection of these viruses. Then we reported that the Vpr protein is able to form a trimolecular complex with UNG2 and RPA32 and we confirmed the importance of both UNG2 and RPA32 for optimal virus replication in a T cell line as well as in HIV-1 primary target cells. Even though macrophages and PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells), target cells of HIV-1, express low level of UNG2 and RPA32, these cellular proteins seem to be required for an efficient viral DNA synthesis leading to an optimal virus replication in primary cells. All these results suggest that Vpr controls the reverse transcription step through the recruitment of two cellular proteins UNG2 and RPA32 which allow the efficient dissemination of HIV-1 in the primary target cells.