Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2005. / Titre de l'écran-titre (visionné le 28 septembre 2005). Bibliogr.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2002. / Bibliogr.: f. 175-184. Publié aussi en version électronique.

L'objectif de cette thèse est, dans un premier temps, d'étudier la génération d'ultraviolets dans les fibres microstructurées par mélange à quatre ondes d'une pompe à 532 nm, en particulier en fonction des fluctuations des propriétés de dispersion dues au procédé de fabrication et en explorant différents régimes de pompage; puis, dans un second temps, le développement d'une méthode versatile de caractérisation du contenu modal. Nous utiliserons le calcul différentiel stochastique pour représenter l'espérance du gain obtenu par mélange à quatre ondes en fonction des fluctuations. Ensuite, de nouveaux schémas de pompages sont étudiés pour générer des UV avec une grand qualité de faisceau. Dans le cadre de l'étude des perturbations du procédé de fabrication, nous avons confirmé que l'invariance de l'accord de phase en fonction des fluctuations d'échelle permet d'obtenir un gain maximum en ces points, et ce même si les fréquences générées sont situées très loin de la pompe.En ce qui concerne la génération d'UV proprement dite, nous avons isolé un schéma de pompage qui consiste à distribuer la pompe sur deux modes d'une fibre microstructurée et d'exploiter l'accord de phase obtenu pour la dispersion de pompe moyenne entre les deux modes. Ce processus permet, comme nous l'avons confirmé expérimentalement, de générer des UV dans le mode fondamental. Enfin, le développement d'une méthode d'analyse statistique multivariée de l'interférence entre les modes a permis de séparer tous les battements inter-modaux et de reconstruire les enveloppes de champ et la distribution modale de puissance, et ce, sans faire appel à aucune des hypothèses propres aux méthodes existantes. / The main objective of this thesis is, firstly, to study the generation of ultraviolet light in photonic crystal fibers through four-wave mixing of a 532 nm pump, in particular in the presence of dispersion fluctuations due to the fabrication process and by exploring different pumping schemes; secondly, the aim was to develop a versatile analysis method of the modal content of multimode fibers.We used stochastic calculus to model the expected gain value of four-wave mixing as a function of the fluctuations of the fiber drawing process. Furthermore, alternative pumping schemes were studied to aim at producing high-quality UV beams.While studying the impact of stochastic fluctuations of the fiber drawing process, we confirmed that phase-matching points showing an invariance with respect to scale fluctuations should indeed provide maximum gain at that point, even for very large frequency detunings with respect to the pump. Concerning the generation of UV light with very high beam quality, we have isolated a pumping scheme in which the pump is split across two spatial modes of a photonic crystal fiber and take advantage of the phase-matching condition of the averaged pump dispersion of the two pump modes. We have shown experimentally that this process can produce ultraviolet light in the fundamental mode. Finally, the elaboration of an advanced multivariate statistical analysis method applied to inter-modal interference allowed one to separate, in a semi-automatic fashion, all the interferences and reconstruct the mode envelopes and modal power distribution without any of the hypotheses required by other methods.

L'exposition aux rayons ultraviolets (UV) est essentielle à la vie et bénéfique pour la santé humaine. Cependant, la surexposition aux UV solaires, en particulier aux UVB, rayons les plus énergétiques atteignant la surface terrestre, peut entrainer des cancers de la peau chez l'être-humain comme les cancers de la peau de type non-mélanome (NMSC). La capacité des UVB à initier des NMSC provient principalement de leurs habilités à causer des dommages directs à l'ADN, tels que les dimères cyclobutyliques de pyrimidine (CPD) et les produits pyrimidine-pyrimidone (6-4PP), qui sont pris en charge par le mécanisme de réparation par excision de nucléotide (NER). L'incidence croissante de NMSC chez les patients déficients pour l'une des protéines de la NER souligne l'importance d'un processus fonctionnel. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la NER permettrait de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour la prévention ou le traitement des cancers de la peau. L'une des premières réponses cellulaires aux dommages CPD/6-4PP induits par UVB dans la peau des mammifères est l'activation de l'enzyme nucléaire poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP1) qui catalyse la formation de polymères d'ADP-ribose. Les précédents travaux de notre laboratoire et d'autres équipes ont démontré que PARP1 et son activité enzymatique facilitent la NER en collaboration avec la protéine UV-damaged DNA binding protein 2 (DDB2), qui va aussi s'accumuler rapidement aux sites CPD/6-4PP pendant la phase de reconnaissance des dommages à l'ADN de la NER. Cependant, plusieurs aspects des interactions de PARP1 avec DDB2 et avec les dommages directs à l'ADN sont inconnus. Ainsi, le premier objectif de mon projet de doctorat a été de caractériser précisément la nature de la liaison de PARP1 aux dommages CPD/6-4PP induits par UV vis-à-vis la protéine DDB2. Mes recherches ont mis en évidence l'empreinte asymétrique formée par PARP1 de -12 à +9 nucléotides de chaque côté des dommages CPD/6-4PP en présence ou en absence de DDB2. Nous avons également démontré que PARP1 augmente l'affinité de DDB2 pour les dommages CPD/6-4PP. De plus, les résultats de notre étude indiquent un rôle de PARP1 indépendant de DDB2 pendant la phase de reconnaissance des dommages à l'ADN. Cibler PARP1 et son rôle dans les voies de réparation des dommages à l'ADN est l'une des stratégies les plus efficaces développées ces dernières années pour le traitement des cancers des ovaires et du sein. L'application translationnelle de mon projet de doctorat a alors été de comprendre le rôle de PARP1 dans la NER dans le contexte des NMSC. À cet égard, nous avons développé un modèle PARP1-KO dans la lignée de souris SKH-1, qui est un modèle largement adopté pour étudier les NMSC induits par UVB. Puisque les souris SKH-1 développent principalement des carcinomes spinocellulaires (CSC) cutanés après une exposition chronique aux UVB, notre étude rapporte le rôle de PARP1 dans le développement des CSC. En utilisant les souris nouvellement créées SKH-1 PARP1-KO et les souris SKH-1 PARP1-WT avec ou sans application topique d'inhibiteurs de PARP, nous avons mis en évidence que l'absence de PARP1 ou de son activité dans la peau des souris SKH-1 mâles et femelles réduit significativement le fardeau tumoral des CSC et prolonge la période de latence du développement tumoral. L'étude hebdomadaire de l'apparition et de la croissance de tumeurs tout au long du protocole révèlent aussi que cibler PARP1 est très efficace pour ralentir, à l'étape pré-maligne, le développement de CSC. Nos résultats sont surprenants à la lumière des propriétés onco-suppressives rapportées de PARP1 et de son activité catalytique dans des cas de cancérogenèse induits par des dommages à l'ADN causés par des agents alkylants, ainsi que de la susceptibilité croissante des souris knock-out pour d'autres protéines de la NER à développer des CSC induits par UVB. Le rôle de PARP1 dans les mécanismes cellulaires induits par UVB autres que la NER, comme la mort cellulaire et les modulations immunes, pourrait expliquer nos observations. Alors que d'autres analyses sont nécessaires pour comprendre le rôle de PARP1 dans ces mécanismes, notre étude met en avant l'utilisation potentielle d'inhibiteurs de PARP comme nouvel agent chimiopréventif contre les CSC induits par UVB. / The exposure to solar ultraviolet radiation (UV) is essential to life and beneficial to human health. However, an overexposure to terrestrial solar UV, especially its most energetic component UVB, can cause skin cancers including the non-melanoma skin cancers (NMSC) in humans. The NMSC initiating properties of UVB arise predominantly from their ability to cause direct DNA damage such as cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) and 6-4photoproducts (6-4PP), which are repaired via nucleotide excision repair (NER) pathway. The increased incidence of NMSC in patients with hereditary defects in NER pathway proteins underscores the importance of efficient NER in humans. Therefore, detailed understanding of the molecular operation of NER pathway can provide novel therapeutic targets for the prevention or treatment of skin cancers. One of the earliest responses of the mammalian skin cells to UVB-induced CPD or 6-4PP is the activation of the nuclear enzyme poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1), which catalyzes the formation of polymers of ADP-ribose (PAR). The previous work from other teams and our laboratory have shown that PARP1 and its enzymatic activity facilitate NER in collaboration with UV-damaged DNA binding protein 2 (DDB2), which also rapidly accumulates at the CPD/6-4PP site during the DNA damage recognition stage of NER. However, many aspects of interaction of PARP1 with DDB2 and direct DNA damage are not understood. Therefore, the first aim of my doctoral project was to characterize the precise nature of binding of PARP1 vis-à-vis DDB2 at UV-induced CPD/6-4PP. My doctoral research demonstrates that PARP1 casts asymmetric footprint from −12 to +9 nucleotides on either side of the CPD/6-4PP in presence or absence of DDB2. We also demonstrated that PARP1 facilitates the binding of DDB2 to CPD/6-4PP. Moreover, our study reports DDB2-independent role of PARP1 during the DNA damage recognition phase in NER. Targeting the role of PARP1 in DNA strand break repair pathways has emerged as one of the successful strategies for the treatment of ovarian and breast cancers in last decade. Consequently, the ultimate translational goal of my doctoral project was to understand the implication of NER facilitating role of PARP1 in NMSC. In this regard, we first developed a PARP1-KO model in the albino hairless SKH-1 mouse strain, which is a widely adopted mouse model to study UVB-induced NMSC. Since SKH-1 mice mainly develop cutaneous squamous cell carcinoma (SCC) upon chronic UVB-exposure, our present study reports the role of PARP1 in development of SCC. Using the newly developed PARP1-KO and PARP1-WT SKH-1 mice with or without topical application of PARP inhibitor, we report that the absence of PARP1 or its activity in skin of both male and female SKH-1 mice significantly reduces the SCC tumor burden and prolongs the tumor latency period. The analyses of appearance and growth of individual tumors on a weekly basis during this protocol also revealed that targeting of PARP1 was most effective in suppressing the premalignant stage of the SCC development. Our results are surprising in light of the reported onco-suppressive property of PARP1 and its catalytic activity in alkylating DNA damage-induced tumorigenesis and the increased susceptibility of other NER protein knock-out mice to UVB-induced SCC. We reason that the roles of PARP1 in UVB-induced cellular processes other than NER, such as cell death and immune modulations, can account for our observation. While further studies are required to understand these roles of PARP1 in UVB-induced cellular processes, our study underscores the potential for use of PARP inhibitors as a novel chemopreventive agents against UVB-induced SCC.

Le mélanome est le cancer de la peau le plus mortel et l’exposition solaire est le facteur étiologique ayant la plus grande incidence sur son initiation. Cependant, l’influence des rayons UV sur la progression du mélanome primaire vers un état métastatique reste inconnue. Notre hypothèse est que les rayons UV peuvent, en plus d’initier la tumeur, stimuler la progression de la maladie vers un état métastatique. L’objectif de cette étude était donc de déterminer les conditions d’irradiation à utiliser, puis d’évaluer les effets directs et indirects des rayons UV sur la migration du mélanome. Les lignées A375, WM983a et SK-MEL-28 ont été cultivés sous forme de sphéroïdes et traitées chroniquement aux rayons UV directement ou indirectement. Puis, leur migration a été évaluée dans deux modèles 3D, soit en gel de collagène I ou en chambre de Boyd en inversée. L’exposition directe des sphéroïdes était constituée de5 minutes d’irradiation (570J/m2) au simulateur solaire tous les 12h pendant 7 jours. Aucune différence significative de migration des cellules cancéreuses n’a pu être observée dans cette condition. Pour l’exposition indirecte, les sphéroïdes ont été mis en contact avec un milieu de culture de kératinocytes immortalisés (HaCaT)ayant été préalablement irradiés de façon chronique aux UVB avec une dose de 75J/m2 tous les 12h pour un total de quinze irradiations (CLUV). Une augmentation significative de la migration des cellules cancéreuses dans le milieu CLUV a été observée pour les sphéroïdes de WM983a et SK-MEL-28. Le profilage des cytokines présentes dans le milieu CLUV a révélé un enrichissement de nombreuses cytokines tel que PDGFaa. En conclusion, le milieu CLUV augmente le potentiel de migration des trois lignées de mélanome primaire. Ainsi, l’exposition chronique aux rayons UV pourrait donc indirectement induire un plus grand pouvoir métastatique via notamment l’action de cytokines surexprimées.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / L'utilisation des revêtements photopolymérisables cent pourcent solides est l'une des méthodes les plus couramment utilisées pour protéger les produits finaux du bois des rayures, de l'abrasion et des attaques chimiques, tout en créant également l'apparence souhaitée en matière de brillance. L'une des façons de contrôler la brillance de la surface du revêtement est de créer une rugosité de surface en ajoutant des particules solides à la composition du revêtement. En raison de l'absence de composés organiques volatils (COV) dans la composition du revêtement à durcissement UV 100% solides, la présence d'agents de matage à la surface du revêtement est réduite et, par conséquent, leur effet sur la création de la rugosité diminue. Il est donc essentiel de trouver un type d'agents de matage approprié ainsi qu'une méthode efficace de création de rugosité. Cette étude a examiné les particules magnétiques en tant que nouveau type d'agent de matage dans la formulation du revêtement à durcissement UV et par exposition à un champ magnétique externe. Les particules ont été soumises à des modifications afin de garantir leur bonne dispersion au sein de la formulation. Par conséquent, les particules d'oxyde de fer (Fe₃O₄) enrobées de polymère et les particules de pentacarbonyle de fer (Fe(CO)₅) ont été modifiées avec un l'aminosilane (APTES) avant d'être ajoutées à la formulation du revêtement. Cette recherche a étudié l'effet combiné de l'ajout de particules magnétiques et de l'application d'un champ magnétique pendant la polymérisation UV sur la brillance de la surface du revêtement, en raison de la création de particules magnétiques assemblées sous l'effet du champ magnétique. La brillance de la surface a été caractérisée à l'aide d'un brillancemètre, et la rugosité de la surface a été mesurée à l'aide d'images 3D prises par le microscope numérique Keyence. De plus, dans cette étude, l'impact de la nature des particules, de leur concentration et de leur méthode de modification, ainsi que l'effet des paramètres du champ magnétique, y compris son type et sa puissance, sur la brillance finale de la surface et l'uniformité de la surface finale ont été évalués. / One hundred percent solids ultraviolet-curable coating is one of the most used methods to protect final wood products from scratches, abrasion, and chemical attacks and also to create a desired appearance in terms of gloss. One of the ways to control the coating's surface gloss is to create surface roughness by adding solid particles to the coating composition. Due to the absence of volatile organic compounds (VOC) in 100% solids UV-curable coating composition, the presence of matting agent at the coating surface is reduced and hence, their effect on the creation of roughness diminishes. Therefore, finding a suitable matting agent type and efficient roughness creation method is essential. This study investigated magnetic particles as a new matting agent type in the UV-curable coating formulation to be photo-polymerized under an external magnetic field. The particles required modification to ensure their proper dispersion within the formulation. Therefore, the polymer-coated iron oxide (Fe₃O₄) particles and iron pentacarbonyl (Fe(CO)₅) particles were modified with aminosilane (APTES) before being added to the coating formulation. This research investigated the combined effect of adding magnetic particles and applying magnetic field during UV-curing on the coating's surface gloss due creating self-assembled magnetic particles under magnetic field. The surface gloss was characterized through glossmeter, and the surface roughness was measured by 3D images taken using a Keyence digital microscope. Moreover, in this study, the impact of particles' nature, concentration, modification method, and the effect of magnetic field parameters, including its type and strength, on the final surface gloss and the uniformity of the final surface have been assessed.

Les rayons ultraviolets (UV) sont les principaux responsables de l’initiation des cancers cutanée, car ils induisent différents dommages à l’ADN, dont les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPD). Ces dommages sont principalement induits par les UVB et sont responsables de la formation des mutations trouvées les cancers cutanés non mélanocytiques. Nos résultats ont démontré qu’une irradiation chronique à de faibles doses de rayons UVB (CLUV) induit la formation de CPD, qui persistent dans le temps. Ces dommages résiduels s’accumulent dans le génome et ne semblent pas être réparés. Nous nous sommes donc intéressés à ces dommages résiduels et à leur impact dans le génome. Premièrement, la distribution post-irradiation des CPD résiduels a été observée pour des fibroblastes dermiques humains soumis à une irradiation CLUV (75 J/m² aux 12h, durant 7,5 jours). Ces analyses ont démontré que les CPD résiduels sont tolérés et dilués dans le génome lors des divisions cellulaires. Deuxièmement, la localisation des CPD résiduels a été observée pour les cellules irradiées avec une CLUV et pour les cellules irradiées avec une dose unique et aigüe (400 J/m²). La quantification des CPD résiduels a permis d’observer que pour les cellules irradiées avec une CLUV, environ deux fois plus de CPD résiduels sont présents dans l’hétérochromatine par rapport à l’euchromatine. Pour les cellules irradiées avec une dose aigüe, les CPD sont répartis également entre les deux fractions de la chromatine. Ces résultats suggèrent que l’état de compaction de la chromatine a un impact sur l’accumulation et la réparation des CPD. Troisièmement, la fréquence de chaque type dipyrimidinique de CPD résiduels a été déterminée par la technique de LC-MS/MS. Une proportion plus faible de CPD contenant des cytosines a été observée dans les cellules irradiées avec la CLUV par rapport aux cellules irradiées avec la dose aigüe. De plus, l’analyse a démontré que les photoproduit de pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4 PP) étaient presque complètement absents des dommages résiduels. Finalement, afin d’observer l’impact des CPD résiduels sur la stabilité génomique, la quantité d’échanges de chromatides sœurs (SCE) a été comparée pour les cellules irradiées par la CLUV et les cellules non irradiées. La quantité de SCE observée était plus élevée dans les cellules irradiées que dans les cellules non irradiées. Globalement, nous avons observés que les CPD résiduels, majoritairement de type TT, s’accumulent principalement dans l’hétérochromatine, où ils sont tolérés. Ces dommages sont dilués dans le génome au fil des divisions cellulaires, en causant une augmentation de l’instabilité génomique. Globalement, mon projet a permis de mieux comprendre l’impact des CPD résiduels induits par une irradiation chronique dans l’initiation de la cancérogenèse cutanée. / Ultraviolet (UV) rays are known to be the main initiator of skin cancer, as they induce different types of DNA damage, including cyclobutane pyrimidine dimers (CPD). CPD are mostly produced by UVB rays and are the predominant premutagenic DNA damage responsible for non-melanoma skin cancers. While most CPD are repaired by the nucleotide excision repair (NER) pathway, some remain unrepaired and persist in the genome. We recently observed those residual CPD after exposure of human fibroblasts cells to chronic low dose of UVB (CLUV). Then, we aimed to observe the distribution of residual CPD occurring in dividing cells submitted to CLUV irradiation. Human dermal fibroblasts were irradiated with CLUV (75 J/m² every 12h for 7.5 days). Our results showed that residual CPD are tolerated and diluted in the genome by DNA replication. Then, localization of CLUV-induced residual CPD was observed and compared with residual CPD induced by a single and acute UVB irradiation (400 J/m²). Euchromatin and heterochromatin fraction were isolated and the amount of CPD was quantified in each fraction. The quantification showed that residual CPD accumulate mostly in the heterochromatin fraction of the genome, where the amount of CPD was two times greater than in the euchromatin. This suggests that DNA compaction has an impact on CPD accumulation and repair. Then, we measured the frequency of the different types of residual CPD by LC-MS/MS technique. A lower proportion of cytosine containing CPD was found in CLUV irradiated cells than in acute irradiated cells. The quantification of the different types of 6-4 photoproducts (6-4 PP) demonstrated that they were almost all absent after a CLUV irradiation, in the residual damage. Finally, genomic instability was investigated in CLUV irradiated cells by measuring the amount of SCE induced after the irradiation. A higher number of SCE was observed in CLUV-irradiated cells than in control cells, suggesting that residual CPD are responsible for an increase of genomic instability. Overall, we observed that residual CPD, mostly TT-CPD, accumulate in the heterochromatin where they are tolerated. These CPD are diluted during cellular division but they are causing genomic instability. Finally, my project aimed to characterise residual CPD induced by chronic irradiation and to gain more knowledge on their impact in skin carcinogenesis initiation.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2017-2018 / La poly(ADP-ribose) polymérase 1 (PARP1) est une enzyme nucléaire très abondante chez les eucaryotes supérieurs, humains compris, mais néanmoins absente chez les bactéries et les levures. En réponse aux dommages à l’ADN, elle utilise le substrat nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) pour former des polymères d’ADP-ribose (PAR) sur elle-même et sur d’autres protéines cibles. L’enzyme PARP1 et son activité catalytique sont impliquées dans la réparation des dommages à l’ADN contenant des cassures simple et double brin. Cependant, l’hypothèse que l’enzyme PARP1 joue un rôle dans la réparation de dommages sans cassures de brin a toujours rencontré des réticences. Par exemple, la PARP1 est activée rapidement par ces dommages, comme ceux induits par les radiations ultraviolettes (UV), mais son rôle dans leur réparation par excision de nucléotides (NER) n’était pas accepté généralement. Ainsi, ce projet de doctorat consiste à déterminer le mécanisme exact par lequel la PARP1 et son activité catalytique contribuent à la NER. Cette voie de réparation utilise plus de 30 protéines pour réparer une très grande variété de dommages. Bien que nous ayons une bonne connaissance des étapes de la NER grâce aux études in vitro chez les bactéries et les levures, les facteurs qui influencent le fonctionnement de la NER chez les eucaryotes supérieurs ne sont pas tous connus. Cependant, de récentes études ont montré que des complexes de remodelage de la chromatine et des modifications post-traductionnelles facilitent la NER dans la chromatine. Dans ce contexte, l’implication de la modification posttraductionnelle effectuée par la PARP1, dite PARylation, est encore inconnue dans la NER. Dans la NER, l’étape cruciale de la réparation globale du génome est la reconnaissance des quelques bases endommagées qui sont entourées de nombreuses bases non modifiées par la protéine «Xeroderma pigmentosum C» (XPC). Un autre facteur clé de cette phase est le facteur «UV-damaged DNA binding protein 2» (DDB2) qui fait partie du complexe ubiquitine-ligase UV-DDB. Ici, nous avons démontré que, après irradiation aux UVC, la PARP1 se lie asymétriquement à la photolésion et elle interagit avec le facteur DDB2. Ce dernier stimule l’activité catalytique de la PARP1 et est à son tour PARylé par la PARP1. Les polymères formés autour de la photolésion agissent comme signal de recrutement pour le complexe PARP1-XPC déjà présent dans le nucléoplasme. La confluence de ces facteurs de réparation au site de dommage assure la séparation de la protéine XPC de ce complexe suivi de son transfert et de sa stabilisation autour du dommage. Ainsi, la PARP1 n'est pas seulement l'une des premières protéines recrutées aux lésions induites par les UV, mais son activation rapide par ces dommages joue un rôle clé dans les étapes situées en aval de la phase de reconnaissance des dommages de la NER. En effet, nous avons montré que l’inhibition ou la déplétion de la PARP1 ralentit radicalement la réparation par la NER des dommages directs induits à l’ADN par les UV. Cette étude montre que la PARP1, en coopération avec les protéines DDB2 et XPC augmente l’efficacité de la voie NER dans les cellules des mammifères. / Poly(ADP-ribose) polymerase 1 (PARP1) is a highly abundant nuclear enzyme which is present in higher eukaryotes but absent in bacteria and yeasts. In response to DNA damage, it uses the nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to form polymers of ADPribose (PAR) on itself and other target proteins. PARP1 and its catalytic activity are involved in the repair of DNA damages comprising of single and double strand breaks. However, the role of PARP1 in repairing DNA damage without strand breaks has not been readily accepted. For example, although PARP1 is rapidly activated in response to such damages caused by ultraviolet radiation (UV), its role in their repair by nucleotide excision repair pathway (NER) was not generally recognized. Thus, the project of my doctoral work is to determine the exact mechanism by which PARP1 and its catalytic activity influence NER. This pathway uses more than 30 proteins to repair a wide variety of DNA damages. Although we have a good understanding of NER steps through studies in vitro, bacteria and yeasts, we still do not know all the factors that influence the functioning of the NER in higher eukaryotes including humans. Recent studies have shown that chromatin remodelling complexes and post-translational modifications facilitate NER in the context of chromatin. However, the contribution of PARylation, the post-translational modification carried out by PARP1, in NER remains largely unknown. Xeroderma pigmentosum C protein (XPC) plays a crucial role in NER by recognizing the few UV induced lesions in the vast undamaged chromatin. Another key factor in damage recognition is the UV- damaged DNA binding protein (DDB2), which is part of the UV-DDB ubiquitin-ligase complex. Here, we have demonstrated that after UVC irradiation, PARP1 binds asymmetrically to the photolesions and interacts with DDB2. DDB2 stimulates the catalytic activity of PARP1 and in turn it is PARylated. The polymers formed around the photolesion act as recruitment signal for the PARP1-XPC complex already present in the nucleoplasm. The confluence of these repair factors at the damage site ensures the separation of the XPC protein from its complex with PARP1 followed by its transfer and stabilization at the site of damage. Thus, PARP1 is not only one of the first proteins to respond to UV induced DNA damage, but also its early rapid activation plays a key role in the downstream events of NER. Indeed, we have shown that both inhibition and depletion of PARP1 significantly delays the repair of these lesions. This study demonstrates that PARP1 increases the efficiency of NER in cooperation with the DDB2 and XPC proteins in mammalian cells.

La lumière solaire constitue le principal facteur de risque des cancers de peau non mélanocytaires (NMSC). L'effet génotoxique de la lumière solaire est dû aux dommages dans l'ADN induits par les rayonnements ultraviolets (UV). Les rayons UVB longs (290-315 nm) sont les principaux responsables de l'initiation et de la promotion des NMSC qui prennent naissance dans les kératinocytes épidermiques. En effet, l’absorption directe des photons d’UVB par l’ADN conduit à la génération de deux principaux types de dommages, les dimères cyclobutyliques de pyrimidines (CPD) et les photoproduits de pyrimidine (6-4) pyrimidone (6-4PP). Les CPD sont les plus abondants et sont hautement mutagènes. Ils sont responsables des mutations de transitions C → T au niveau des sites dipyrimidiniques, les mutations signatures observées dans les cancers de peau. Les cellules possèdent différents mécanismes pour éviter la conversion des CPD en mutations, à savoir, l’arrêt du cycle cellulaire, la réparation des dommages dans l'ADN par le système de réparation par excision de nucléotides (NER) et la mort cellulaire par apoptose. L’importance de la NER dans la prévention des cancers de peau est bien démontrée par le fait qu’une déficience en protéines de la NER, comme chez les patients atteints de Xeroderma Pigmentosum (XP), entraîne une incidence jusqu’à 2000 fois plus élevée de cancers de peau. De nombreux facteurs influencent la NER et une meilleure compréhension de ces derniers pourrait conduire au développement de nouvelles stratégies de prévention contre les cancers de peau. La peau est un assemblage complexe de cellules et de matrice dans lequel la communication entre les composants épidermiques et dermiques est essentielle pour de nombreux mécanismes cutanés. En utilisant des peaux reconstruites dérivées uniquement de fibroblastes et de kératinocytes primaires humains, nous avons analysé l’impact des composants dermiques sur l’efficacité de réparation des CPD épidermiques. Nous avons montré que l’élimination des CPD dans les kératinocytes est positivement influencée par la présence d'un derme et nous avons déterminé que cet effet du derme sur les kératinocytes proviendrait de molécules sécrétées. En étudiant le sécrétome, nous avons découvert que la cytokine CXCL5 (ou ENA78 - Epithelial neutrophil-activating peptide 78) possède un patron d'expression unique : elle est pratiquement absente du milieu de culture des peaux reconstruites, comparativement au milieu de culture de fibroblastes et de kératinocytes seuls. En modulant les niveaux de CXCL5 dans les milieux de culture de kératinocytes, nous avons montré que CXCL5 était un inhibiteur de la réparation des CPD. Cette première étude décrit l'impact des molécules sécrétées par le derme sur la réparation iii des CPD épidermiques et met en lumière un nouveau rôle de CXCL5 dans la réparation des dommages induits par les rayons UV. L’environnement immédiat des kératinocytes n’est pas le seul facteur qui peut influencer la réparation des CPD, le régime d’irradiation a également un impact sur cette efficacité d’élimination des lésions. Jusqu’à présent, l'efficacité de la NER a été largement étudiée après une seule exposition aiguë aux rayons UV. Cependant, l'utilisation d’une irradiation unique n'est pas représentative de l'exposition solaire humaine, qui est plutôt constituée d’une multitude d'irradiations répétées. Dans ce travail, nous avons donc exposé des cellules épidermiques à un régime d’irradiation chronique composé de faibles doses d’UVB (CLUV) afin de déterminer l’impact de cette irradiation sur la réparation NER. Nous avons montré que le traitement CLUV entraîne l’accumulation de CPD résiduels, qui ne sont pas réparés mais plutôt tolérés et dilués lors de la réplication de l’ADN. Nous avons également constaté que le prétraitement CLUV réduisait la capacité d'élimination des nouveaux dommages sans induire de sensibilité accrue à la mort cellulaire. Enfin, en utilisant nos données expérimentales, nous avons élaboré un modèle théorique pour prédire l’induction, la dilution et la réparation des CPD épidermiques lors d’une irradiation chronique aux rayons UVB. Nos résultats montrant que les kératinocytes accumulent des dommages dans l'ADN après des irradiations chroniques, constituent un facteur important à prendre en compte, car l'accumulation de CPD non réparés pourrait entraîner une augmentation des mutations dans les kératinocytes. Dans l’ensemble, ces travaux soulignent l’importance d’utiliser des modèles plus complexes, visant une meilleure représentation physiologique, pour mieux comprendre les réponses de la peau à l’exposition solaire. / Skin exposure to solar light is the main risk factor for non-melanoma skin cancers (NMSC). The genotoxic effect of sunlight is attributed to DNA damage induced by ultraviolet (UV) radiations. Long UVB wavelengths (290-315 nm) are the main responsible for NMSC initiation and promotion that occur in epidermal keratinocytes. Indeed, the direct absorption of UVB photons by DNA leads to the generation of the two main types of UV-induced DNA damage, i.e. cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) and (6-4) pyrimidine-pyrimidone photoproducts (6-4PP). CPD are the most abundant and are highly mutagenic. They are responsible for the C → T transition mutations at dipyrimidine sites, the signature mutation found in sun-related skin cancers. Skin cells use different mechanisms to avoid the conversion of UVB-induced CPD into skin cancer driver mutations, i.e. cell cycle arrest, DNA damage removal by nucleotide excision repair (NER) pathway and cell death by apoptosis. The importance of NER for skin cancer prevention is well demonstrated by the fact that a deficiency in NER proteins, such as in Xeroderma Pigmentosum (XP) patients, leads to an increase of up to 2,000-fold in skin cancer occurrence. Many factors influence NER and a better understanding of those factors might lead to new prevention strategies against skin cancer. Skin is a complex assembly of cells and matrix in which a crosstalk between epidermal and dermal components is essential for many cutaneous mechanisms. Using self-assembled tissue-engineered skin equivalents derived from human primary fibroblasts and keratinocytes, we have analyzed the impact of dermal components on epidermal CPD repair efficiency. We showed that CPD repair in keratinocytes is positively influenced by the presence of the dermis and we brought evidence that this dermal effect comes from secreted molecules. We then investigated the secretome and found that the cytokine CXCL5 (also known as ENA78 - Epithelial neutrophil-activating peptide 78) has a unique expression pattern, i.e. is virtually absent in the culture medium of reconstructed skin, when compared to the media from fibroblasts and keratinocytes alone. By modulating CXCL5 levels in keratinocytes culture medium, we have shown that CXCL5 is an inhibitor of CPD repair. This work outlines the impact of the secreted dermal components on epidermal UV-induced DNA damage repair and shed light on a novel role of CXCL5 in CPD repair. The immediate environment of the keratinocytes is not the only factor that can influence the CPD repair, the irradiation protocol also has an impact on this damage removal. Until now, v NER efficiency has been extensively studied after a single acute UVB exposure. However, the use of single UVB irradiation is not representative of the human solar exposure, which is rather a multitude of repeated irradiations than a single acute one. In this work, we thus exposed keratinocytes to a chronic low-dose of UVB (CLUV) protocol to determine the impact of this irradiation procedure on CPD removal. We showed that the CLUV treatment leads to the accumulation of residuals CPD. Those residual CPD are not repaired but rather tolerated and diluted through DNA replication. We also found that a CLUV pre-treatment reduces CPD removal rate of newly generated damage without inducing a higher sensitivity to UV-induced cell death. Finally, using our experimental data, we derived a theoretical model to predict CPD induction, dilution and repair that occur in keratinocytes when chronically irradiated with UVB. These results showing that keratinocytes accumulate DNA damage after chronic irradiations is an important factor to consider since the accumulation of unrepaired CPD might lead to an increase of skin cancer driver mutations formation. Taking together, this work outlines the importance of more relevant and physiological models to study the skin response to solar exposure.

L'exposition aux rayons ultraviolets (UV) est essentielle à la vie et bénéfique pour la santé humaine. Cependant, la surexposition aux UV solaires, en particulier aux UVB, rayons les plus énergétiques atteignant la surface terrestre, peut entrainer des cancers de la peau chez l'être-humain comme les cancers de la peau de type non-mélanome (NMSC). La capacité des UVB à initier des NMSC provient principalement de leurs habilités à causer des dommages directs à l'ADN, tels que les dimères cyclobutyliques de pyrimidine (CPD) et les produits pyrimidine-pyrimidone (6-4PP), qui sont pris en charge par le mécanisme de réparation par excision de nucléotide (NER). L'incidence croissante de NMSC chez les patients déficients pour l'une des protéines de la NER souligne l'importance d'un processus fonctionnel. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la NER permettrait de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques pour la prévention ou le traitement des cancers de la peau. L'une des premières réponses cellulaires aux dommages CPD/6-4PP induits par UVB dans la peau des mammifères est l'activation de l'enzyme nucléaire poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP1) qui catalyse la formation de polymères d'ADP-ribose. Les précédents travaux de notre laboratoire et d'autres équipes ont démontré que PARP1 et son activité enzymatique facilitent la NER en collaboration avec la protéine UV-damaged DNA binding protein 2 (DDB2), qui va aussi s'accumuler rapidement aux sites CPD/6-4PP pendant la phase de reconnaissance des dommages à l'ADN de la NER. Cependant, plusieurs aspects des interactions de PARP1 avec DDB2 et avec les dommages directs à l'ADN sont inconnus. Ainsi, le premier objectif de mon projet de doctorat a été de caractériser précisément la nature de la liaison de PARP1 aux dommages CPD/6-4PP induits par UV vis-à-vis la protéine DDB2. Mes recherches ont mis en évidence l'empreinte asymétrique formée par PARP1 de -12 à +9 nucléotides de chaque côté des dommages CPD/6-4PP en présence ou en absence de DDB2. Nous avons également démontré que PARP1 augmente l'affinité de DDB2 pour les dommages CPD/6-4PP. De plus, les résultats de notre étude indiquent un rôle de PARP1 indépendant de DDB2 pendant la phase de reconnaissance des dommages à l'ADN. Cibler PARP1 et son rôle dans les voies de réparation des dommages à l'ADN est l'une des stratégies les plus efficaces développées ces dernières années pour le traitement des cancers des ovaires et du sein. L'application translationnelle de mon projet de doctorat a alors été de comprendre le rôle de PARP1 dans la NER dans le contexte des NMSC. À cet égard, nous avons développé un modèle PARP1-KO dans la lignée de souris SKH-1, qui est un modèle largement adopté pour étudier les NMSC induits par UVB. Puisque les souris SKH-1 développent principalement des carcinomes spinocellulaires (CSC) cutanés après une exposition chronique aux UVB, notre étude rapporte le rôle de PARP1 dans le développement des CSC. En utilisant les souris nouvellement créées SKH-1 PARP1-KO et les souris SKH-1 PARP1-WT avec ou sans application topique d'inhibiteurs de PARP, nous avons mis en évidence que l'absence de PARP1 ou de son activité dans la peau des souris SKH-1 mâles et femelles réduit significativement le fardeau tumoral des CSC et prolonge la période de latence du développement tumoral. L'étude hebdomadaire de l'apparition et de la croissance de tumeurs tout au long du protocole révèlent aussi que cibler PARP1 est très efficace pour ralentir, à l'étape pré-maligne, le développement de CSC. Nos résultats sont surprenants à la lumière des propriétés onco-suppressives rapportées de PARP1 et de son activité catalytique dans des cas de cancérogenèse induits par des dommages à l'ADN causés par des agents alkylants, ainsi que de la susceptibilité croissante des souris knock-out pour d'autres protéines de la NER à développer des CSC induits par UVB. Le rôle de PARP1 dans les mécanismes cellulaires induits par UVB autres que la NER, comme la mort cellulaire et les modulations immunes, pourrait expliquer nos observations. Alors que d'autres analyses sont nécessaires pour comprendre le rôle de PARP1 dans ces mécanismes, notre étude met en avant l'utilisation potentielle d'inhibiteurs de PARP comme nouvel agent chimiopréventif contre les CSC induits par UVB. / The exposure to solar ultraviolet radiation (UV) is essential to life and beneficial to human health. However, an overexposure to terrestrial solar UV, especially its most energetic component UVB, can cause skin cancers including the non-melanoma skin cancers (NMSC) in humans. The NMSC initiating properties of UVB arise predominantly from their ability to cause direct DNA damage such as cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) and 6-4photoproducts (6-4PP), which are repaired via nucleotide excision repair (NER) pathway. The increased incidence of NMSC in patients with hereditary defects in NER pathway proteins underscores the importance of efficient NER in humans. Therefore, detailed understanding of the molecular operation of NER pathway can provide novel therapeutic targets for the prevention or treatment of skin cancers. One of the earliest responses of the mammalian skin cells to UVB-induced CPD or 6-4PP is the activation of the nuclear enzyme poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1), which catalyzes the formation of polymers of ADP-ribose (PAR). The previous work from other teams and our laboratory have shown that PARP1 and its enzymatic activity facilitate NER in collaboration with UV-damaged DNA binding protein 2 (DDB2), which also rapidly accumulates at the CPD/6-4PP site during the DNA damage recognition stage of NER. However, many aspects of interaction of PARP1 with DDB2 and direct DNA damage are not understood. Therefore, the first aim of my doctoral project was to characterize the precise nature of binding of PARP1 vis-à-vis DDB2 at UV-induced CPD/6-4PP. My doctoral research demonstrates that PARP1 casts asymmetric footprint from −12 to +9 nucleotides on either side of the CPD/6-4PP in presence or absence of DDB2. We also demonstrated that PARP1 facilitates the binding of DDB2 to CPD/6-4PP. Moreover, our study reports DDB2-independent role of PARP1 during the DNA damage recognition phase in NER. Targeting the role of PARP1 in DNA strand break repair pathways has emerged as one of the successful strategies for the treatment of ovarian and breast cancers in last decade. Consequently, the ultimate translational goal of my doctoral project was to understand the implication of NER facilitating role of PARP1 in NMSC. In this regard, we first developed a PARP1-KO model in the albino hairless SKH-1 mouse strain, which is a widely adopted mouse model to study UVB-induced NMSC. Since SKH-1 mice mainly develop cutaneous squamous cell carcinoma (SCC) upon chronic UVB-exposure, our present study reports the role of PARP1 in development of SCC. Using the newly developed PARP1-KO and PARP1-WT SKH-1 mice with or without topical application of PARP inhibitor, we report that the absence of PARP1 or its activity in skin of both male and female SKH-1 mice significantly reduces the SCC tumor burden and prolongs the tumor latency period. The analyses of appearance and growth of individual tumors on a weekly basis during this protocol also revealed that targeting of PARP1 was most effective in suppressing the premalignant stage of the SCC development. Our results are surprising in light of the reported onco-suppressive property of PARP1 and its catalytic activity in alkylating DNA damage-induced tumorigenesis and the increased susceptibility of other NER protein knock-out mice to UVB-induced SCC. We reason that the roles of PARP1 in UVB-induced cellular processes other than NER, such as cell death and immune modulations, can account for our observation. While further studies are required to understand these roles of PARP1 in UVB-induced cellular processes, our study underscores the potential for use of PARP inhibitors as a novel chemopreventive agents against UVB-induced SCC.