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Caracterização de um isolado de Bean rugose mosaic virus e busca por fontes de resistência em Phaseolus vulgaris / Characterization of an isolate of Bean rugose mosaic virus and search for sources of resistance in Phaseolus vulgarisCândida, Daniella Vieira 31 March 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017-03-31 / Abstract: In 2013, common bean plants of the cultivar Pérola were found in an experimental field belonging to Embrapa Arroz e Feijão Lat. 16 ° 28 '00 "(S); Long. 49 ° 17 '00 "(W); (GO) presenting leaf distortion, mosaic and blistering. The sample analysis by electron microscopy detected the presence of typical Comovirus genus viral particles, thus, the identification of the virus species through sequencing became essential and the search for control alternatives, due to the damage potential of Bean rugose mosaic virus (BRMV) to bean production fields. Therefore, the present work had as objectives: (1) the molecular characterization of BRMV-GO, an isolate from common bean and (2) the search for bean accessions resistant to this viral species. For germplasm selection, 172 accessions were analyzed by means of mechanical inoculation and visualization of symptoms at 5, 21 and 30 days after inoculation. The range of hosts was analyzed by inoculation of 15 typical indicator species. Soya plants (Cv. Savana, Cv. Cristalina, Cv. Doko and Cv. Conquista) and pea (Cv. Mikado and Cv. Triofin) were also analyzed for reactions to BRMV-GO. Leaves of the infected plants were used for detection of BRMV-GO through RT-PCR. Of the 172 analyzed accessions, 168 behaved as susceptible, 3 accessions: BGF0011750 (cv. Mulatinho), BGF0000880 (cv. Rico 23) and BGF0001083 (cv Rico 23) reacted to BRMV-GO with vein and petioles necrosis followed by death; 1 access, BGF0003174 cv. IPA5047, showed a hypersensitivity reaction. The two species of the indicator Chenopodium amaranticolor and C. quinoa reacted with local necrotic lesions and no systemic infection confirmed by RT-PCR. Soybean plants reacted as susceptible and all pea plants showed tip burning. For molecular characterization, complete genome sequencing was performed by Sanger method using the primer walking strategy, the 5 'and 3' ends were obtained by RACE method. Genome sizes were 5906 nucleotides with a 1856 amino acid polyprotein for RNA 1 and 3688 nucleotides with a polypeptide of 1096 amino acids for RNA 2. The nucleotide identity between BRMV-GO and BRMV-Paraná isolates was 92.7% for RNA 1 and 90.5% for RNA 2. The highest percentage of identity obtained by amino acids sequence
alignment of the polymerase (RdRp) and the capsid protein (CP) was 63% (RdRp) and 66% (CPs) with Bean pod mottle virus (BPMV), however, the ICTV delimits 80% (RdRp) and 75% (CP) identity to be part of the Comovirus genus, however, these results agree with the results obtained in another work with a Paraná isolate, corroborating that BRMV is a distinct species among this genus. Phylogenetic analysis of regions RdRp and CPs showed that BRMV-GO and BRMV-Paraná do not have significant differences and revealed higher indexes of identity with BPMV, both for RNA 1 and RNA 2. The complete sequences of RNA 1 and RNA 2 were deposited on Genbank under accession numbers KY622124, KY622125, respectively. / Resumo: Em 2013, plantas de feijão-comum da cultivar Pérola foram observadas em um campo experimental da Embrapa Arroz e Feijão Lat. 16° 28’ 00”(S); Long. 49° 17’ 00”(W); (GO) apresentando deformação foliar, mosaico em desenho e bolhosidade. A análise das amostras por microscopia eletrônica detectou a presença de partículas virais típicas do gênero Comovirus, sendo assim necessária a identificação da espécie do vírus através de sequenciamento e a busca por alternativas para o controle, devido ao potencial de dano da espécie Bean rugose mosaic virus (BRMV) para a cultura do feijão. Por isso, o presente trabalho teve como objetivos: (1) a
caracterização molecular do isolado BRMV-GO, proveniente de feijoeiro e (2) a busca por acessos de feijoeiro resistentes à essa espécie viral. Para a seleção de germoplasma, 172 acessos foram analisados por meio de inoculação mecânica e visualização dos sintomas aos 5, 21 e 30 dias após a inoculação. A gama de hospedeiras foi analisada mediante inoculação de 15 espécies indicadoras típicas. Plantas de soja (cv. Savana, cv. Cristalina, cv. Doko e cv. Conquista) e ervilha (cv. Mikado e cv. Triofin) também foram analisadas quanto à reação ao BRMV-GO. Folhas das plantas infectadas foram usadas para detecção de BRMV-GO via RT-PCR. Dos 172 acessos analisados, 168 se comportaram como suscetíveis, 3 acessos: BGF0011750 (cv. Mulatinho), BGF0000880 (cv. Rico 23) e BGF0001083 (cv. Rico 23) reagiram ao BRMV-GO com necroses nas nervuras e pecíolos seguida de morte; 1 acesso, BGF0003174 cv. IPA5047, apresentou reação de hipersensibilidade. As duas espécies de indicadoras Chenopodium amaranticolor e C. quinoa reagiram com lesões locais necróticas não ocorrendo infecção sistêmica confirmada por meio de RT-PCR. As plantas de soja foram suscetíveis e todas as plantas de ervilha apresentaram queima do topo. Para a caracterização molecular, o sequenciamento completo do genoma foi realizado pelo método de Sanger usando a estratégia primer walking, as extremidades 5’ e 3’ foram obtidas pelo método RACE. Os tamanhos dos genomas foram de 5906 nucleotídeos com uma poliproteína de 1856 aminoácidos para RNA 1 e para RNA 2 foi de 3688 nucleotídeos com uma poliproteína de 1096 aminoácidos. A identidade de nucleotídeos entre os isolados BRMV-GO e BRMV-Paraná foi de 92,7 % para RNA 1 e 90,5% para RNA 2. A maior porcentagem de identidade obtida através do alinhamento de sequências de aminoácidos da polimerase (RdRp) e da proteína do capsídeo (CP) foi de 63% (RdRp) e 66% (CPs) com Bean pod mottle virus (BPMV), entretanto, o ICTV delimita para membros do gênero Comovirus uma identidade de 75% para aminoácidos (CPs) e 80% para a RdRp, no entanto, esses resultados estão de acordo com os resultados obtidos em outro trabalho com um isolado do Paraná, corroborando que BRMV é uma espécie distinta dentro do gênero. As análises filogenéticas das regiões RdRp e CPs mostraram que BRMV-GO e BRMV-Paraná não possuem diferenças significativas e revelou maiores índices de identidade com BPMV, tanto para o RNA 1 como para o RNA 2. As sequências completas do RNA 1 e RNA 2 foram depositadas no Genbank com os números de acesso KY622124, KY622125, respectivamente.
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Histologia, bioquímica e herança da resistência do genótipo de algodoeiro TX25 a Meloidogyne incognita, raça 3 / Histology, biochemistry and resistance inheritance of cotton genotype TX25 to Meloidogyne incognita, raça 3Alves, Gleina Costa Silva 31 January 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014-01-31 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Meloidogyne incognita race 3 is a limiting factor for cotton crop, and the genetic resistance is one of the most desirable control measures for being environmentally and economically suitable. The objective of this research was to study the resistance inheritance of cotton genotype TX 25 to M. incognita race 3 and identify the resistance mechanism. Two experiments for phenotyping were conducted under greenhouse conditions, using two parental genotypes (susceptible FM 966 and resistant TX 25), backcross, generation F1 and generation F2. The plants were maintained for 120 days after inoculation (DAI). Plants were evaluated for gall index, egg mass index and reproduction factor. Histopathological study was conducted and the root systems evaluated at 2, 4, 7, 9, 11, 16, 18, 21 , 23, 29, 34 and 45 DAI. The roots werestained with acid fuscin to assess the nematode penetration. Rootlet cuts were made to observe the changes caused by the presence of the nematode in the root system of susceptible and resistant cotton cultivar. Biochemical tests were also conducted with the two parental genotypes. In this essay, the plants were kept in the greenhouse and inoculated with eggs and J2 of M. incognita. Assessments occurred at eight, 24 and 35 days after inoculation. The genotypes were compared biochemically as to total phenols, flavonoids, liquid chromatography and magnetic resonance imaging. The genotype TX 25 showed resistance to M. incognita race 3 when attacked by the nematode with the plants producing a hypersensitivity reaction. The crosses derived from TX 25 and FM 966 showed olygogenic resistance. TX 25 also shows glycosylated flavonoids and sugars that provide resistance to Meloidogyne incognita race 3. / Meloidogyne incognita, raça 3 é um dos fatores limitantes da cultura do algodoeiro, e a resistência genética é uma medida de controle das mais desejáveis por ser ambientalmente preservadora e não resultar em gastos adicionais ao produtor. O objetivo da presente pesquisa foi estudar a herança da resistência do genótipo de algodão TX 25 a M. incognita, raça 3, e identificar o mecanismo de ação. Foram conduzidos dois experimentos de fenotipagem em casa de vegetação, com dois parentais, um suscetível FM 966 e um resistente TX 25, retrocruzamento, geração F1 e geração F2, onde as plantas foram mantidas por 120 dias após serem inoculadas com o nematóide. Posteriormente avaliou-se índice de galhas, índice de massa de ovos e fator de reprodução. Experimento histopatológico foi conduzido onde as raízes de algodoeiro TX 25 e FM 966 foram avaliadas aos 2, 4, 7, 9, 11, 16, 18, 21, 23 e 29, 34 e 45 dias após a inoculação, com coloração do sistema radicular com fuscina ácida para avaliar a penetração. Foram feitos cortes nas radicelas para observar as alterações causadas pela presença do nematóide no sistema radicular da cultivar suscetível e genótipo resistente. Ensaios bioquímicos com os dois parentais também foram realizados. Nesse ensaio as plantas foram mantidas em casa de vegetação e inoculadas com ovos e J2 de M. incognita. As avaliações ocorreram aos oito, 24 e 35 dias após a inoculação. Nessas avaliações os parentais foram comparados bioquimicante quanto aos fenóis totais, flavonóides, cromatografia líquida e ressonância magnética. O genótipo TX 25 apresenta resistência a M. incognita raça 3, quando incitado por esse nematóide a planta produz reação de hipersensibilidade. A geração F2 oriundas de TX 25 e FiberMax 966 apresentou uma herança de caráter provavelmente oligogênica. O genótipo TX 25 apresenta flavonóides glicolisados e açúcares, que conferem resistência a Meloidogyne incognita, raça 3. O TX 25 é um material indicado como fonte de resistência para os programas de melhoramento genético.
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Estudo da ação imunobiológica do laser de baixa intensidade sobre modelo de hipersensibilidade tardia à ovalbumina.Oliveira, Rodrigo Guerra de 30 June 2010 (has links)
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Previous issue date: 2010-06-30 / O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do Laser de Baixa Intensidade (LLLT) em um modelo de Hipersensibilidade Tardia (RHT). LLLT vem sendo estudado há algum tempo e seus efeitos clínicos, aplicados no tratamento de várias doenças. O laser tem sido testado em diferentes modelos experimentais, mas seus efeitos permanecem obscuros. Tentou-se avaliar os efeitos do LLLT na RHT à ovalbumina (OVA), uma proteína que vem sendo utilizada como antígeno para sensibilizar cobaias. Esse é um modelo amplamente utilizado para avaliar os efeitos de substâncias com potencial para modular o sistema imunológico e as reações inflamatórias. Camundongos Balb/C foram divididos, randomicamente, em quatro grupos, (I) imunizado, não tratado e desafiado (n=6), (II) não imunizado, não tratado e desafiado (n=6); (III) imunizado, tratado com Azatioprina e desafiado (n=6); e o grupo (IV), imunizado, tratado com LLLT e desafiado (n=6). Passadas 48 horas do desafio, os animais foram submetidos a avaliação do edema da pata e foram eutanasiados para análise do coxim plantar. Testes de proliferação foram realizados (espontâneos, na presença de cocanavalina A e ovalbumina) para determinar a produção, em cultura de células, de TNF- , INF- and IL-10. Análises imunohistoquímicas para expressão de COX-2 também foram realizadas. No grupo de animais irradiados com laser e naqueles tratados com AZA, a medida da espessura da pata foi significativamente menor em comparação à do grupo controle. Tal fato foi acompanhado da redução significativa na densidade do infiltrado inflamatório, assim como a redução significativa nos níveis de TNF- , INF- and IL-10 e na expressão de COX-2. Nossos resultados sugerem que o tratamento com laser possui efeito imunomodulador na RHT à OVA e podem contribuir para a imunoterapêutica do transplante renal. / The aim of this study was to evaluate the effect of Low Level Laser Therapy (LLLT) in an experimental model of delayed hypersensitivity reaction (DTH). LLLT has been studied for some time and its clinical effects have been used to treat numerous diseases. LLLT has been tested in different experimental models and some of its effects have yet to be explained. We tried to assess the effects of LLLT on the DTH reaction to ovalbumin (OVA), a protein that has been used as an antigen to sensitize lab animals. This is a broadly used experimental model to assess the effects of substances that have the potential to modulate the immune system and inflammatory reactions. Balb/C mice were randomly divided into four groups, (I) immunized, untreated and challenged (n=6), (II) not immunized, untreated and challenged (n=6); (III) immunized, treated with Azathioprine (AZA) and challenged (n=6); and group (IV) immunized, treated with LLLT and challenged (n=6). Forty-eight hours after the challenge, the animals were submitted to a paw edema check and were euthanized for histopathology analysis of their plantar pads. Proliferations tests were made (spontaneous, in the presence of concanavalin A and Ovalbumin) to determine the production in cell cultures of TNF- , INF- and IL-10. Immunohistochemical analyzes for expression of COX-2 were also performed. In the group of animals irradiated with lasers and those treated with AZA, footpad thickness measurements were significantly reduced in comparison to the control group. This was accompanied by a very significant drop in the density of the inflammatory infiltration as well as by a significant reduction in the levels of concentration of TNF- , INF- and IL-10 and in the expression of COX-2. Our results suggest that treatment with LLLT has immunomodulatory effect and may have important contribution to the immunotherapeutic of kidney transplants.
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A cisteína proteinase recombinante de Leishmania (Leishmania) chagasi (rLdccys1): alvo para diagnóstico e imunização protetora de cães em área endêmica de leishmaniose visceral, Teresina/PI / A recombinant cysteine proteinase from Leishmania (Leishmania) chagasi (rLdccys1): target for diagnosis and protective immunization of dogs in an endemic area of canine visceral leishmaniasisPinheiro, Paulo Henrique da Costa [UNIFESP] 27 February 2009 (has links) (PDF)
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Previous issue date: 2009-02-27 / Uma cisteína proteinase recombinante, rLdccys1, obtida pela expressão do gene Ldccys1 de Leishmania (Leishmania) chagasi em sistema bacteriano, foi utilizada em ensaios de imunodiagnóstico por ELISA e DTH em cães de uma região endêmica de leishmaniose visceral (LV), Teresina, Piauí. A rLdccys1 também foi utilizada para a imunização de cães e a avaliação da possível proteção dos animais imunizados contra o desafio com a L. (L.) chagasi. Os ensaios por ELISA dos soros de cães com LV mostraram que a sensibilidade para a detecção de anticorpos anti-L. (L.) chagasi utilizando a rLdccys1 e os extratos de promastigotas e amastigotas de L. (L.) chagasi foi de 98%, 86% e 89%, respectivamente. A rLdccys1 não apresentou reatividade cruzada com os soros de cães com doenças comuns nas regiões endêmicas de LV, tais como erliquiose, babesiose e doença de Chagas e a especificidade dos ensaios de ELISA utilizando-se a rLdccys1 e os extratos de amastigotas e promastigotas de L. (L.) chagasi foi de 96%, 69% e 68%, respectivamente. As respostas de DTH foram avaliadas nos cães após a injeção subcutânea da rLdccys1 ou do extrato dos amastigotas de L. (L.) chagasi. Todos os cães assintomáticos apresentaram resposta de DTH positiva à rLdccys1 com a formação de nódulos em torno de 10 mm 48 horas após a injeção do antígeno, enquanto que os cães sintomáticos não apresentaram reatividade significante à rLdccys1 nos ensaios de DTH. As respostas de DTH foram mais intensas quando se utilizou a rLdccys1 comparadas às observadas com o extrato dos parasitas. A análise histológica mostrou áreas de necrose e hemorragia nos nódulos induzidos pelo extrato dos parasitas e reação granulomatosa típica, com predomínio de células mononucleares, nos cortes dos nódulos induzidos pela rLdccys1. A análise dos dados obtidos nos ensaios de ELISA e DTH realizados com a rLdccys1 e os extratos de amastigotas de L. (L.) chagasi mostrou a correlação inversa entre as respostas humoral e celular no desencadeamento da LV canina. As respostas celulares induzidas nos cães pela rLdccys1 foram avaliadas após a imunização dos animais com o antígeno recombinante juntamente com a Propionibacterium acnes. Os linfócitos de sangue periférico dos cães imunizados com a rLdccys1 + P. acnes apresentaram significantes índices de estimulação quando reestimulados in vitro com a rLdccys1 ou o extrato dos amastigotas de L. (L.) chagasi. A dosagem de citocinas nos sobrenadantes dessas culturas mostrou a secreção de níveis significantes de IFN-γ, enquanto IL-10 não foi detectada. Nos experimentos em que cães foram imunizados com a rLdccys1 + P. acnes e desafiados com a injeção intraperitoneal de 1x104 amastigotas isolados de cão infectado com a L. (L.) chagasi 3 de 4 animais sobrevieram dez semanas após o desafio, enquanto que os animais controles que receberam PBS e a P. acnes morreram em no máximo 4 e 6 semanas, respectivamente, após o desafio. Nos cães imunizados com a rLdccys1 o número de amastigotas de L. (L.) chagasi foi significantemente reduzido no baço, fígado e medula óssea comparado ao observado nos controles. A dosagem sérica de IFN-γ nos animais imunizados com a rLdccys1 mostrou a secreção significante dessa linfocina, enquanto que níveis basais de IL-10 foram detectados. Todos os cães imunizados com a rLdccys1 e desafiados pela picada das fêmeas de Lutzomyia longipalpis sobreviveram até dezesseis semanas após o desafio e os animais controles injetados com PBS e P. acnes morreram sete e nove semanas, respectivamente, após o desafio. Os cães controles apresentaram número significante de amastigotas de L. (L.) chagasi no fígado e baço, porém nos animais imunizados com a rLdccys1 nenhum parasita foi observado. No grupo imunizado com a rLdccys1 houve aumento crescente dos níveis séricos de IFN-γ durante a imunização que atingiu um pico uma semana após o desafio, enquanto que e a concentração de IL-10 foi mantida em níveis basais. Os dados do presente trabalho mostraram o potencial da rLdccys1 de L. (L.) chagasi para o diagnóstico e a imunoprofilaxia da LV canina, abrindo perspectivas para a imunização dos cães em larga escala nas regiões endêmicas de LV e a avaliação do impacto da proteção conferida nos animais imunizados na incidência da doença. / A recombinant protein, rLdccys1, produced by expression of the gene encoding a 30 kDa cysteine proteinase from Leishmania (Leishmania) chagasi, was used to detect specific antibodies in serum by enzyme-linked immunosorbent assays and to test for reactivity in delayed-type hipersensitivity (DTH) responses of dogs from an endemic region of visceral leishmaniasis (VL), Teresina, Piauí State, Brazil. The recombinant protein was also used for immunization of dogs and evaluation of its possible protective role against L. (L.) chagasi infection. The sensitivity for detection of specific antibodies to L. (L.) chagasi using rLdccys1 and lysates from L. (L.) chagasi promastigotes and amastigotes was 96%, 68%, and 69%, respectively. No cross reactivity between rLdccys1 and Chagas disease was observed, and little reactivity was found with sera from dogs with babesiosis and ehrlichiosis. The specificity of ELISA assays using rLdccys1, lysates from L. (L.) chagasi promastigotes and amastigotes was 96%, 69%, and 68%, respectively. DTH responses were determined after subcutaneous injection of rLdccys1 or L. (L.) chagasi amastigote extract and the induration area was measured at 24, 48 and 72 h after injection. All asymptomatic dogs showed a positive intradermal response to rLdccys1 (10 mm) which peaked at 48 h, whereas no significant reactivity to the recombinant antigen was found in the symptomatic group. DTH responses to rLdccys1 were higher than those induced by amastigote extract. Histological analysis of the intradermal induration showed a predominance of necrotic and hemorrhagic areas in sections from asymptomatic dogs injected with L. (L.) chagasi amastigote extract, whereas a typical granulomatous reaction mediated by mononuclear cells was observed in sections from asymptomatic animals injected with rLdccys1. Data analysis from ELISA and DTH assays with rLdccys1 and L. (L.) chagasi amastigote extracts showed that humoral and cellular responses were inversely correlated during the development of canine VL. Cellular immune responses induced by the recombinant antigen were evaluated after immunization of dogs with rLdccys1 plus Propionibacterium acnes. Peripheral blood mononuclear cells isolated from rLdccys1-immunized dogs showed significant stimulation indexes after in vitro incubation with either rLdccy1 or L. (L.) chagasi amastigote extracts. Cytokine dosages in the supernatants from lymphocyte cultures showed significant levels of IFN-γ, whereas IL-10 was not detected. Whereas 3 from 4 dogs immunized with rLdccys1 plus P. acnes and challenged by intraperitoneal injection of 1x104 L. (L.) chagasi amastigotes survived ten weeks after challenge, control dogs which received either PBS or P. acnes died after four and six weeks, respectively. The load of L. (L.) chagasi amastigotes in spleen, liver, and bone marrow from rLdccys1-immunized dogs was significantly reduced in comparison to that of non immunized controls. A significant concentration of IFN-γ and basal levels of IL-10 were detected in sera from dogs immunized with rLdccys1. All dogs immunized with rLdccys1 plus P. acnes and challenged by the bite of L. (L.) chagas infected Lutzomyia longipalpis survived until sixteen weeks after challenge, whereas control dogs injected with PBS or P. acnes died after seven and nine weeks, respectively. Control dogs showed a significant number of L. (L.) chagasi amastigotes in liver and spleen, but no parasites were found in rLdccys1- immunized dogs. During immunization with rLdccys1 there was an increase of serum levels of IFN-γ in the immunized dogs that peaked one week after challenge. In contrast, a very low concentration of IL-10 was detected in these animals. Overall, these findings indicate that L. (L.) chagasi recombinant cysteine proteinase is potentially useful for diagnosis and immunoprophylaxis of canine VL. We believe that results obtained open perspectives for immunization of dogs in the field and evaluation of the impact on the disease incidence. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
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